一、脊髓小脑性共济失调的分子生物学发病机制（论文文献综述）
朱雄[1]（2020）在《EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究》文中提出神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一类以中枢神经系统（神经元）和（或）外周神经系统（髓鞘）的变性、凋亡所导致的结构和功能的进行性退化为特征的异质性疾病。随着人口老龄化问题日益突出,神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病的发病机理极其复杂,至今尚不能被完全解释清楚,到目前为止缺少有效的诊断和治疗方法。目的:在神经退行性疾病中,脑和视网膜神经退行性病变是目前研究的热点。此类疾病引起损害的病理是神经元细胞的不可逆性损伤,目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。视网膜营养不良（Retinal dystrophy）是一类因光感受器功能丧失而引起的异质性遗传性疾病。在全球尤其是工业化国家中,视网膜变性疾病是致盲的重要原因之一。这些疾病的临床表型复杂性和等位基因的异质性给疾病的正确诊断带来困难。内质网膜蛋白复合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）首先在酿酒酵母中被鉴定为内质网中蛋白质折叠所需的6亚单位跨膜蛋白复合物。EMC亚基的丢失会导致错误折叠的膜蛋白的积累和未折叠蛋白反应（UPR）的诱导。有研究报道,EMC1基因突变与视网膜营养不良及小脑发育退化综合征相关。在真核生物中,d Pob/EMC3定位于内质网,并与EMC1和钙连蛋白（calnexin）结合并相互作用。此外,内质网膜蛋白复合物（EMC）是其他多通道跨膜蛋白的稳定表达所必需的,如视紫红质和Na+K+-ATP酶等。另外,d Pob/EMC3缺失会导致果蝇单眼细胞的变性。这些结果共同表明,EMC是包括视紫红质1在内的多通道跨膜蛋白生物发生过程中的一个关键因素,其缺失会导致视网膜变性。EMC1和EMC3组成复合物参与内质网相关降解（ERAD）途径,表明EMC与ERAD途径之间存在密切联系。内质网结构和功能的紊乱在神经退行性疾病中已被广泛观察到,但内质网功能障碍是神经退行性疾病病变的原因,还是仅仅是神经元死亡的表现,目前尚不清楚。本论文重点研究EMC3在小脑和视网膜中的功能。方法:构建EMC3、EMC1等表达质粒载体（包括野生型和突变型）,分别进行细胞转染,结合免疫组化等方法,通过高分辨激光共聚焦显微镜、荧光共定位等分析其在细胞中的表达及定位情况,分析EMC1突变是否引起细胞中定位发生变化。研究EMC3与EMC其他亚基的表达及定位分析。在前期工作中,本研究发现小鼠Emc3基因胚胎敲除导致早期胚胎死亡。因此使用Pcp2-cre转基因小鼠和Emc3条件性敲除小鼠建立了一个在小脑浦肯野神经细胞和视网膜双极细胞中特异敲除Emc3基因的动物模型。本论文综合运用分子生物学,细胞生物学和免疫组化等方法,详细研究Emc3在双极细胞和小脑浦肯野细胞中的功能。利用双极细胞和小脑浦肯野细胞中特异蛋白标志物,对Emc3缺失的小鼠视网膜和小脑冰冻切片进行免疫染色,使用高分辨率激光共聚焦显微镜,详细分析这些关键蛋白的运输和定位。结果:EMC3由小鼠Tmem111基因编码,是高度保守的内质网膜蛋白复合物（EMC）的一个亚基。本研究发现Emc3的靶向缺失导致了小鼠严重的神经病变表型。同时Emc3lox P/lox P;Pcp2-Cre小鼠是可以长期存活并是可育的,但行为学上表现出类似于小脑共济失调的表型。与野生型小鼠相比较,三月龄的成年Emc3突变小鼠小脑中浦肯野细胞的树突发育有明显减少。本研究进一步发现,浦肯野细胞中Emc3的选择性缺失导致内质网错误折叠的膜蛋白的积累,阻碍了浦肯野细胞的分泌运输,并导致了树突萎缩。这些表型表现为小脑体积变小和浦肯野细胞数量减少,导致共济失调。浦肯野细胞丢失和共济失调最初出现在出生后两个星期左右,但随着年龄的增长逐渐恶化。Emc3的缺失导致浦肯野细胞缺失区域神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加和星形胶质细胞增生。C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78/BIP）表达水平升高表明浦肯野细胞在可见细胞丢失之前存在内质网应激（ER Stress）。TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）分析表明,小脑浦肯野细胞出现细胞凋亡。本文的数据表明,浦肯野细胞中Emc3的缺失导致蛋白质折叠和运输缺陷,树突密度显着降低,星形胶质细胞增生和浦肯野细胞死亡。此外,本研究发现Emc3突变小鼠视网膜中视杆双极细胞与野生型小鼠相比有进行性病变,这表明Emc3在小鼠的视网膜结构和功能维持发挥重要作用。结论:研究结果表明了Emc3在小鼠浦肯野细胞和视网膜双极细胞的发育和功能维持发挥重要作用。本文的研究揭示了EMC3蛋白在小脑浦肯野细胞和视网膜中的重要作用,为研究小脑共济失调和视网膜神经退行性疾病提供了新方向与思路。
