一、单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法的建立与应用（论文文献综述）
朱芳茜,何扩,张秀媛,李育峰,陈一,王云峰,王硕,赵瑞平[1]（2021）在《水产品中志贺氏菌双抗夹心ELISA检测方法建立与应用》文中进行了进一步梳理志贺氏菌（Shigella）通称痢疾杆菌,是一类具有传染性强和危害严重的革兰阴性食源性致病菌,广泛污染各类动物源性食品。该研究将志贺氏菌经0.5%福尔马林溶液灭活后,多次免疫雌性大耳兔获得抗志贺氏菌多克隆抗体,以抗志贺氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记抗志贺氏菌多克隆抗体作为检测抗体,建立快速检测志贺氏菌双抗夹心酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法。结果表明:建立的双抗夹心ELISA方法检测曲线的线性范围为4.12×104 cfu/mL～3.4×106 cfu/mL,检测限为4.12×104cfu/mL;用此体系检测大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌等无交叉反应;水产品实际样品志贺氏菌检出限（limit of detection,LOD）为105 cfu/mg,具备较好的灵敏性和特异性。
谭展杭[2]（2020）在《西安市鄠邑区口蹄疫和猪瘟疫苗免疫效果评价及一起非洲猪瘟疫情报告》文中研究说明中国是一个养猪大国,也是猪肉消费大国,养猪业是我国畜牧业的支柱产业,对农业经济发展、农村产业结构调整和农民收入增加发挥着巨大作用。但是,传染病的发生与流行始终威胁着我国养猪业大发展,有组织、有计划地进行免疫接种,是预防和控制动物传染病发生流行的最重要措施之一,可以避免疫病发生,减少死亡损失,为养殖业保驾护航。口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）和猪瘟（Classic swine fever,CSF）是较为常见的猪病毒性传染病,其中FMD始终是农业农村部要求强制免疫的疫病,CSF也是2017年之前强制免疫的疫病,它们的流行给养猪业带来了巨大损失。本研究首先采集2017年～2019年陕西省西安市鄠邑区不同猪群血清样品,然后采用ELISA方法进行FMDV和CSFV疫苗免疫后抗体水平检测,以查清辖区内猪群FMDV和CSFV的疫苗免疫情况,为制定科学的防控措施提供合理的依据。与此同时,在本研究进行期间,西安市鄠邑区暴发了一起非洲猪瘟（African swine fever,ASF）流行病例,因此本研究也对此病例进行了调查。研究取得如下结果。本研究采集了来自西安市鄠邑区规模化猪场1268份接种过FMDV和CSFV疫苗的猪血清样品,ELISA检测结果显示,采集的1268份血清中,FMDV抗体阳性血清数为1004份,FMDV抗体阳性率为79.2%,其中,2017年～2019年抗体阳性率分别为83.5%、76.7%和77.3%;春季和秋季阳性率分别为79.8%和73.7%;检测的5个猪场抗体阳性率分别为81.1%、84.6%、77.9%、76.1%和75.5%;哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、母猪及后备种猪抗体阳性率分别为78.3%、71.5%、75.5%、86.6%和72.2%。采集的1268份血清中,CSFV阳性血清数为0,CSFV抗体阳性率为83.0%,其中,2017年～2019年CSFV抗体阳性率分别为89.0%、81.9%和78.0%;春季和秋季抗体阳性率分别为78.3%和87.1%;检测的5个猪场抗体阳性率分别为89.2%、88.2%、79.2%、76.9%和80.0%;哺乳仔猪、保育猪、育肥猪、母猪和后备种猪的CSFV抗体阳性率分别为82.6%、65.3%、83.5%、89.5%和82.1%。2018年11月27日,在西安市鄠邑区渭丰镇某一养殖小区发现疑似ASF病例。2018年12月2日20时,该病例经现场调查和中国动物卫生与流行病学中心检测,确诊为ASF。西安市鄠邑区人民政府立即启动重大动物疫情应急响应,划定疫点疫区,依法发布封锁令,并对疫区内的生猪采取全部扑杀掩埋及无害化处理等一系列消灭病原的处理措施。本文总结了该起非洲猪瘟疫情的发生、诊断过程,记录了病猪的临床表现,详细分析了导致该疫情发生的原因,制订并实施西安市鄠邑区人民政府对疫点疫区和受威胁区疫情控制、消毒处理办法。该起非洲猪瘟疫情的处理后经西安市农业林业委员会专家组评估验收合格,鄠邑区人民政府解除封锁非洲猪瘟疫区,最终使疫情得到控制。本研究检测接种FMDV和CSFV疫苗后血清抗体结果表明,西安市鄠邑区猪FMDV和CSFV总体抗体阳性率均超过了70%以上,符合国家强制性免疫抗体阳性率70%的标准。其中,FMDV抗体阳性率一直较高,说明疫苗免疫效果较好,而CSFV抗体阳性率自2017年～2019年逐年降低,但总体可控。研究结果对西安市鄠邑区的FMDV和CSFV疫苗防控提供了理论数据。同时,本研究总结了西安市鄠邑区一起非洲猪瘟疫情的发生、发展过程,记录了西安市鄠邑区人民政府对疫点疫区和受威胁区疫情控制、消毒处理过程,为我省乃至我国非洲猪瘟疫情的防控提供材料。
高宝[3]（2020）在《两种基于脲酶介导的猪霍乱沙门氏菌和克罗诺杆菌高灵敏免疫分析方法》文中指出传统酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA）一般基于辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）或者碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,ALP）催化底物产生比色信号实现目标物的定量检测,但是由于显色产物的摩尔消光系数小,导致该方法灵敏度偏低,同时显色产物单一的颜色也不利于裸眼检测。因此,基于等离子共振、荧光、化学发光、电化学等新型信号输出的高灵敏ELISA成为当前分析领域的研究热点。动态光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）是一种测量悬浮液中粒子的散射强度并将其转化成粒子粒径分布的新技术。由于金纳米粒子散射光随粒径的六次方呈正比,因而DLS可作为免疫分析中的一种高灵敏信号输出模式,提高免疫学检测灵敏度。食源性致病菌污染是食品安全的重大问题之一。在我国,每年食物中毒例数在20～40万人,除意外事故外,大部分由食源性致病菌引起。本研究以猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）和克罗诺杆菌（Cronobaacter）为检测对象,建立了基于等离子共振酶联免疫分析法（Plasmonic Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,pELISA）和动态光散射分析（Dynamic Light Scattering Assay）的免疫传感器,实现对目标菌的快速且高灵敏检测。pELISA方法是以脲酶（Urease）诱导棒状金纳米粒子（AuNRs）表面金属化,实现对S.choleraesuis的裸眼和定量检测。其基本原理为Urease催化尿素产生氨气,氨气在硝酸银溶液中形成氢氧化二氨合银的络合物,该络合物进一步被葡萄糖还原形成银单质,沉积在AuNR表面,形成金属化的Au@Ag核壳结构。AuNR在金属化过程中因表面银沉积厚度的不同,表现出不同的局部表面等离子共振（Localized Surface Plasmon Resonance,LSPR）,宏观上表现为颜色的差异,这种颜色上的差异可以为裸眼检测提供依据。该方法对S.choleraesuis的裸眼检测浓度为1.21 × 102 CFU/mL,经酶标仪检测LOD为1.21 × 101 CFU/mL,灵敏度较常规ELISA提高2-3个数量级。同时本研究所建立的pELISA具有良好的特异性,与其他九种食源性致病菌无明显的交叉反应;牛奶样本加标回收实验结果显示,该方法检测牛奶样品中S.choleraesuis具有良好的准确度和精密度。其次,建立了基于DLS免疫传感器高灵敏检测Cronobacter的新方法。该方法原理为脲酶催化尿素产生氨气,氨气在硝酸银溶液中形成氢氧化二氨合银的络合物,该络合物进一步被葡萄糖还原,形成以金纳米花（AuNFs）为核的AuNF@Ag核壳纳米结构。本研究利用该特性结合免疫磁分离技术实现婴儿配方奶粉中Cronobacter的高灵敏检测。在实验参数最优情况下,该方法对莫金斯克罗诺杆菌（C.muytjensii ATCC 51329）的检测线性范围为3.4×102 CFU/mL-3.4×108 CFU/mL,LOD为3.9×101 CFU/mL,检测灵敏度相比于常规ELISA提高了 3个数量级。加标回收实验结果显示,该方法的平均回收率在87.9%-107.91%之间,变异系数在2.72%-9.32%之间,表明该方法具有较高的准确性和精密度。