孙觊[2]（2020）在《癫痫血浆蛋白质组学分析及相关基因功能鉴定》文中指出癫痫是临床上一种常见的慢性疾病,起病年龄跨阈大,以发作形式多样、反复发作为特点,对患者身体、精神、智力等均造成不同程度的影响,临床上可表现为多种癫痫综合征,也可演变为癫痫持续状态,甚至引起癫痫性猝死。癫痫的致病机制复杂,至今仍未阐明,由相关基因突变引起的细胞功能障碍可能为其致病原因之一。此外,近年来,组学技术在医学领域被越来越广泛地使用,作为其重要组成部分的蛋白质组学的迅速发展为临床上疾病标志物的识别、疾病的早期诊断、靶向干预提供了有力的技术支持。但是目前对癫痫的蛋白质组学研究多集中于动物模型或人脑组织标本,对于癫痫血浆蛋白质组学的研究仍不多见。本研究一方面应用定量蛋白质组学联合生物信息学技术对癫痫患者血浆差异蛋白进行筛选,一方面通过体外细胞实验对癫痫致病基因CACNA1A扩增突变引起细胞凋亡的机制进行研究。本文共分6章,主要内容在第3、4章,具体工作如下:⒈儿童Rolandic癫痫血浆TMT定量蛋白质组学分析（第3章）目的:应用TMT定量蛋白质组学技术对儿童Rolandic癫痫患者血浆中的差异表达蛋白进行分析,同时联合生物信息学技术对差异蛋白进行筛选、可视化,以寻求癫痫患者血浆中的可能生物标志物。方法:对儿童Rolandic癫痫患者（病例组5例）及儿童偏头痛患者（对照组5例）的血浆分别进行收集,之后进行蛋白提取及胰蛋白酶酶解消化,酶解后的肽段用TMT试剂进行标记,再用高效液相色谱法（HPLC）分级,液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）分析,使用Maxquant（v1.5.2.8）进行检索,检索数据库为Swiss Prot Human,进行差异蛋白鉴定。在质谱数据质控检测合格的基础上,选取fold change>1.2或fold change<0.83,P value<0.05,且同时在二组或以上均表达上调/下调的差异表达蛋白（DEP）进行生物信息学分析:包括GO分析、KEGG通路分析、蛋白互作（PPI）网络的构建、差异表达蛋白的核心基因筛选。结果:共鉴定到752个蛋白（670个定量蛋白）。其中217个差异表达蛋白存在于二组及以上的样本中,其中上调差异表达蛋白46个,下调差异表达蛋白111个。这些蛋白多与免疫或炎症反应、补体级联反应的活化、脂质及糖酵解代谢、纤维蛋白原及纤溶系统的调节异常、氧化应激反应有关。共筛选出20个核心差异表达蛋白,其中纤连蛋白、α-1酸性糖蛋白家族（AGP1、AGP2）、血清淀粉样蛋白P、纤维蛋白原γ链、纤维蛋白原α链、补体C9、补体C8β、补体C4B、补体因子I表达上调;甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、磷酸丙糖异构酶（TIM）、磷酸甘油酸激酶1（PGK1）、果糖二磷酸醛缩酶A（ALDOA）、蛋白质二硫键异构酶（PDI）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物岐化酶1（h Sod1）、热休克蛋白90β1、α稀醇化酶、载脂蛋白A1表达下调。α-1酸性糖蛋白（AGP）、血清淀粉样蛋白P（SAP）在儿童Rolandic癫痫患者血浆中表达上调属首次报道。⒉PME基因CACNA1A中CAG扩增突变引起SH-SY5Y细胞凋亡的机制研究（第4章）目的:我们课题组前期在一个进行性肌阵挛癫痫（PME）伴有进行性共济失调、肌张力减退及认知功能下降的三代家系中发现二例CACNA1A基因纯合突变,为47外显子c.69756976ins CAG。本章是探讨PME致病基因CACNA1A的3′端CAG扩增突变对SH-SY5Y细胞凋亡的影响,进而为PME发病机制的研究提供依据。方法:⑴构建表达Cav2.1wt（Q13）、Cav2.1mt（Q26）、截短突变（Cav2.1dm）中的Cav2.1N、Cav2.1dm1、Cav2.1dm2、Cav2.1C、Cav2.1dm3、Cav2.1dm4、Cav2.1dm5的DNA分子,并将相应的DNA分子克隆到带有Bam H I和Xba I限制性内切酶切位点的pc DNA3.1 neo vector中。再利用Lipofectamine 3000进行SH-SY5Y细胞转染。⑵48小时后采用WST-1细胞增殖试剂盒进行细胞增殖检测,并利用流式细胞学进行细胞周期及凋亡检测,并观察细胞凋亡形态。⑶用GFP标记Cav2.1dm3构建Cav2.1dm3G融合基因,应用western blot检测转染后细胞中Cav2.1wt、Cav2.1mt、Cav2.1dm3G的蛋白表达情况,并应用免疫荧光及DAPI染色观察Cav2.1wt、Cav2.1dm3G表达蛋白在细胞中的分布。⑷应用western blot检测转染后Cav2.1wt、Cav2.1mt、Cav2.1dm3各组中Bcl-2、Bax、cleaved caspase 3、cleaved PARP的蛋白表达水平。结果:⑴与Cav2.1wt（Q13）及EV对照组相比,Cav2.1mt（Q26）显着降低了细胞的增殖水平,**P<0.01。Cav2.1N、Cav2.1C与EV对照组相比,未见对细胞增殖产生显着性影响。Cav2.1dm3与Cav2.1dm1、Cav2.1dm2组分别相比较,对细胞增殖的抑制差异均具有显着性,**P<0.01。Cav2.1dm4、Cav2.1dm5与EV对照组相比,未见对细胞增殖产生显着性影响。Cav2.1dm3与EV对照组、Cav2.1dm4、Cav2.1dm5组分别相比较,对细胞增殖的抑制差异均具有显着性,**P<0.01。⑵Cav2.1mt、Cav2.1dm3与EV对照组、Cav2.1wt组相比,对细胞周期分布的影响无显着性差异。⑶Cav2.1dm3与Cav2.1wt、EV对照组相比,引起细胞凋亡百分比的升高具有显着性差异,**P<0.01。Cav2.1dm3与Cav2.1mt组之间相比较,引起细胞凋亡百分比的升高具有显着性差异,**P<0.01。⑷western blot结果显示,Cav2.1wt蛋白主要表达于细胞膜（87.0%,**P<0.01）,Cav2.1mt蛋白表达于细胞膜和细胞核（46.7%vs53.3%,**P<0.01）,而Cav2.1dm3G蛋白主要表达于细胞核（85.9%,**P<0.01）,与细胞免疫荧光染色实验结果一致。⑸与Cav2.1wt组相比,Cav2.1mt和Cav2.1dm3组Bcl-2/Bax比值的下降、cleaved caspase 3、cleaved PARP水平的升高具有显着性差异,**P<0.01。Cav2.1dm3组与Cav2.1mt组相比,Bcl-2/Bax比值的下降、cleaved caspase 3、cleaved PARP水平的升高具有显着性差异,**P<0.01。结论:⑴应用TMT定量蛋白质组学技术从儿童Rolandic癫痫患者血浆中筛选出的蛋白,多数与免疫或炎症反应、补体级联反应的活化、脂质及糖酵解代谢、纤维蛋白原及纤溶系统的调节异常、氧化应激反应有关。⑵应用生物信息学方法共筛选出20个核心差异表达蛋白,其中与免疫或炎症反应、补体级联反应的活化、纤维蛋白原活化相关的蛋白表达上调;与脂质及糖酵解代谢、纤溶系统调节异常、氧化应激反应相关的蛋白表达下调。α-1酸性糖蛋白（AGP）、血清淀粉样蛋白P（SAP）在儿童Rolandic癫痫患者血浆中表达上调属首次报道。⑶癫痫致病基因CACNA1A中CAG扩增突变所编码的C端含有延长的poly Q序列的突变型Cav2.1蛋白可能由于结构不稳定发生酶解,产生截短突变蛋白,其中包含有C端的截短蛋白更倾向于发生核转移,并可通过Bcl-2/Bax/caspase-3/PARP通路诱导SH-SY5Y细胞凋亡。