杨艳玲[4]（2019）在《喹乙醇免疫分析方法的研究》文中研究指明本文制备了一种能够特异性识别3-甲基喹恶啉-2-羧酸（MQCA）的多克隆抗体,并建立了检测3-甲基喹恶啉-2-羧酸的间接竞争酶联免疫分析（ELISA）方法;同时利用抗3-甲基喹恶啉-2-羧酸单克隆抗体建立了胶体金3-甲基喹恶啉-2-羧酸免疫层析试纸条方法。通过对3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原、人工免疫原的设计与合成,成功制备了高效价和特异性的MQCA多克隆抗体,并建立了一种快速检测MQCA的间接竞争酶联免疫分析方法,通过对方法反应条件的优化,确定MQCA间接竞争ELISA最佳工作条件为:包被原包被量为0.25 μg/well;抗体稀释2000倍;HRP-羊抗兔IgG酶标二抗稀释25000倍;MQCA标准品与抗体稀释液为pH 7.4 PBS缓冲溶液;封闭液为0.5%脱脂乳粉;MQCA多克隆抗体与其结构类似物均无交叉反应,特异性良好。方法灵敏度（IC50）为 20.86±0.313 μg/L;方法检测限（IC15）为 1.68±0.043 μg/L;方法的板内变异系数（CV）小于10%,板间变异系数小于15%,说明方法精密度良好:通过样品基质干扰消除实验,确定牛、猪肉样品稀释10倍即可消除基质影响;在50、200、500μg/kg三个加标水平上,ELISA方法的回收率在90%-100%,通过HPLC法进行样品的确证实验,间接竞争ELISA方法与HPLC方法,对牛、猪肉两种样品的检测结果的相关系数均为0.9999,两种方法相关性良好,方法准确度较高。通过实验利用3-甲基喹恶啉-2-羧酸单克隆抗体对包被原进行优化筛选;制备了胶体金溶液,并以胶体金为标记MQCA单克隆抗体,建立了胶体金3-甲基喹恶啉-2-羧酸免疫层析试纸条方法,通过优化建立该方法的最佳工作条件为:胶体金溶液合成时0.2 mol/LK2CO3溶液添加量为10μL;抗体添加量20 μtL;金标抗体复溶工作液体积200 μL;通过实验对MilliporeHF135与90硝酸纤维素膜进行对比,结果显示选择90硝酸纤维素膜较好;确定金标抗体上样量1.2μL;上样缓冲溶液为pH7.0 PB缓冲液;包被原与二抗稀释液为pH7.0 PB缓冲液;包被原与二抗稀释倍数分别为95倍、15倍;方法检测限为1 μg/L;牛、猪肉样品提取液进行10倍稀释即可消除基质影响;方法在牛、猪肉实际样品中的检测限为10 μg/L。
李世震[5]（2018）在《一四二团规模化猪场PRDC相关的四种病毒性疾病的流行病学调查》文中研究指明PRDC是猪呼吸道疾病综合征的缩写,是一种由多因子引起的疾病,主要是由病毒、细菌、支原体、寄生虫、不良的饲养管理条件及易感动物的免疫水平等多种综合因素相互作用引起的疾病症候群。本题通过研究石河子市一四二团11个规模化猪场4种PRDC相关的病毒病,在猪群中的免疫抗体水平、野毒感染抗体情况及病料组织中病原检测的情况,了解石河子市一四二团规模化猪场这四种病的流行特点,可进一步促进石河子市一四二团生猪规模化养殖场PRDC的防控,为顺利实现国家中长期动物疫病防控目标提供理论支持。为石河子市一四二团生猪规模化养殖场有效防控猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环病毒病提供参考依据。本题于2015年-2016年间通过对石河子市一四二团11个规模化猪场的走访调查,详细了解11个规模化猪场的建场时间,饲养情况、发病情况及死亡情况,并分别采集健康猪群5个不同年龄阶段的血清样本455份,采集患病或疑似患病猪群4个不同年龄阶段的血清样本297份,使用ELISA方法进行PRRSV、CSFV、PRV-gB/gE和PVC-2的抗体检测。采集猪群组织样本149份,使用PCR和RT-PCR的技术方法,进行PRRSV、CSFV、PRV和PVC-2这4种抗原的检测。并利用现有的PCR技术,分别设计合成PRRSV、CSFV、PRV和PCV2的特异性引物,构建多重PCR技术,通过血清学检测结果分析:健康猪群的各抗体的阳性率分别是87.25%、91.87%、47.69%、23.29%和18.9%,而患病猪群的各抗体的阳性率分别是91.25%、97.64%、58.59%、29.97%和24.92%。表明了猪繁殖与呼吸障碍综合征和猪瘟免疫抗体均达到了国家要求的水平,而猪伪狂犬免疫效果较差,一四二团使用的PRV疫苗为gE缺失苗,并且未进行PCV2的免疫,因此表明一四二团规模化猪场中伪狂犬和圆环2型病毒野毒感染情况较严重;通过对患病动物与健康动物抗体检测结果进行对比,患病动物各阶段的抗体阳性均大于健康动物,因此表明一四二团各规模场中普遍存在这四种病原的野毒感染。通过病原学检测结果分析:11个规模化猪场,有10个为PRDC阳性场,在采集的149份组织病料中检出PRDC阳性样品107份,阳性率为71.81%,其中单独或者混合感染PRRSV、CSFV、PRV和PCV-2的阳性率分别为57.05%、26.17%、34.90%和39.60%。从感染的类型上看,107份阳性样品中,仅有25份为单纯感染,占23.36%,混合感染82份,占76.64%。从混合感染的类型上看,在82份混合感染的样品中,两种病原共同侵染的组织病料48份,占58.53%,三种病原共同侵染的组织病料22份,占26.83%,上述四种病原共同存在的组织病料12份,占14.63%。从检测结果来看一四二团规模化猪场的RPDC感染情况较为严重,主要遭受病毒侵染的模式为两种病毒的共同侵染,尤其是PRRSV+PRV和PRRSV+PCV2的共同侵染。构建的PRDC相关的4中病毒病的多重PCR快速检测方法,通过特异性试验,敏感性试验和一致性试验,证实了构建的这种快速诊断方法,完全适用于与PRDC相关的PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四种病毒病的病原的快速诊断及流行病学调查。并对142团11个规模化猪场2015-2016年间采集的149份组织样品进行检测,其结果与单重PCR检测的结果一致,表明一四二团规模化猪场的PRDC感染情况较为严重,只要表现为PRRSV+PRV和PRRSV+PCV2的二重感染。通过对石河子市一四二团11个规模化猪场进行血清抗体检测、病原学检测及使用多重PCR技术进行检测,结果表明石河子市一四二团11个规模化养殖场PRRSV和CSFV的免疫抗体合格,PRV免疫抗体不合格,且四种病原存在着野毒感染的情况,且主要是PRRSV+PRV和PRRSV+PCV2的二重感染。
韩林林[6]（2014）在《重组大肠杆菌耐热肠毒素蛋白及其单克隆抗体的制备与初步应用》文中认为产肠毒素大肠杆菌（ETEC）耐热肠毒素（STa）是造成新生幼畜、发展中国家儿童和旅行者腹泻,甚至死亡的重要致病因子之一,给人类健康带来严重威胁,也给养猪业造成严重的经济损失。STa分子量小（约2Ku）,很难获得天然纯品,且天然蛋白不具有免疫原性,无法被蛋白质染色剂染色,也不能直接包被到ELISA板上,因此无法采用SDS-PAGE法和ELISA方法对其进行直接检测。常规检测方法是乳鼠灌胃试验,不仅需要特定的实验动物,而且判定方法不够灵敏。因此,表达具有免疫原的重组蛋白STa,制备抗STa单克隆抗体,对STa快速检测方法的建立及免疫抗体检测都具有重要的理论和实际意义。STa分为STh（人源）和STp（猪源或牛源）两种亚型,本研究以STp为研究对象,表达了重组蛋白STp5-His,制备了抗STp单克隆抗体,初步建立了用于检测STa的间接竞争ELISA方法。重组蛋白STp5-His和MBP-5STp的表达。将estp基因进行4次串联,分别构建estp5-his和e5stp基因片段;将estp5-his和5STp分别插入pGEX-6P-1和pMAL-c4x载体,构建重组大肠杆菌 BL21（PlySs）/pGEX-6p-1-estp5-his和 Rossetta/pMAL-c4x-e5stp,表达重组蛋白。结果显示,经IPTG诱导,分别获得了重组蛋白STp5-His（38Ku,包含体）和重组蛋白MBP-5STp（58Ku,上清）;Western blot分析证明,两种蛋白分别与His单抗和STa卵黄抗体反应。单克隆抗体的制备。用纯化重组蛋白STp5-His作为免疫原,免疫BALB/c小鼠;取免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合;用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株。结果显示,筛选出4株稳定分泌抗重组蛋白STp5-His抗体的杂交瘤细胞,分别命名为C3（MAb-C3、IgG1）、G1（MAb-G1、IgM）、F3（MAb-F3、IgG2b）、G9（MAb-G9、IgG2b）;杂交瘤细胞上清效价为1:6400～1:12800,腹水效价为1:105～1:106;Western blot证明这4种单抗均能与重组蛋白MBP-5STp发生特异性反应。竞争ELISA检测结果显示,4种单抗均能与天然STa发生明显竞争反应,而不与LT、STb、Stx2e、Stx1、Stx2等毒素发生反应,具有良好的特异性。乳鼠灌胃实验结果证明,单抗MAb-C3具有中和活性。间接竞争ELISA建立。以重组蛋白MBP-5STp作为包被抗原,用MAb-C3作为检测抗体初步建立了检测STa的间接竞争ELISA方法。结果显示,最佳抗原包被浓度为1.5mg/ml,检测抗体MAb-C3最佳稀释度为1:160,毒素最低检出量为1.5mg/ml,最佳二抗稀释倍数为1:8000,检测样品最适浓度为3～1.5 mg/ml。综上所述,本研究获得了具有免疫原性的重组蛋白STp5-His及用于单抗筛选和免疫抗体监测的重组蛋白MBP-5STp,制备了 4种能与重组蛋白STp5-His和天然STa反应的特异性单克隆抗体,初步建立了检测STa的间接竞争ELISA方法,为STa的检测、免疫抗体监测奠定了基础。