唐秘博[3]（2020）在《CHIP蛋白参与脊髓小脑共济失调3型的发病机制研究》文中提出背景脊髓小脑共济失调3型（Spinocerebellar ataxia type 3,SCA3）,又称马查多·约瑟夫病（Machado-Josephdisease,MJD）,是亚洲最常见的SCA类型,也是仅次于亨廷顿舞蹈症（Huntington’s disease,HD）最常见的PolyQ（多聚谷氨酰胺）病。SCA3多呈常染色体显性遗传,临床表现主要为小脑性共济失调、吞咽困难、构音及运动障碍和眼球震颤等。本病是位于14q32.1上的ATXN3基因发生CAG重复序列异常扩增,进而导致其编码的Ataxin3蛋白的羧基端PloyQ异常增多引起的。尽管SCA3是一种单基因病,但其致病机制尚不清楚,因此,阐明疾病的发病机制,寻找疾病的早期诊断方法,探究疾病的治疗措施仍是神经疾病研究领域亟待解决的重要问题。SCA3的主要病理改变是小脑和脑干神经元内大量异常蛋白聚集物的沉积,该过程又称包涵体的形成。目前SCA3发病机制的研究主要集中在:Ataxin3扩增突变后蛋白质降解通路的改变、突变的Ataxin3引起的转录调控异常、线粒体DNA损伤及能量供应障碍等方面。近年来蛋白质质量控制系统功能障碍被认为在SCA3的发生、发展中起到了至关重要的作用,分子伴侣和蛋白质降解系统则是执行此功能的关键因素。热休克70羧基端相互作用蛋白（Carboxyl terminus of Hsc70 interacting protein,CHIP）是主要在骨骼肌、心脏、胰腺和脑中大量表达的HSP70相互作用蛋白。CHIP蛋白同时具有结合分子伴侣和E3泛素连接酶的活性,而分子伴侣和E3泛素连接酶是泛素一蛋白酶体系统的重要参与蛋白,因此CHIP被认为在细胞的蛋白质质量控制系统中起核心桥梁作用。近期的研究提示SCA3转基因小鼠的脑蛋白裂解液中存在CHIP蛋白的明显下调,但导致CHIP蛋白下调的具体分子机制及CHIP蛋白降低对SCA3发病的影响仍未得到全面的研究及阐述。热休克转录因子1（Heat shock transcription factor 1,HSF1）是通过激活应激适应和细胞存活的基因来保护细胞免受蛋白质错误折叠、聚集和凋亡的应激反应转录因子。当细胞发生应激时HSF1可作为多聚体组装,结合靶基因启动子中的热休克元件并激活应激保护蛋白HSP70,HSP90等HSPs（热休克蛋白）的表达。既往研究发现表达HD相关蛋白的细胞在应激状况下存在HSP70和HSP90的表达不足。有研究推测SCA3小鼠可能也存在应激不耐受,那么SCA3相关模型中是否存在应激不耐受以及引起应激不耐受的机制是否与CHIP蛋白的水平降低有关需要进一步探究。由于SCA3的临床表现具有异质性,与HD,脊髓侧索硬化症,帕金森综合征,脊髓延髓萎缩症以及其它类型的脊髓小脑共济失调的鉴别诊断比较困难,外显子测序成为唯一诊断该疾病的准确方法,但是外显子测序费用较高,所需时间较长,不适合对门诊病人的初筛。生物标志物是一种近年来发展的用来标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞功能或结构改变的指标,可用于疾病的诊断、药物评价等。目前针对SCA3的研究主要集中在中枢神经系统的病理改变,对生物标志物的研究尚少。因此,寻找能够作为临床疾病检测的生物标志物对SCA3的诊断,监测SCA3进展以及评价治疗效果具有重要的意义。目的1.运用SCA3转基因小鼠、SCA3稳定细胞系、SCA3病人来源的皮肤成纤维细胞及诱导多功能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSC）分化而来的神经干细胞（Neural stem cells,NSC）,从转录、翻译、蛋白分布及降解途径探索CHIP蛋白在SCA3相关模型中降低的分子机制。2.采用热应激及在SCA3细胞模型中过表达CHIP蛋白的方法,探讨CHIP蛋白是否参与SCA3的应激不耐受及相关的分子机制。3.检测正常人及SCA3患者的血清CHIP蛋白水平,比较正常人及SCA3患者血清中CHIP蛋白水平,探讨CHIP蛋白是否可作为SCA3的生物标志物。方法1.采用慢病毒感染N2a细胞的方法构建表达空载体的LV-细胞、表达野生型Ataxin3的LV-Q28细胞及表达突变型Ataxin3的LV-Q84细胞。取正常人及SCA3患者的皮肤,原代培养皮肤成纤维细胞。2.检测上述细胞在培养的24h,48h和72h的细胞活力及凋亡水平。3.提取上述构建的稳定细胞系、皮肤成纤维细胞及不同周龄（weeks）SCA3转基因小鼠的蛋白,检测CHIP蛋白水平并分析SCA3小鼠周龄的增加与CHIP蛋白水平变化的关系。4.分别提取上述细胞及40w的转基因小鼠的大脑及小脑总RNA,检测CHIP及Ataxin3在转录水平的改变。5.采用稳定细胞系,皮肤成纤维细胞及40w的转基因小鼠,检测CHIP蛋白在可溶及不可溶性蛋白中的水平,细胞免疫荧光检测Ataxin3/PolyQ和CHIP蛋白是否存在共定位及有无包涵体形成;同时检测Ataxin3/PolyQ与CHIP蛋白在24w及40w的SCA3小鼠脑干及小脑的分布及有无包涵体形成,比较24w及40w小鼠包涵体的大小及数目的差异。6.用10μM的蛋白酶体抑制剂（MG132）抑制LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞的蛋白酶体通路,泛素化分析各组细胞的CHIP蛋白泛素化水平;用MG132和PI3K自噬抑制剂（3-MA）分别抑制LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞的蛋白酶体通路和自噬溶酶体通路,Western blot检测给药前后各组细胞的CHIP蛋白增量的差异,分析蛋白降解改变对SCA3中CHIP蛋白的影响。7.运用正常人及SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞重编程iPSC,并进一步诱导分化为NSC,检测SCA3患者来源的NSC及正常人的NSC细胞中CHIP蛋白有无差异。8.将LV-、LV-Q28及LV-Q84细胞及上述提取的皮肤成纤维细胞置于42℃细胞培养箱内4h,采用非变性凝胶电泳、Western blot及免疫荧光技术检测应激相关蛋白水平,免疫共沉淀检测Ataxin3与应激相关蛋白的相互作用,分析SCA3细胞的应激不耐受。9.用表达CHIP的慢病毒感染LV-Q84细胞及上述提取的SCA3皮肤成纤维细胞。将上述细胞置于42℃细胞培养箱内4h后继续培养,在24h,48h及72h后用CCK8法检测细胞的活力,免疫荧光观察细胞中包涵体的数量,Western blot检测相关蛋白的表达,进而分析CHIP蛋白的保护作用。10.由于SCA3为比较罕见的遗传病,本研究进行了探索性病例对照研究,共收集了 80名SCA3患者和年龄性别相匹配的正常人的血清,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测CHIP蛋白水平,Student’s t检验分析正常人及SCA3患者的血清CHIP蛋白水平是否存在差异,用Pearson相关性分析检测血清CHIP蛋白水平与患者的发病年龄、性别、病程持续时间及SARA和ICARS评分之间的相关性,采用多重回归模型分析血清中CHIP蛋白浓度的影响因素。结果1.成功构建了过表达空白载体的LV-细胞、野生型Ataxin3的LV-Q28细胞及突变型Ataxin3的LV-Q84细胞,并成功分离培养了两名SCA3患者和一名年龄性别相匹配的正常人的皮肤成纤维细胞。2.在培养的24h,48h及72h,LV-Q84细胞的活力明显低于LV-Q28细胞.P<0.05,差异有统计学意义。相似的结果出现在SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞中。3.LV-Q84细胞的CHIP蛋白水平明显低于LV-Q28细胞,P<0.05,差异有统计学意义。相似的结果出现于SCA3患者来源的皮肤成纤维中。此外,40w的SCA3纯合小鼠的CHIP蛋白水平较杂合突变型及野生型小鼠依次明显降低,P<0.05。SCA3小鼠小脑中CHIP蛋白含量随疾病的进展逐渐降低:排序依次为1w的野生小鼠,1w纯合突变型SCA3小鼠,18w纯合突变SCA3小鼠,40w纯合突变SCA3小鼠,P<0.05,差异有统计学意义。4.在上述SCA3细胞模型及40w的SCA3转基因小鼠中未观察到CHIP的mRNA水平改变,40w的纯合SCA3小鼠的大小脑内Ataxin3的mRNA水平明显高于杂合SCA3小鼠,杂合SCA3小鼠的Ataxin3的mRNA明显高于野生型,P<0.05,差异有统计学意义。5.LV-Q84细胞的可溶性蛋白中的CHIP蛋白水平明显低于LV-Q28细胞,但LV-Q84的不可溶性蛋白中的CHIP蛋白水平明显高于LV-Q28细胞,P<0.05,差异有统计学意义。相似的结果出现在皮肤成纤维细胞中。比较可溶性蛋白中CHIP蛋白水平显示:40w的纯合SCA3小鼠明显低于相同周龄的杂合SCA3小鼠,更低于野生型小鼠,而在不可溶性蛋白中得到了相反的结果。P<0.05,差异有统计学意义。在LV-Q84细胞,SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞及SCA3杂合和纯合转基因小鼠中均发现了 Ataxin3与CHIP蛋白共定位于包涵体内。24w和40w的SCA3小鼠的小脑及脑干中检测到包涵体,且24w小鼠的包涵体数量明显小于相同基因型的40w的SCA3小鼠,P<0.05,差异有统计学意义。6.泛素化分析显示,LV-Q84细胞CHIP蛋白的泛素化水平低于LV-Q28细胞;分别抑制各组细胞的蛋白酶体通路及自噬溶酶体通路后,各细胞组CHIP蛋白的增量差别不明显。7.SCA3患者来源的NSC细胞中的CHIP蛋白水平较正常人明显增高,且细胞内未检测到包涵体。8.热应激后,非变性凝胶电泳显示:LV-Q84细胞的三聚体HSF1水平明显低于LV-Q28细胞。热应激后应激相关蛋白DNAJB1在LV-Q84细胞中升高的水平明显低于LV-Q28细胞,且LV-Q84细胞中DNAJB1的mRNA升高水平低于LV-Q28细胞P<0.05,差异有统计学意义,相似的结果出现在皮肤成纤维细胞中。免疫共沉淀显示突变的Ataxin3蛋白与DNAJB1存在相互作用,而野生型Ataxin3蛋白与DNAJB1的相互作用未检测到。9.过表达CHIP的LV-Q84细胞的包涵体数量明显低于LV-Q84细胞;热应激后,过表达CHIP的LV-Q84细胞的细胞活力较LV-Q84细胞高,且应激相关蛋白DNAJB1升高水平明显增加,P<0.05。10.SCA3患者和正常人的血清CHIP蛋白水平分别为（80.93±28.68）ng/mL和（40.37±18.55）ng/mL,统计学分析显示P<0.05。相关分析显示:年龄、发病年龄、疾病持续时间被剔出,SARA和ICARS评分与血清CHIP蛋白水平独立相关（SARA:β=0.500,P=0.034;ICARS:β=0.561,P=0.015）。结论1.大量CHIP蛋白被隔离于包涵体中引起CHIP蛋白的分布异常,导致了CHIP蛋白在SCA3疾病模型中的降低。2.SCA3细胞模型中活化状态的三聚体HSF1水平降低,致使DNAJB1的转录激活不足,导致细胞产生应激不耐受。过表达CHIP蛋白能够显着改善SCA3细胞模型的应激不耐受,发挥保护作用。3.和正常对照相比SCA3患者的血清CHIP蛋白水平存在明显升高,并和疾病严重程度相关,有希望作为SCA3的生物标志物。