李明亮[7]（2018）在《河南部分地区PCV2流行病学调查及卵黄抗体制备》文中提出猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）中的圆环病毒属（Circovirus）,其基因组为单股环状DNA,其结构蛋白呈二十面体对称,病毒无囊膜包裹。PCV病毒主要有两个基因型,猪圆环病毒1型（Porcine circovirus type 1,PCV1）和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）,但在2016年,美国分离出一株新的圆环病毒,基因型有别于PCV1与PCV2,该新基因型的圆环病毒被称为猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type3,PCV3）[1]。但现阶段对养殖业影响最大的仍是PCV2,该病毒又细分为5个亚型,分别是PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d、PCV2e。该病毒单独感染对猪不造成严重疾病,但与其他病原交叉感染时,会加重病猪的病情,造成大量猪只死亡,给养殖业造成巨大损失。近年PCV2优势毒株不断演变,流行趋势愈加复杂。本研究采集了河南部分地区养殖场的病猪组织,利用PCR法进行多种病毒基因组检测,对于检测为PCV2阳性的病料,会进行PCV2病毒的全基因组测序,并进行病毒遗传进化分析。本研究中共检测25批病料,其中阳性病料15批,阳性率达到了60%,本研究共测得13株病毒的全基因组,其中4株为PCV2b亚型,其余均为PCV2d亚型,分析这些毒株出现时间,发现在2016年2017年9月期间,主要流行毒株为PCV2d亚型,但在2017年年末,连续出现了PCV2b亚型,所以预测PCV2优势毒株有重新向PCV2b亚型演变的趋势。卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）是指从免疫鸡（或禽类）卵黄中提取的针对特定抗原的抗体,是存在于卵黄中的最主要免疫球蛋白,具有较强的特异性,无任何毒副作用,与抗生素相比,IgY具有环境友好型、不引起不良反应、不产生毒性残留物、不引起抗药性等优点,在功能上,与哺乳动物的IgG不同,IgY不与哺乳动物的Fc受体和补体受体作用,不能激活哺乳动物的补体系统,同时,IgY也不与葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G和类风湿因子等结合,这些差异使得IgY在替代抗生素治疗、诊断和异种器官移植方面有较大的优势。本研究中还研制了特异性抗PCV2的IgY。选取8只健康产蛋鸡,随机分为2组,每组用不同的免疫程序免疫产蛋鸡。每天收集鸡蛋,每周通过翅下静脉采血,获取血清;将收集的鸡蛋通过水稀释-硫酸铵沉淀法与氯仿法两种方法分别纯化IgY,并比较两种方法的优劣。对获取的血清与纯化IgY用ELISA抗体检测试剂盒检测其抗体水平,获取抗体水平变化的数据。结果表明,两种纯化方法中,抗体的纯度接近,无明显差异,其抗体效价检测结果也没有明显区别。但是氯仿法提取的抗体,其特异性更好;两种免疫程序免疫的蛋鸡,其血清抗体的产生与持续时间没有明显的区别,在首免7 d后,几乎检测不到抗体,在第21 d时,抗体水平就以接近峰值,而IgY的效价提升滞后于血清抗体;在免疫程序结束后,IgY的效价可持续一个月不下降。
宫艳杉[8]（2017）在《山东地区死亡鸭胚中细菌分离鉴定及沙门氏菌耐药性与毒力基因检测》文中研究指明沙门氏菌是一种重要的食源性致病菌,具有广泛的宿主性,作为人畜共患病其成为危害养殖业发展最为严重的病原菌之一,尤其在种鸭养殖过程中沙门氏菌可以通过种蛋垂直传播。自2014年至2016年,山东规模化种鸭孵化场的胚胎死亡率和弱雏率明显升高,并且死亡鸭胚的类型以臭蛋为主,初步怀疑是大面积细菌感染所致。由于抗菌药物在畜禽疾病防治中的大量使用,使得沙门氏菌对抗生素的耐药率不断上升,特别是多重耐药现象的不断出现,给沙门氏菌病的有效防治带来了困难。本实验旨在研究死亡鸭胚中病原菌的感染状况,以探究鸭胚在孵化过程中死亡原因;通过药敏试验和耐药基因检测,初步掌握鸭源沙门氏菌在山东的耐药情况,探究耐药情况与临床常用抗菌药的相互关系,为指导生产中种鸭的合理用药提供理论依据;分析鸭源沙门氏菌毒力基因,对沙门氏菌致病性影响,研发安全有效的疫苗奠定基础。本研究共分四部分。1.死亡鸭胚中细菌的分离鉴定通过对无破损的死亡鸭胚进行细菌分离培养、形态染色、16SrDNA鉴定等方法,从12个批次,315枚鸭胚中共分得细菌282株,分属26个种,其中245枚存在细菌感染,感染率为77.8%。在分离的所有细菌中,大肠杆菌、沙门氏菌和奇异变形杆菌分别占38.30%（108/282）、26.24%（74/282）和8.16%（23/282）,是死亡鸭胚中的主要致病菌群。结果表明,造成种鸭孵化场胚胎死亡率和弱雏率明显升高的主要原因是细菌感染所致,且沙门氏菌是主要的致病菌之一。2.鸭源沙门氏菌耐药性调查采用K-B法对74株鸭源沙门氏菌进行17种抗生素（氨基糖苷类药物、喹诺酮类药物、β-内酰胺类药物等）的耐药性检测。结果显示,74株沙门氏菌对17种抗生素表现出不同程度的耐药:β-内酰胺类药物的耐药性较高,氨苄西林耐药率31.08%,头孢噻吩耐药率29.73%;氨基糖苷类药物中庆大霉素的耐药率最高占22.97%,其次是链霉素9.46%和卡那霉素2.70%;喹诺酮类药物耐药率较低,环丙沙星和诺氟沙星耐药率均为4.05%,氧氟沙星耐药率为2.70%;四环素和氯霉素类药物耐药率均较低分别为5.41%和4.05%。在分离的74株沙门氏菌中两种药物以上多重耐药菌株的耐药率占78.37%。该项研究调查表明,在治疗和预防山东地区种鸭孵化场致病性细菌感染时可以选择性配合使用喹诺酮类药物和卡那霉素,在选择使用喹诺酮类药物时,要按照生产具体情况和药物使用说明书严格控制剂量。3.鸭源沙门氏菌耐药基因的检测与鉴定对鉴定的74株沙门氏菌进行氨基糖苷类钝化酶基因三重PCR检测,该74株沙门中有13株扩增出ant（3’’）-Ia、aac（6’）-Ib、aph（3’）-IIa的特异性条带,三重基因携带率17.56%,16S甲基化酶基因未检出;喹诺酮类耐药菌株PCR扩增结果表明,qnrS基因携带率14.85%,oqxA基因携带率9.46%,oqxB基因携带率2.70%,qnrA、qnrB、qnrC和qnrD基因未检出;β-内酰胺类耐药基因TEM基因携带率27.03%。本研究结果表明氨基糖苷类钝化酶基因、喹诺酮基因和β-内酰胺基因广泛存在于鸭源沙门氏菌中,其耐药性与检测的耐药基因符合率存在差异不呈显着的相关性。4.鸭源沙门氏菌毒力基因的检测与鉴定对鉴定的74株沙门氏菌进行8种毒力基因PCR检测,SPI-1、SPI-3、SPI-4、SPI-5、stn和invJ的检出率分别是81.19%、94.59%、94.59%、79.73%、100%和66.22%。SPI-2和fim未检出。74株沙门氏菌中,仅携带2种毒力基因菌株占所有菌株的2.7%,5种毒力基因与6种毒力基因菌株分别占所有菌株的31.06%和56.76%。本研究结果表明,山东地区鸭胚中沙门氏菌分离株普遍携带有多种毒力岛核心蛋白基因,这可能是导致孵化过程中鸭胚死亡的原因之一,而沙门氏菌毒力基因与致病性的关系有待于进一步研究。