余立丹[4]（2018）在《CAG重复长度与脊髓小脑性共济3型发病年龄相关性的meta分析》文中进行了进一步梳理目的:采用meta分析的方法,探讨CAG重复长度与脊髓小脑性共济失调3型发病年龄的相关程度。方法:记算机系统检索 Pubmed、EMBASE、MEDLINE、ISI Web of Science、中国生物医学文献数据库（CBM）、中国知网数据库（CNKI）、重庆维普（VIP）数据库和万方数据库等中外文数据库,收集关于CAG重复长度与脊髓小脑性共济失调3型发病年龄相关性的文献,检索时限均为从建库到2017年12月31日。按照纳入与排除标准筛选文献、提取文献中的资料数据,并对纳入的文献进行质量评价。本论文采用R软件meta程序包进行meta分析。结果:本次meta分析共纳入12篇文献。总样本量为411名。Meta分析结果显示CAG重复长度与脊髓小脑性共济失调3型发病年龄合并相关系数及其95%CI为-0.9952（-1.10;-0.90）。亚组结果示,CAG重复长度与脊髓小脑性共济失调3型发病年龄随着年份的增加,相关性随之减小。随着样本量的增加,测出的相关系数值降低。种族不同,测出的相关系数有差异。对结果评估分析发现,种族能解释异质性的来源,本次meta分析不存在发表偏倚。结论:1.CAG重复长度与脊髓小脑性共济失调3型发病年龄存在强烈负相关,即CAG重复长度越长,脊髓小脑性共济失调3型发病年龄越小;CAG重复长度越短,脊髓小脑性共济失调3型发病年龄越大。2.CAG重复长度占脊髓小脑性共济失调3型发病年龄差异的40.6%,种族差异对脊髓小脑性共济失调3型发病年龄存在影响。
潘登[5]（2017）在《SCA3小鼠的脑电研究和生物信息学分析》文中指出第一部分:脊髓小脑性共济失调3型小鼠的脑电研究背景:脊髓小脑性共济失调（Spinocerebellar ataxias,SCAs）是一种在临床上和遗传上多相群的遗传性神经退行性疾病,是人类神经系统的主要遗传疾病之一,也是遗传性共济失调的主要类型。患病率约在1-5/10万,平均发病年龄为30岁,发病后生存期大多数为10余年,并且有近38%的患者直接由于该疾病导致死亡。SCAs有众多的亚型,不同亚型在各地区和种族中的发病率不一致,形成了SCAs纷繁、复杂的临床表现。SCA3又称马查多-约瑟夫病（MJD）,疾病的相关基因是为ATXN3/MJD1,于1994年被克隆,编码的蛋白是Ataxin。在中国人群中,该型几乎占所有SCA患者的50%。SCA3被认为是认知功能损害最常见的亚型,对于SCA3型初期首发症状多表现为下肢共济失调,表现为走路时步履不稳、肢体摇晃、动作反应迟缓及准确性变差;中期说话时发音含糊不清、无法控制音调、眼球转动不平顺、影像容易产生“重叠”（复视）、肌肉不协调感加重、无法写字、有时感到吞咽困难、进食时容易呛咳;晚期说话极不清楚、甚至无法言语、肢体乏力、不能站立、需靠轮椅代步、理解能力逐步下降、最后失去意识、昏睡不醒。SCA疾病被人发现了以后,国内外无数研究者们对其进行了多方面的深入研究,认识到了脊髓小脑性共济失调患者存在认知功能的损害,在这以后,研究者们便开始探索更深层次的发病机制,并且尝试了很多方法,试图从不同的角度证明他们关于发病机制的猜想,目前对SCA疾病的研究多是基因及病理生理方面,通过神经内分泌方面对SCA最常见的分型SCA3小鼠学习记忆进行研究目前尚且不多,脊髓小脑型共济失调3型小鼠的脑电研究目前未见相关报道。脑-机接口(（Brain-Computer Interface,BCI）是近现代科学家们开发的一套系统,其功能十分强大,它可以将人脑同其他电子设备进行连接,从而让人能够通过大脑去控制这些设备,而该设备的理论基础则是通过人脑的脑电波来实现的,该种设备很大的优点,就在于它不需要借助人体自身的外周神经和肌肉组织等,便能够将脑电波的信号输入到外部设备中去,再通过计算机和一些算法对该脑电信号进行处理,转换成可以被外部电子设备所识别的机器信号,从而使人脑能够对复杂的机械装置进行实时控制,而最初的脑电信号也是从人大脑中特定的区域采集的,该信号记录了一群特定神经元的活动。而该脑-机接口技术中,最重要的一个环节,就是对大脑特定的区域进行信号采集,并将该信号进行处理。相关学者建立了一整套的脑-机接口研究系统,该系统主要是针对于动物实验的,本实验利用脑-机接口技术首次对SCA3模型小鼠进行脑电采集并对脑电信号进行了特征分析。目的:本文研究的目的是探讨利用脑-机接口技术采集SCA3模型小鼠中枢神经系统的脑电信号,分析并识别小鼠某些特定脑区中的特征信号,通过对照试验记录各项参数,对各组进行区别,为临床诊断和疾病发病机制的研究提供新的依据。方法:雄性SCA3基因小鼠和雄性野生型（WT）小鼠均来源于郑州大学实验动物中心,体重20-23g,年龄12个月老年期SCA3小鼠和WT小鼠各一组,每组6只,年龄3个月生长期SCA3基因小鼠一组,每组6只。自制电极,植入小鼠小脑及大脑皮层运动区,利用Blackrock cerebus128通道采集系统,进行以下数据采集与分析。1.12月龄雄性SCA3小鼠与雄性WT的小鼠进行α、β、θ、δ四种脑电波比较和lz复杂度比较。2.12月龄雄性SCA3小鼠与雄性WT的小鼠进行场电位的近似熵和C0复杂度平均值对比。3.12月龄雄性SCA3小鼠与3月龄雄性SCA3小鼠进行β波段lz复杂度对比。结果:1.12月龄SCA3造模小鼠相比于WT小鼠四个波段的能量均明显增高,四个波段能量对比数据经过t检验后发现p值分别为0.000,0.0005,0.0001,0.0013;均有统计学差异,lz复杂度在β波段最为明显。2.12月龄SCA3造模小鼠与WT小鼠场电位分析中造模组小鼠近似熵较低,C0复杂度较高。3.12月龄雄性SCA3小鼠与3月龄雄性SCA3小鼠在β波段lz复杂度对比中,3月龄SCA3小鼠lz复杂度较低,12月龄SCA3行小鼠lz复杂度较高。结论:数据表明,SCA3小鼠发病以后的脑电波在各波段均有增强,且可通过β波段lz复杂度来进行区分,场电位分析中,发病小鼠的近似熵较正常值低,C0复杂度较正常值高。3月龄SCA3小鼠发病无明显症状,各项脑电波特征与正常小鼠一致,12月龄SCA3小鼠出现明显发病特征。第二部分:SCA3小鼠差异性表达基因mRNA的生物信息学分析背景脊髓小脑性共济失调（Spinocerebellar ataxia,SCA）是一种以常染色体显性遗传的神经系统退行性疾病,该疾病具有的高度临床异质性等特点。该疾病的患病率大概在8-12/10万之间,病人一般在30-40岁间发病,该神经退行性疾病存在遗传的早现性等特点,发病后患者的生存期一般在10-20年之间不等。SCA最早在1861年被报道,当时最早是发生于一个高加索家族系当中,然后在过去的100多年之间,各种不同类型的SCA家系也在世界各地不断地被发现,越来越多的不同的SCAs类型的致病基因被定位,目前人类已经明确的被发现的基因型SCA的亚型已经有30多种。为研究方便,根据遗传方式将其分为常染色体隐性共济失调型（autosomal recessive cerebellar ataxias,ARCA）,常染色体显性共济失调型（autosomal dominanl cerebetlar ataxias,ADCA）,X连锁性共济失调型,对于没有遗传史的病例称为散发型。SCAs属于ADCA。自从SCA患者在认知功能上存在损害的现象被人们发现以后,研究者们对于其更深一层的发病机制的研究从来都没有停步,研究者们尝试着从各种不同的角度,再运用多种不同方法,去证实而不是寻找机制,目前对SCA疾病的研究多是基因及病理生理方面。生物信息学是一门需要通过信息学技术对生物学实验数据进行加工、存储、检索与分析,最终能够揭示所获得的海量数据背后所蕴含的生物学意义的学科。我们通过生物信息学方法去研究这些信息,就可以较为方便的在大量的生物信息中提取出我们所需要的关键的知识,进一步便可以用生物信息学的分析方法去帮助我们寻找可能具有相当研究价值的基因,并且通过用实验来研究证实该基因的表达。本研究便是应用了该种生物信息学的分析方法,利用基因芯片获取表达谱数据,对其基因富集分析以及蛋白质相互作用网络等分析,来获取脊髓小脑共济失调转基因小鼠小脑组织的基因表达变化。近年来,人们虽然在脊髓共济失调方面取得了显着的成果,但却仍旧没有完全地阐明SCA3的临床特征及发病机制。然而在SCA3患者机体中,往往同时会有很多基因表达会发生或多或少的改变,其中值得我们去深入研究的问题包括以下几种:基因之间是否具有相互作用、它们的表达产物之间又是否有相互作用或者这些同时表达同时改变的基因又是否可以作为潜在的治疗靶点。将这些关系研究透彻可以有助于我们进一步探索SCA3的发病机制,可能会带来意想不到的效果。这几年来,随着基因和蛋白质技术的不断成熟和大范围运用,大量的与SCA3相关的基因数据被研究,因而我们很有必要在海量信息中发现并分析SCA3发病机制的重点环节,并对重点基因进行分析。而在本研究中,我们通过生物信息学的方法对一组脊髓小脑性共济失调转基因小鼠小脑组织基因的表达变化进行了分析和验证。目的分析脊髓小脑性共济失调3型转基因小鼠小脑区域与正常野生型小鼠的基因表达差异,从分子角度探求其发病机制,探讨其中的生物学意义。方法通过基因芯片技术获取转基因小鼠小脑的基因表达数据集。该数据集一共有12个样本,6个为SCA3转基因小鼠,6个为野生型小鼠。然后采用NOISeq方法对基因芯片数据进行处理以及差异基因（differentiallyexpressed genes,DEGs）的筛选。对所有筛选出来的基因进行聚类分析、GO富集分析以及Pathway富集分析。再将所有差异基因上传至STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING）数据库并对所有差异基因进行DEGs的蛋白质相互作用（protein-protein,interaction）网络分析。结果转基因小鼠中一共发现了36个DEGs,其中4个基因表达上调,32个基因表达下调。GO富集的生物学过程分析表明:差异基因主要涉及到了细胞的发育生长、细胞周期、单细胞和多细胞的生物过程、多个生物过程的调节及其正负反馈、对共生体在宿主的生长调节、对细菌、无机物、金属离子、外部生物刺激产生答应、分解代谢等过程;分子功能表明:差异基因主要涉及糖胺聚糖、金属离子、生长因子、阳离子、受体等的结合、催化活动以及转运活动。通过KEGG分析发现:这些差异基因主要参与唾液分泌、在癌症中的转录失调、黏着、阿米巴病、肺结核、胃酸分泌、卟啉和叶绿素代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和非洲锥虫病等信号通路。PPI网络分析显示Ltf、Ngp、S100a8、S100a9、Mpo、Camp等蛋白与其他≥5个蛋白质之间存在相互作用关系,是此蛋白质相互作用网络的中心蛋白。结论SCA3可能通过上调Hspb1、Rps27rt、Eno1b和Nrgn等基因,下调S100a8、S100a9、Ltf、Mpo、Camp、Ngp、Elane、Chi3I3和Eif2s3y等基因,参与了SCA3的发病机制。第三部分:脊髓小脑共济失调3型差异表达基因microRNAs的生物信息学分析背景SCA是一类具有明显的临床特征和遗传异质性的疾病,也是最常见的中枢神经系统退行性疾病,其最主要表现有共济失调和辨距不良等等,该疾病呈常染色体显性遗传。在目前的研究之中,研究者们通过遗传连锁定位的方法,已经发现33种基因型,并且克隆出了19种基因,在其中SCA3/MJD是最常见的一种亚型。