陈健皓[9]（2017）在《沙门氏菌快速检测方法的筛选与应用和鸡源、猪源菌株MLST分子溯源及耐药性研究》文中指出沙门氏菌是世界范围内人和动物的重要病原菌。动物源性食品是人感染沙门氏菌的主要来源,而鸡和猪是国内最重要的动物源食品。因此,了解鸡、猪饲养过程及食品加工过程中的沙门氏菌污染情况,对控制沙门氏菌的传播、降低食品安全隐患有着重要的意义。为了缩短检测时间,也为临床诊断提供依据,经筛选、优化制定了快速检测沙门氏菌的PCR方法。应用所建立的方法对收集的临床样品进行筛查和沙门氏菌分离鉴定,对沙门氏菌分离菌株进行血清学鉴定、耐药性表型及基因型分析以及MLST分子溯源研究,以阐明不同来源沙门氏菌菌株的内在关系,为沙门氏菌病的防控提供依据。一、沙门氏菌快速检测方法筛选与优化本方法基于国家标准《GB4789.4-2010食品微生物学检验沙门氏菌检验》的常规方法,为缩短检测时间,并且根据动物源样本自身的特点,筛选并优化了增菌方法,制定了快速检测沙门氏菌的PCR方法,将沙门氏菌常规分离、鉴定方法中增菌的时间缩短至4～6 h,将原本2～3天的鉴定时间缩短到1天之内,达到快速检测沙门氏菌的目的。二、鸡源、猪源沙门氏菌MLST分子溯源及耐药性研究对从江苏地区鸡源及猪源样品中分离获得的134株沙门氏菌,进行血清学分型和14种临床常用药物敏感试验（包括氨苄青霉素、阿莫西林、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢曲松、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、萘啶酸、环丙沙星、四环素）;另外,对沙门氏菌耐药基因岛（SGI）中主要的耐药基因（包括β-内酰胺酶基因、sull、aacC4、aac（6’）-1b、floR等）进行检测,通过多位点序列分型（MLST）进行分子溯源分析,研究鸡源、猪源沙门氏菌耐药表型、基因型及传播特征。134株沙门氏菌分为4个血清型:肠炎沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。健康鸡群分离株为肠炎沙门氏菌（36株）和印第安纳沙门氏菌（40株）,健康猪群分离株为德尔卑沙门氏菌（14株）和印第安纳沙门氏菌（2株）。从扬州大学兽医院收集的病禽样品中沙门氏菌为肠炎沙门氏菌（31株）、印第安纳沙门氏菌（6株）和鸡白痢沙门氏菌（5株）。MLST分型结果表明,134株沙门氏菌可以分为6个ST型:ST11、ST17、ST92、ST40、ST64及ST155。肠炎沙门氏菌为ST11型,印第安纳沙门氏菌为ST17型,鸡白痢沙门氏菌为ST92型,德尔卑沙门氏菌分别为ST40、ST64及ST155。在所有沙门氏菌分离菌株中,对萘啶酸、氨苄青霉素、四环素和头孢哌酮的耐药性较高,分别达到92.5%、80.7%、72.5%和65.1%;其中肠炎沙门氏菌对萘啶酸、氨苄青霉素、四环素和头孢哌酮的耐药性较高,分别达到94.2%、89.8%、62.3%和57.9%;猪源德尔卑沙门氏菌对四环素、萘啶酸、磺胺甲嗯唑和氯霉素的耐药性较高,分别达到100%、94.7%、68.4%和57.8%;印第安那沙门氏菌在14种抗生素中,对11种抗生素耐药达到75%以上,且对所有的14种抗生素耐药达50%以上。48株印第安纳沙门氏菌共产生27种耐药谱,其中41个菌株对9种以上的抗生素耐药,此外,有7个菌株对所有抗生素耐药;67株肠炎沙门氏菌共产生20种耐药谱,有2株对9种以上的药物耐药,部分菌株形成较固定的耐药谱,AMP-NA-TE、AMP-CFP-NA、AMP-CFP-NA-TE;14株德尔卑沙门氏菌产生13种耐药谱,对四环素、萘啶酸、磺胺甲嗯唑和氯霉素的耐药性较高,有2株对9种以上耐药。对134株沙门氏菌进行11个耐药基因的检测,blaTEM-1-like、blaCTX-M、blaOXA-1-like、sull、aacC4、aac6-lb、floR、tet（G）检出率分别 73.1%、37.3%、29.1%、34.3%、32.8%、32.1%、36.6%、24.6%;blaCMY-2、blaPSE及blaSHV均未检出。对9种以上的药物超级耐药的印第安纳沙门氏菌,对β-内酰胺酶基因blaOXA-1-like、blaCTX-M、blaTEM-1-like 及 floR、aadA2、sull 及 aac（6’）-1b有较高携带率,这是其成为超级耐药克隆的主要原因:肠炎沙门氏菌主要表现为对氨苄青霉素、萘啶酸、四环素、头孢哌酮中等程度耐药,且多数为多重耐药,其blaTEM-1-like携带率最高。因此,控制并严格规范相关药物在动物饲养过程中的应用,对阻止动物临床及人类临床多重耐药细菌的产生有着重大的意义。
曹恭貌[10]（2017）在《猪流行性腹泻病毒、Delta冠状病毒和传染性胃肠炎病毒三重RT-PCR检测方法的建立及初步应用》文中提出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）均能引起猪只出现水样腹泻、呕吐、脱水、食欲不振和精神萎靡等主要临床症状。可见于各年龄段猪群,尤以仔猪感染发病最为严重,并呈现出一定季节性。猪Delta冠状病毒（Porcine deltacorona virus,PdCV）也是近年来新发现的一种感染宿主消化道引起呕吐、水样腹泻和严重脱水等病症的冠状病毒科新成员。2009年该病毒首次在香港猪腹泻粪便中检出。2014年在美国部分市州被鉴别发现后,迅速蔓延至美国其他市州和加拿大等地区。近年来我国多地养殖场腹泻病例中均有PdCV检出,有报道称PdCV流行范围正在逐步扩大,严重影响养猪业。由于PEDV、PdCV和TGEV感染导致病猪出现相似的临床症状,又常呈现混合感染,这给病原的鉴别诊断带来困难。对此本文进行了PEDV、PdCV和TGEV三重RT-PCR检测方法的研究。本研究根据GenBank中PEDV、PdCV和TGEV M、N和S基因保守区合成3对引物,建立3种病原单项RT-PCR方法并合理优化引物浓度和退火温度。同时基于单项RT-PCR方法的前提,在同一反应体中进行PCR扩增,再分别对引物浓度、退火温度、敏感性、特异性和重复性等条件进行优化,成功建立出能同时检测3种病原的三重RT-PCR方法。经优化后的引物浓度分别是PEDV 10pmol/L、PdCV 10 pmol/L和TGEV 20 pmol/L,同时退火温度为53°C时扩增效果最佳。最低检测浓度分别为PEDV 60.96 pg/反应（8.16×103拷贝/反应）、PdCV58.85pg/反应（1.14×104拷贝/反应）和TGEV 102.69 pg/反应（4.32×104拷贝/反应）。同时用上述建立的三重RT-PCR方法检测猪博卡病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪萨佩罗病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪A群轮状病毒、猪大肠杆菌和猪沙门氏菌等都未出现特异性扩增条带。对分别放置1 d、15 d、30 d和60 d的阳性样本同时进行检测,重复试验4次,结果相同。上述成果说明,建立的三重RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性和稳定性。利用建立好的PEDV、PdCV和TGEV三重RT-PCR方法对2015年10月2016年3月来自四川省和重庆市13个地区21个中小型规模化猪场的196份样品进行检测。实验结果表明,176份腹泻样品中PEDV 57.4%、PdCV 2.8%和TGEV 2.3%,其中PEDV和PdCV混合感染病料3份,阳性检出率为1.7%,结果表明PEDV阳性检出率较高,说明西南地区主要以PEDV感染猪发病。20份健康样品中PEDV和PdCV各1份,阳性检出率为5.0%,未检出阳性TGEV,也没有检出混合感染,说明健康猪存在PEDV和PdCV的隐性感染。另外,三重RT-PCR与单项RT-PCR方法阳性符合率分别为PEDV95.3%、PdCV 100%和TGEV 100%,具有较高可信度,可作为PEDV、PdCV和TGEV鉴别诊断的检测方法。由此可见,本试验建立的PEDV、PdCV和TGEV三重RT-PCR方法可在同一个反应体中完成对该3种猪病毒性腹泻病原的鉴别诊断。为PEDV、PdCV和TGEV 3种病原的实验室检测和流行病学调查提供有效参考和技术支持,同时也对我国西南部分地区猪场该3种病原的流行趋势进行统计分析,为地区猪肠道疾病的防控和监测提供重要依据。
二、单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法的建立与应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法的建立与应用（论文提纲范文）
（1）水产品中志贺氏菌双抗夹心ELISA检测方法建立与应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 免疫原制备 |
| 1.3.2 抗志贺氏菌多克隆抗体制备 |
| 1.3.3 酶标抗体制备 |
| 1.3.4 双抗夹心ELISA检测方法的建立 |
| 1.3.5 双抗夹心ELISA检测志贺氏菌的特异性 |
| 1.3.6 人工接种扇贝的检测 |