其致病的基因为ATXN3/MJD1,该基因定位于第14号染色体短臂（14q32.1）,其3’端蛋白编码区包含了胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤（CAG）三核苷酸的重复序列,该重复序列在正常人体中的重复次数为12-44次,然而在SCA3/MJD的患者机体内却可以高达60-87次。ATXN3基因编码蛋白ataxin-3的羧基末端（c末端）,包含了一段多聚谷氨酰胺（Poly Q）肽链,而其扩展突变型ataxin-3蛋白可以选择性地在中枢神经系统中的特定区域（比如小脑、脑干、脊髓等）内积聚,从而逐渐形成神经元核内包涵体（NIIs）。并且,随着Poly Q扩展突变型ataxin-3蛋白表达水平升高,脊髓小脑性共济失调3型患者的病情也会逐渐加重,就目前的研究而言,关于体内调节Poly Q扩展突变型ataxin-3蛋白表达的机制仍旧没有完全阐明。最新的研究表明,miRNA和si RNA也参与到SCA3的调控中去了,而且已经筛选出调节SCA3的相关miRNA,其中表达异常显着上调的miRNA有miR-34b和miR-32,表达显着下调者有miR-29a、miR-125b、miR-25和miR-181b。而该研究的相关数据已经提交至miRBase数据库,可以供研究者们深入挖掘。Micro RNA（miRNA）是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,miRNA在细胞内具有多种的调节作用,其地位比较重要。每一个miRNA都可以作用于多个靶基因,反之,几个miRNA也可以调控同一个基因。而这种复杂的调节网络不仅可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,而且同时也能够通过几个miRNA的不同组合来精细调控某一个基因的表达。据目前研究推测,miRNA调节着大约人类1/3的基因。最近的研究还表明,大约70%的哺乳动物体内的miRNA是位于TUs区的（transcriptionunits,TUs）（Rodriguez et al,2004）,并且其中大部分miRNA是位于内含子区域的（Kim&Nam,2006）。而据研究表明,在不同的物种中,部分的内含子miRNA位置不仅具有高度的保守性质,而且内含子miRNA在基因序列上也呈现出高度的同源性（Pasquinelli etal,2000;Ruvkun et al,2001;Lee&Ambros,2001）。miRNA所具有的高度的保守性,与其功能的重要性密不可分。除此以外,miRNA还与其靶基因的进化有着密不可分的联系,而通过研究其进化历史,将会有助于研究者们进一步地了解其作用的机制以及相关功能。本研究借助基因芯片研究脊髓小脑性共济失调转基因小鼠小脑的差异表达microRNAs,对其进行生物信息学分析,进一步探讨其发病机制以及相关microRNAs的表达变化,并对这些差异表达的microRNAs进行GO注释、KEGG富集分析和转录调控网络的分析,阐述脊髓小脑性共济失调在分子水平的发病机制。目的分析脊髓小脑性共济失调3型转基因小鼠小脑与正常野生型小鼠小脑的microRNA表达差异,从分子角度探求其发病机制,探讨其中的生物学意义。方法提取SCA3转基因小鼠中的RNA,从中分离出microRNA,再借助芯片获取其中的miRNA表达谱,并对所有筛选出来的microRNA的预测靶基因进行聚类分析、GO富集分析以及Pathway富集分析。并对其中的6个基因进行了验证。结果实验中发现SCA3转基因小鼠中一共有117个差异表达的microRNA,其中55个microRNA显着上调,62个microRNA显着下调。其生物学分析过程表明,这些差异表达的microRNA主要涉及器官、细胞组成、细胞蛋白修饰过程、细胞生物合成、Ras蛋白信号转导、细胞生物黏附、微管运动、细胞骨架和细胞增殖。分子功能表明:这些靶基因主要涉及阳离子、金属离子等的结合、GTP酶活性的调节、核苷三磷酸酶活性的调节、腺嘌呤核苷酸的结合和腺苷酸环化酶活性。通过KEGG分析发现,这些差异表达的microRNA的靶基因主要参与胰岛素耐药及转导通路、其他类型的0-聚糖的生物合成通路、ECM受体相互作用通路、甘油磷脂代谢通路、甘油磷脂代谢、磷脂酰肌醇信号系统、甘露糖型0-聚糖的生物合成、丙酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢和补体及凝血级联反应等通路。结论研究中发现117个差异表达的microRNA,其中55个miRNA表达上调,62个miRNA表达下调,其中miR-34b、miR-25等比较重要,可能通过对mRNA进行调控,参与到了脊髓小脑性共济失调的发病机制中去,并对其中6个关键基因进行了q RT-PCR验证。
姜洪波[6]（2017）在《脊髓小脑性共济失调3型小鼠学习记忆的机制研究》文中认为背景:脊髓小脑性共济失调（Spinocerebellar ataxia,SCA）是神经系统的一种退行性病。患病率约在8-12/10万,多在30-40岁之间发病,生存期约10-20年。目前已知的SCA亚型有30多种。在我国,SCA3亚型所占的比例最高,占SCA的40%-48%。SCA患者会出现进行性的小脑性共济失调、构音障碍及走路不稳等临床表现,部分患者也会出现认知能力下降、眼肌麻痹、周围神经病、锥体束征、视网膜色素变性等临床表现。SCA患者存有认知功能障碍,而且不同的亚型SCA患者认知功能障碍的严重程度、类型及发病率也各不相同。多聚谷氨酰胺（poly Q）扩展突变型Ataxin-3获得细胞毒性可能是SCA3发病的最基本原因。热休克蛋白70（Hsp70）也伴随着核内包涵体的形成逐渐核内集合,Hsp70促进了突变的Ataxin-3蛋白降解从而减轻由此导致的细胞毒性。精氨酸加压素（Arginine vasopressin,AVP）是参与学习记忆过程的肽类,有增强记忆的作用,在动物和人的小脑、丘脑、延髓、皮质、纹状体、海马、脊髓等区域可以测得,在大鼠的脑干、海马背侧及杏仁核也可以测得AVP受体。小脑损伤会出现一系列的执行、视觉空间、语言和情感障碍,产生“小脑认知情感综合症”。