| 1.4 数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 志贺氏菌多克隆抗血清效价的测定 |
| 2.2抗体纯化与检测 |
| 2.3 双抗夹心体系 |
| 2.4 双抗夹心体系标准曲线建立 |
| 2.5 双抗夹心体系的特异性 |
| 2.6 扇贝样品人工接种志贺氏菌检测 |
| 3 结论 |
（2）西安市鄠邑区口蹄疫和猪瘟疫苗免疫效果评价及一起非洲猪瘟疫情报告（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 口蹄疫和猪瘟疫苗免疫概述及非洲猪瘟防控现状 |
| 1.1 口蹄疫疫苗免疫概述 |
| 1.2 猪瘟疫苗免疫概述 |
| 1.3 非洲猪瘟流行及防控现状 |
| 1.3.1 非洲猪瘟流行情况 |
| 1.3.2 非洲猪瘟防控现状 |
| 1.4 本研究目的意义 |
| 第二章 西安市鄠邑区口蹄疫和猪瘟疫苗免疫效果评价 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 检测样品 |
| 2.1.2 检测试剂盒 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 抗体检测 |
| 2.2.1 FMDV抗体检测 |
| 2.2.2 CSFV抗原及抗体检测 |
| 2.2.3 离散度计算 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 猪FMDV抗体检测 |
| 2.3.2 CSFV抗体检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 西安市鄠邑区一起非洲猪瘟疫情报告 |
| 3.1 调查内容 |
| 3.1.1 调查范围 |
| 3.1.2 调查方法 |
| 3.1.3 数据分析 |
| 3.2 结果及分析 |
| 3.2.1 猪场概况 |
| 3.2.2 人员流动及调运情况 |
| 3.2.3 发病情况 |
| 3.2.4 临床症状与病理剖检 |
| 3.2.5 实验室检测 |
| 3.2.6 病因假设与分析 |
| 3.2.7 疫情应急处置 |
| 3.2.8 解除封锁 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）两种基于脲酶介导的猪霍乱沙门氏菌和克罗诺杆菌高灵敏免疫分析方法（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 酶联免疫吸附法 |
| 1.1.1 荧光酶联免疫吸附法 |
| 1.1.2 化学发光酶联免疫吸附法 |
| 1.1.3 电化学酶联免疫吸附法 |
| 1.1.4 等离子共振酶联免疫吸附法 |
| 1.2 动态光散射 |
| 1.3 猪霍乱沙门氏菌及其免疫学方法研究进展 |
| 1.3.1 猪霍乱沙门氏菌简介 |
| 1.3.2 猪霍乱沙门氏菌免疫学检测方法研究进展 |
| 1.4 克罗诺杆菌及其免疫学方法研究进展 |
| 1.4.1 克罗诺杆菌简介 |
| 1.4.2 克罗诺杆菌免疫学方法研究进展 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 基于等离子体共振ELISA高灵敏检测牛奶中猪霍乱沙门氏菌 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 食源性致病菌的培养 |
| 2.3.2 PSS稳定金棒的合成与表征 |
| 2.3.3 pELISA方法的可行性验证 |
| 2.3.4 生物素化单克隆抗体(Biotin@dAbs)和生物素化脲酶(Biotin@Urease)的合成 |
| 2.3.4.1 Biotin@dAbs的制备 |
| 2.3.4.2 Biotin@Urease的制备 |
| 2.3.5 建立等离子体共振ELISA方法检测S.choleraesuis |
| 2.3.6 检测牛奶样本中的S.choleraesuis |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 PSS作为配体AuNR的表征 |
| 2.4.2 pELISA可行性验证 |
| 2.4.3 实验参数的优化 |
| 2.4.3.1 棋盘滴定法优化抗体(cAbs和Biotin@dAbs)用量 |
| 2.4.3.2 SA、Biotin@Urease、尿素和酶催化反应时间的优化 |
| 2.4.3.3 显色体系的参数优化 |
| 2.4.4 pELISA对S.choleraesuis的检测灵敏度 |
| 2.4.5 pELISA的特异性验证 |
| 2.4.6 加标回收 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 基于DLS免疫传感器高灵敏检测婴儿配方奶粉中的克罗诺杆菌 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要试剂与材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 食源性致病菌的培养 |
| 3.3.2 金纳米花的合成与表征 |
| 3.3.3 基于DLS分析的可行性验证 |
| 3.3.4 磁标抗体(MB@cAbs)、生物素化抗体(Biotin@dAbs)和生物素化脲酶(Biotin@Urease)的制备 |
| 3.3.4.1 磁标抗体(MB@cAbs)的制备 |
| 3.3.4.2 生物素化抗体(Biotin@dAbs)的制备 |
| 3.3.4.3 生物素化脲酶(Biotin@Urease)的制备 |
| 3.3.5 基于DLS免疫传感器检测C.muytjensii的建立 |
| 3.3.6 婴儿奶粉中的C.muytjensii的检测 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 三种粒径AuNFs的表征 |
| 3.4.2 可行性分析 |
| 3.4.3 实验参数的优化 |
| 3.4.3.1 免疫学参数的优化 |
| 3.4.3.2 其他参数的优化 |
| 3.4.4 构建DLS免疫传感器检测C.muytjensii的标准曲线 |
| 3.4.5 DLS免疫传感器方法特异性验证 |
| 3.4.6 加标回收 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.1.1 基于pELISA检测牛奶中S.choleraesuis |
| 4.1.2 基于DLS免疫传感器检测婴儿配方奶粉中的克罗诺杆菌 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 试剂材料 |
| 附录2 仪器设备 |
| 个人介绍 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（4）喹乙醇免疫分析方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 喹乙醇及其代谢物概述 |
| 1.2.1 喹乙醇的理化性质 |
| 1.2.2 喹乙醇的应用发展 |
| 1.2.3 喹乙醇的危害 |
| 1.2.4 喹乙醇的吸收和代谢 |
| 1.2.5 喹乙醇代谢物3-甲基喹恶啉-2-羧酸理化性质 |
| 1.2.6 喹乙醇代谢物3-甲基喹恶啉-2-羧酸毒副作用 |
| 1.2.7 残留限量标准 |
| 1.3 喹乙醇代谢物3-甲基喹恶啉-2-羧酸检测研究现状 |
| 1.3.1 仪器检测技术 |
| 1.3.2 免疫分析技术 |
| 1.3.3 免疫检测技术发展趋势 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器及材料 |
| 2.1.3 主要药品和试剂 |
| 2.1.4 实验溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原的制备 |
| 2.2.2 3-甲基喹恶啉-2-羧酸免疫原的制备 |
| 2.2.3 3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备 |
| 2.2.4 3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的纯化 |
| 2.2.5 3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体间接竞争ELISA方法的建立 |
| 2.2.6 MQCA多克隆抗体间接竞争ELISA方法性能指标的评价 |
| 2.2.7 实际样品检测及添加回收实验 |
| 2.2.8 仪器分析法确证 |
| 2.2.9 3-甲基喹恶啉-2-羧酸单克隆抗体对包被原的优化筛选 |
| 2.2.10 胶体金标记抗体的制备 |
| 2.2.11 胶体金免疫层析试纸条的组装 |
| 2.2.12 胶体金免疫层析试纸条的检测原理与结果判定 |
| 2.2.13 胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原的合成与鉴定 |
| 3.1.1 3-(羧基甲氧基)喹恶啉-2-羧酸的合成与鉴定 |
| 3.1.2 4-(3-甲基喹啉-2-酰胺)丁酸的合成与鉴定 |
| 3.2 3-甲基喹恶啉-2-羧酸免疫原的制备与鉴定 |
| 3.3 3-甲基喹恶啉-2-羧酸抗体的制备及间接竞争ELISA方法的建立 |
| 3.3.1 3-甲基喹恶啉-2-羧酸抗血清效价和抑制率的测定 |
| 3.3.2 3-甲基喹恶啉-2-羧酸抗体的纯化和抗体浓度的确定 |
| 3.3.3 3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体间接竞争ELISA的建立 |
| 3.4 3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体间接竞争ELISA方法性能指标的评价 |
| 3.4.1 检出限与灵敏度 |
| 3.4.2 精密度 |
| 3.4.3 实际样品检测及添加回收 |
| 3.4.4 仪器方法确证 |
| 3.5 MQCA单克隆抗体对包被原的优化与筛选 |
| 3.6 胶体金标记抗体的制备 |
| 3.6.1 胶体金质量鉴定 |
| 3.7 胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立 |
| 3.7.1 胶体金免疫层析试纸条各参数优化 |
| 3.7.2 检测限的确定 |
| 3.7.3 胶体金标记MQCA免疫层析试纸条的特异性实验 |
| 3.7.4 胶体金标记MQCA免疫层析试纸条稳定性评价 |
| 3.7.5 样品提取液稀释倍数的优化 |
| 3.7.6 胶体金标记MQCA免疫层析试纸条检测实际样品检测限的确定 |
| 4 结论 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 论文的创新点 |
| 4.3 论文的不足之处 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 研究生期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（5）一四二团规模化猪场PRDC相关的四种病毒性疾病的流行病学调查（论文提纲范文）
| 中英文对照缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.猪呼吸道疾病综合征概述 |
| 2.PRDC的主要病原 |
| 2.1 PRRSV |
| 2.1.1 PRRSV病原学特征 |
| 2.1.2 流行病学 |
| 2.1.3 发病机理 |
| 2.1.4 发病类型和临床症状 |
| 2.1.5 病理变化 |
| 2.2 猪瘟病毒 |
| 2.2.1 猪瘟病原学特性 |
| 2.2.2 流行病学 |
| 2.2.3 发病机理 |
| 2.2.4 发病类型和临床症状 |
| 2.2.5 病理变化 |
| 2.3 伪狂犬病毒 |
| 2.3.1 PRV病原学特性 |
| 2.3.2 流行病学 |
| 2.3.3 发病机理 |
| 2.3.4 发病类型和临床症状 |
| 2.3.5 病理变化 |
| 2.4 圆环病毒2型 |
| 2.4.1 圆环病原学特性 |
| 2.4.2 流行病学 |
| 3.动物疫病诊断 |
| 3.1 病原学检测方法 |
| 3.1.1 动物接种试验 |
| 3.1.2 病毒的分离与鉴定 |
| 3.1.3 标记抗体技术 |
| 3.1.4 分子生物学检测技术 |
| 3.2 血清学检测方法 |
| 3.2.1 酶联免疫吸附试验 |
| 3.2.2 病毒抗体胶体金免疫检测技术 |
| 4.研究的目的及意义 |
| 第二章 PRDC相关的四种病毒病的免疫抗体检测 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验场地 |
| 1.1.2 实验动物分群 |
| 1.1.3 血清样品采集 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 现场调查 |
| 1.2.2 样品处理 |
| 1.2.3 实验操作 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 健康猪群与亚健康猪群血清检测结果 |
| 2.2 各年龄阶段猪血清学检测结果 |
| 2.3 各规模化猪场血清流行病学调查 |
| 3.讨论 |
| 3.1 PRDC的发病与环境条件及饲养密度有关 |
| 3.2 血清免疫抗体分析 |
| 3.3 血清野毒抗体分析 |
| 3.4 不同年龄段血清抗体分析 |
| 3.5 健康猪群与患病猪群间抗体阳性对比分析 |
| 4.小结 |
| 第三章 PRDC相关的四种病毒病的病原学检测 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PRRSV通用型RT-PCR检测 |
| 1.2.2 CSFV通用型RT-PCR检测 |
| 1.2.3 PRV病原PCR检测 |
| 1.2.4 PCV2PCR检测 |
| 2.结果及分析 |
| 2.1 PRDC相关四种病毒病病原检测结果 |
| 2.2 混合感染情况 |
| 3.讨论 |
| 3.1 四种病原的感染情况 |
| 3.2 各病原的感染情况 |
| 4.小结 |
| 第四章 PRDC四种病毒病的多重PCR快速检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 相关试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 主要试剂的制备 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 样品DNA和总RNA的提取 |
| 1.2.4 PCR反应条件的选择 |
| 1.2.5 敏感性试验 |
| 1.2.6 特异性试验 |
| 1.2.7 重复性试验 |
| 1.2.8 一致性试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 敏感性试验结果 |
| 2.2 特异性试验结果 |
| 2.3 重复性试验结果 |
| 2.4 临床样本检测比较结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 特异性试验 |
| 3.2 敏感性试验 |
| 3.3 利用的多重PCR进行病原检测 |
| 4.小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（6）重组大肠杆菌耐热肠毒素蛋白及其单克隆抗体的制备与初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的概述 |
| 1.1.1 黏附素 |
| 1.1.2 肠毒素 |
| 1.1.3 产志贺毒素大肠杆菌 |
| 1.2 耐热肠毒素(ST) |
| 1.2.1 STa的一般生物学特性 |
| 1.2.2 STb的一般生物学特性 |
| 1.3 STa研究进展 |
| 1.3.1 STa免疫原性的研究 |
| 1.3.2 STa检测方法 |
| 1.3.3 ST分子生物学方面研究 |
| 1.4 STa单克隆抗体研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种、质粒、细胞系和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 耐热肠毒素STp基因的合成 |
| 2.2.2 串联基因构建 |
| 2.2.3 表达载体的构建、诱导表达及鉴定 |
| 2.2.4 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.5 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.6 天然STa的粗提 |
| 2.2.7 杂交瘤细胞的鉴定 |
| 2.2.8 单克隆抗体鉴定 |
| 2.2.9 竞争ELISA检测方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 串联基因STp5-His构建及鉴定 |
| 3.2 表达载体的构建、诱导表达及鉴定 |
| 3.2.1 表达载体STp5-His构建及酶切鉴定 |
| 3.2.2 重组蛋白STp5-His诱导表达 |
| 3.2.3 重组蛋白STp5-His Western blot鉴定 |
| 3.2.4 重组蛋白STp5-His纯化 |
| 3.2.5 重组蛋白MBP-5STp表达与鉴定 |
| 3.2.6 重组蛋白MBP-5STp纯化 |
| 3.3 天然STa粗提 |
| 3.4 细胞融合与筛选 |
| 3.4.1 ELISA方法建立 |
| 3.4.2 脾细胞与SP2/0细胞融合 |
| 3.4.3 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.5 杂交瘤细胞的鉴定 |
| 3.5.1 杂交瘤细胞染色体分析 |
| 3.5.2 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性鉴定 |
| 3.6 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.6.1 抗体效价测定及单抗亚类鉴定 |
| 3.6.2 单克隆抗体Western blot鉴定 |
| 3.6.3 单克隆抗体与天然STa反应性鉴定 |
| 3.6.4 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.6.5 STa毒素中和试验 |
| 3.6.6 单克隆抗体抗原表位初步分析结果 |
| 3.7 竞争ELISA建立 |
| 3.7.1 最佳抗原包被浓度与一抗稀释倍数的确定 |
| 3.7.2 最佳二抗(HRP标记的山羊抗小鼠IgG)稀释倍数的确定 |
| 3.7.3 毒素最低检出量测定 |
| 3.7.4 竞争ELISA特异性鉴定 |
| 3.7.5 重复性和稳定性鉴定 |
| 3.7.6 竞争ELISA初步应用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫原的制备问题 |
| 4.2 免疫周期研究 |
| 4.3 细胞融合及筛选 |
| 4.4 单克隆抗体抗原表位的初步分析 |
| 4.5 重组蛋白的应用 |
| 4.6 单克隆抗体的应用 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（7）河南部分地区PCV2流行病学调查及卵黄抗体制备（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 PCV研究进展 |
| 1 PCV2的病原学 |
| 1.1 猪圆环病毒的发现及分类 |
| 1.2 猪圆环病毒2型的理化性质 |
| 1.3 猪圆环病毒2型病毒的传染性 |
| 1.4 猪圆环病毒的分子生物学特征 |
| 1.4.1 猪圆环病毒基因组结构 |
| 1.4.2 猪圆环病毒2型基因组编码的蛋白 |
| 1.4.3 猪圆环病毒2型的致病机理 |
| 2 PCV2引起的相关疾病 |
| 2.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征 |
| 2.2 猪皮炎肾病综合征 |
| 2.3 猪呼吸道疾病综合征 |
| 2.4 繁殖障碍 |
| 2.5 仔猪先天性震颤 |
| 3 诊断方法 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 病理学检查 |
| 3.3 病原学和血清学检查 |
| 3.3.1 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 3.3.2 免疫组织化学方法技术 |
| 3.3.3 聚合酶链式反应 |
| 3.3.4 原位杂交 |
| 3.3.5 酶联免疫吸附试验 |
| 4 PCV2疫苗研究现状 |
| 第二章 IgY综述 |
| 1 IgY的发现与优势 |
| 1.1 IgY的发现 |
| 1.2 IgY的优势 |
| 2 IgY的应用 |
| 2.1 IgY在人类疾病防治中的应用 |
| 2.2 IgY在禽病防治中的应用 |
| 2.2.1 新城疫 |
| 2.2.2 传染性法氏囊病 |
| 2.2.3 禽流感 |
| 2.2.4 小鹅瘟 |
| 2.2.5 鸭肝炎 |
| 2.2.6 鸭坦布苏病毒 |
| 2.3 IgY在猪病防治中的应用 |
| 2.3.1 大肠杆菌 |
| 2.3.2 沙门氏菌 |
| 2.3.3 猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻 |
| 2.3.5 轮状病毒 |
| 2.3.6 猪圆环病毒2型 |
| 2.3.7 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 2.3.8 猪瘟 |
| 3 IgY的提取纯化方法 |
| 3.1 聚乙二醇6000沉淀法 |
| 3.2 硫酸葡聚糖沉淀法 |
| 3.3 氯仿法 |
| 3.4 有机溶剂法 |
| 3.5 水稀释法 |
| 3.6 表面活性剂法 |
| 3.7 辛酸法 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 CV2全基因组测序及分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器设备 |
| 2.2 主要试剂及配置方法 |
| 2.3 引物设计及合成 |
| 2.4 病毒核酸纯化 |
| 2.5 检测收集的病料 |
| 2.6 PCV2基因组测序 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 部分病料检测结果 |
| 3.2 PCV2全基因组扩增结果 |
| 3.3 阳性菌株鉴定 |
| 3.4 PCV2全基因组同源性分析 |
| 3.5 PCV2ORF1序列及编码蛋白分析 |
| 3.6 PCV2ORF2序列及编码蛋白分析 |
| 3.7 PCV2的遗传进化分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 PCV2特异性IgY的研制 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 常用试剂的配置 |
| 2.2 蛋鸡的饲养与免疫 |
| 2.3 鸡蛋的收集及血清采集 |
| 2.4 血清抗体的制备 |
| 2.5 IgY的制备 |
| 2.6 IgY纯度检测 |
| 2.7 两种方法纯化样品的抗体水平检测 |
| 2.8 不同免疫方案中血清抗体变化规律 |
| 2.9 不同免疫方案中IgY变化规律 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗体纯化效果 |
| 3.2 纯化方法对抗体水平的影响 |
| 3.3 血清抗体与IgY变化规律 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
（8）山东地区死亡鸭胚中细菌分离鉴定及沙门氏菌耐药性与毒力基因检测（论文提纲范文）
| 符号及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 沙门氏菌病原学特征 |
| 1.1.1 形态特性及理化特性 |
| 1.1.2 抗原结构及血清型 |
| 1.1.3 致病性 |
| 1.1.4 流行概况 |
| 1.1.5 流行病学 |
| 1.1.6 临床症状及病理变化 |
| 1.2 沙门氏菌的耐药性 |
| 1.2.1 沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素的耐药机制 |
| 1.2.2 沙门氏菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制 |
| 1.2.3 沙门氏菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制 |
| 1.2.4 沙门氏菌对四环素类抗生素的耐药机制 |
| 1.2.5 沙门氏菌对磺胺类抗生素的耐药机制 |
| 1.3 沙门氏菌的毒力基因 |
| 1.3.1 毒力岛 |
| 1.3.2 肠毒素 |
| 1.3.3 菌毛 |
| 1.4 沙门氏菌检测方法研究 |
| 1.4.1 常规标准检测方法 |
| 1.4.2 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4.3 聚合酶链式反应 |
| 1.4.4 荧光定量PCR检测 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 分子生物学试剂 |
| 2.1.4 实验仪器设备 |
| 2.1.5 引物合成 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 死亡鸭胚中细菌的分离鉴定 |
| 2.2.2 沙门氏菌药敏试验 |
| 2.2.3 氨基糖苷类钝化酶基因及 16S甲基化酶基因检测与鉴定 |
| 2.2.4 喹诺酮类耐药基因检测与鉴定 |
| 2.2.5 β-内酰胺耐药基因检测与鉴定 |
| 2.2.6 沙门氏菌毒力基因检测与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 死亡鸭胚中细菌的分离鉴定结果 |
| 3.1.1 革兰氏染色结果 |
| 3.1.2 PCR扩增结果 |
| 3.1.3 重组质粒鉴定结果 |
| 3.1.4 16S rDNA测序结果 |
| 3.1.5 沙门氏菌SS培养基培养特性 |
| 3.2 沙门氏菌药敏试验结果 |
| 3.2.1 细菌药敏试验结果 |
| 3.2.2 沙门氏菌药敏试验统计结果 |
| 3.2.3 沙门氏菌多重耐药菌株统计结果 |
| 3.3 氨基糖苷类钝化酶基因检测与鉴定结果 |
| 3.3.1 沙门氏菌氨基糖苷类钝化酶基因部分扩增产物电泳结果 |
| 3.3.2 沙门氏菌氨基糖苷类耐药基因统计结果 |
| 3.4 喹诺酮类耐药基因检测与鉴定结果 |
| 3.4.1 沙门氏菌喹诺酮类耐药基因部分扩增产物电泳结果 |
| 3.4.2 沙门氏菌喹诺酮类耐药基因统计结果 |
| 3.5 β-内酰胺类耐药基因检测与鉴定结果 |
| 3.6 毒力基因检测与鉴定结果 |
| 3.6.1 沙门氏菌毒力基因部分扩增产物电泳结果 |
| 3.6.2 沙门氏菌毒力基因统计结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 死亡鸭胚中细菌的流行状况 |
| 4.2 鸭源沙门氏菌药敏试验检测 |
| 4.3 鸭源沙门氏菌耐药基因检测 |
| 4.4 鸭源沙门氏菌毒力基因检测 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（9）沙门氏菌快速检测方法的筛选与应用和鸡源、猪源菌株MLST分子溯源及耐药性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 沙门氏菌概述 |
| 1.1 沙门氏菌的生物学特性 |
| 1.2 沙门氏菌血清学分类 |
| 1.3 沙门氏菌的流行现状 |
| 2 沙门氏菌病检测方法研究现状 |
| 2.1 病原分离鉴定培养方法 |
| 2.2 分子生物学方法 |
| 2.3 免疫学方法 |
| 3 细菌耐药性研究现状 |
| 3.1 细菌的耐药产生机制 |
| 4 沙门氏菌的分子分型 |
| 4.1 MLST (Multilocus sequence typing)分型 |
| 4.2 脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 沙门氏菌快速检测方法的筛选与初步应用 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株背景 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PCR引物筛选 |
| 2.2 引物的鉴定 |
| 2.3 引物特异性检测 |
| 2.4 基因组DNA的提取方法筛选 |
| 2.5 沙门氏菌PCR检测方法模拟试验 |
| 2.6 PCR快速检测方法应用 |
| 2.7 细菌分离 |
| 3 沙门氏菌PCR试验结果 |
| 3.1 引物设计结果 |
| 3.2 引物鉴定结果 |
| 3.3 引物特异性检测结果 |
| 3.4 基因组DNA的提取方法筛选结果 |
| 3.5 沙门氏菌PCR检测方法模拟试验结果 |
| 3.6 PCR快速检测方法应用结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡源、猪源沙门氏菌MLST分子溯源及耐药性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 MLST分子分型结果 |
| 2.2 药物敏感试验结果 |
| 2.3 耐药基因检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录1 |
| 致谢 |
（10）猪流行性腹泻病毒、Delta冠状病毒和传染性胃肠炎病毒三重RT-PCR检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 猪流行性腹泻病毒、Delta冠状病毒和传染性胃肠炎病毒检测方法的研究进展 |
| 1.1 病原概述 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.2 猪Delta冠状病毒 |
| 1.1.3 猪传染性胃肠炎病毒 |
| 2.1 实验室主要诊断方法 |
| 2.1.1 血清中和试验 |
| 2.1.2 病毒分离培养与鉴定 |
| 2.1.3 免疫电镜技术 |
| 2.1.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.1.5 聚合酶链式反应 |
| 3.1 研究目的与意义 |
| 第2章 猪流行性腹泻病毒、Delta冠状病毒和传染性胃肠炎病毒三重RT-PCR检测方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株和菌株 |
| 1.1.2 主要仪器、试剂和溶液配方 |
| 2.1 方法 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 毒株处理 |
| 2.1.3 cDNA模板的制备 |
| 2.1.4 单项RT-PCR反应条件的优化 |
| 2.1.5 PCR产物的回收与纯化 |
| 2.1.6 目的基因连接 |
| 2.1.7 转化 |
| 2.1.8 质粒提取 |
| 2.1.9 重组阳性质粒的测序与分析 |
| 3.1 三重RT-PCR反应条件的优化 |
| 3.1.1 特异性试验 |
| 3.1.2 敏感性试验 |
| 3.1.3 重复性试验 |
| 4.1 结果 |
| 4.1.1 单项RT-PCR扩增产物电泳结果 |
| 4.1.2 最适引物终浓度的确定 |
| 4.1.3 最适退火温度的确定 |
| 4.1.4 单项RT-PCR反应的敏感性 |
| 4.1.5 单项RT-PCR反应的特异性 |
| 4.1.6 三重RT-PCR引物终浓度的确定 |
| 4.1.7 三重RT-PCR退火温度的确定 |
| 4.1.8 特异性试验 |
| 4.1.9 敏感性试验 |
| 4.1.10 重复性试验 |
| 5.1 讨论 |
| 第3章 猪流行性腹泻病毒、Delta冠状病毒和传染性胃肠炎病毒三重RT-PCR检测方法的初步应用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 临床待检病料 |
| 1.1.2 仪器与试剂 |
| 1.1.3 三重RT-PCR最终反应条件 |
| 1.1.4 样品检测 |
| 2.1 样品检测结果 |
| 3.1 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法的建立与应用（论文参考文献）
- [1]水产品中志贺氏菌双抗夹心ELISA检测方法建立与应用[J]. 朱芳茜,何扩,张秀媛,李育峰,陈一,王云峰,王硕,赵瑞平. 食品研究与开发, 2021(04)
- [2]西安市鄠邑区口蹄疫和猪瘟疫苗免疫效果评价及一起非洲猪瘟疫情报告[D]. 谭展杭. 西北农林科技大学, 2020
- [3]两种基于脲酶介导的猪霍乱沙门氏菌和克罗诺杆菌高灵敏免疫分析方法[D]. 高宝. 南昌大学, 2020
- [4]喹乙醇免疫分析方法的研究[D]. 杨艳玲. 天津科技大学, 2019(07)
- [5]一四二团规模化猪场PRDC相关的四种病毒性疾病的流行病学调查[D]. 李世震. 石河子大学, 2018(12)
- [6]重组大肠杆菌耐热肠毒素蛋白及其单克隆抗体的制备与初步应用[D]. 韩林林. 东北农业大学, 2014(05)
- [7]河南部分地区PCV2流行病学调查及卵黄抗体制备[D]. 李明亮. 河南农业大学, 2018(02)
- [8]山东地区死亡鸭胚中细菌分离鉴定及沙门氏菌耐药性与毒力基因检测[D]. 宫艳杉. 山东农业大学, 2017(01)
- [9]沙门氏菌快速检测方法的筛选与应用和鸡源、猪源菌株MLST分子溯源及耐药性研究[D]. 陈健皓. 扬州大学, 2017(01)
- [10]猪流行性腹泻病毒、Delta冠状病毒和传染性胃肠炎病毒三重RT-PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 曹恭貌. 西南民族大学, 2017(02)