高级运动和认知及情感功能的信号通过基底节、脑桥核和小脑脚中部传入小脑,然后通过齿状核和丘脑腹外侧核将信号传出,为“小脑-丘脑-大脑皮层环”。故本实验测小脑、下丘脑、大脑皮层、海马、垂体、脊髓、血浆中的AVP含量,探讨其与学习记忆的关系。由于SCA的患病率低,临床表现复杂,不同种族之间,同一种族不同亚型之间,同一亚型不同家系之间,甚至同一亚型又是同一家系的不同患者之间临床表现也不会完全相同,为临床研究其认知功能障碍带来困难。而目前关于SCA3患者的空间学习和记忆方面的研究尚无,同时,国内外也尚未有研究SCA3患者的空间学习和记忆与Ataxin-3包涵体及AVP含量变化的报道。目的:对SCA3模型小鼠空间学习和记忆功能进行评价,探索其与Ataxin-3蛋白及与AVP含量的关系。研究Hsp70、AVP是否可以成为治疗SCA3学习记忆障碍的又一靶点。方法:12月龄雄性SCA3小鼠、雄性野生型（WT）小鼠来源于郑州大学实验动物中心,来源于郑州大学实验动物中心,体重20-23g,通过聚合酶链反应（PCR）鉴定,鉴定出SCA3小鼠作为实验组,其余为WT小鼠组。雄性SCA3小鼠与雄性WT的小鼠用Morris水迷宫实验进行空间学习和记忆的评价。用免疫组化法检查Ataxin-3、Hsp70含量。用放射免疫分析法（Radioimmunoassay,RIA）检测AVP含量。结果:1 SCA3小鼠相比于WT小鼠空间学习及记忆能力下降。2 SCA3小鼠相比于WT小鼠,Morris水迷宫实验中游泳距离和平台潜伏期显着延长,而在游泳速度方面,两组小鼠之间没有明显差异。3 SCA3小鼠小脑、海马中发现Ataxin-3蛋白变异,形成核内包涵体,Hsp70也随着核内包涵体的形成逐渐核内集合。4 SCA3小鼠相比于WT小鼠,大脑皮层、海马、小脑、下丘脑AVP含量显着较低,而脊髓、垂体、血浆中无明显变化。结论:SCA3小鼠的空间学习和记忆功能障碍可能与海马、小脑Ataxin-3蛋白形成核内包涵体以及大脑皮层、下丘脑、海马和小脑AVP含量相关。背景:脊髓小脑性共济失调（Spinocerebellar ataxia,SCA）临床表现复杂,越来越多的证据指出SCA患者存在认知功能障碍,包括空间学习和记忆下降。没有有效的治疗方法,目前仅能减轻症状或减缓疾病进展。对于SCA的认知功能的相关研究从未止步,我们试图通过不同的角度、多种的方法来证实并寻找SCA认知功能损害的机制。许多临床研究发现,SCA3患者的痴呆的发生率为5%13%,部分SCA3患者存在认知障碍。而抑郁和冷漠在SCA3的患者中是非常普遍的。但是,随着年龄增长、疾病的进展是否会出现抑郁和冷漠到认知障碍再到痴呆的进展变化仍未有相关报道。小鼠的中年是10-15个月龄,对于老年组小鼠应至少18月龄大。SCA3患者多在30-40岁之间发病,所以我们以12月龄小鼠为研究对象,同时对3月龄、6月龄、18月龄小鼠进行动态研究了解随着月龄老化、疾病进展,其学习记忆的发展变化与AVP含量的关系。SCA患者小脑灰质、小脑白质、苍白球、海马、腹侧间脑、丘脑、海马、壳核等处都存在明显的萎缩。而在血液中、中枢神经系统、脑脊液内均存在AVP。本文研究SCA3小鼠的学习及记忆功能下降是否与相关部位的AVP含量有关,和随着月龄的增长这种相关性的改变。SCA3是SCA中最为常见的亚型,所以本文以SCA3小鼠为研究对象。目前国内外尚未有不同月龄下的SCA3型小鼠中AVP的含量与学习和记忆关系的报道。目的:比较不同月龄下SCA3小鼠学习和记忆的发展及AVP含量的变化。方法:雄性SCA3小鼠、雄性野生型（WT）小鼠来源于郑州大学实验动物中心,体重20-25g,月龄分别为3个月、6个月、12个月、18个月,通过聚合酶链反应（PCR）反应进行筛选,鉴定出SCA3小鼠作为实验组,其余为WT小鼠组。雄性SCA3小鼠与雄性WT小鼠用Morris水迷宫实验对空间学习和记忆评价。用放射免疫分析法（Radioimmunoasaay,RIA）检测AVP含量。结果:1 SCA3小鼠相比于WT小鼠,在12月龄和18月龄的游泳距离及平台潜伏期显着延长,在3个月和6个月的月龄没有差异,在游泳速度方面,在3,6,12,18月龄的两组小鼠游泳速度没有差异。2 SCA3小鼠相比于WT小鼠,在12月龄和18月龄,大脑皮层、海马、小脑和下丘脑AVP含量显着下降,脊髓、垂体和血清中无明显变化,而3月龄、6月龄两组小鼠没有明显差异。结论:12月龄和18月龄的SCA3小鼠的空间学习和记忆功能障碍可能与大脑皮层、海马的AVP含量相关。背景:脊髓小脑性共济失调（Spinocerebellar ataxia,SCA）是神经系统的一种遗传疾病,大量证据指出SCA患者存在认知功能障碍,包括空间学习和记忆下降。髓鞘碱性蛋白（Myelin basic protein,MBP）是中枢神经系统髓鞘的主要蛋白质,维持髓鞘结构和脑发育,有促进轴突再生的作用。海马具有记忆及空间定位的作用。这提示可以通过改变海马内MBP含量来治疗SCA3发病时记忆障碍。H2S是一种气体信号分子,具有抗神经毒性作用,调节神经内分泌,保护线粒体,保证神经系统功能的正常运行。H2S能够选择性地提高N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体调节的神经系统反应,同时,也可以提高海马区长时程增强（LTP）,故而,H2S对学习和记忆发挥重要的调节作用。现有研究表明,SCA3线粒体损伤,线粒体可以合成ATP,线粒体损伤导致其合成ATP的能力下降。ATP的生成减少则会造成内质网的扩张和细胞水肿,甚至是细胞的变性和坏死。髓鞘内MBP含量的正常依赖于线粒体的正常能量供应,而生理浓度的硫化氢具有保护线粒体的作用。目前国内外未有SCA3小鼠海马有髓神经纤维通路MBP含量的变化与海马内硫化氢含量相关性的报道。如果此假设成立,可以通过改变海马硫化氢的含量改善其线粒体的功能,可能使海马有髓神经纤维通路MBP含量改变来减轻其髓鞘损伤,改善SCA3小鼠的学习记忆障碍。目的:SCA3小鼠海马硫化氢、MBP的变化,探讨硫氢化钠对其学习记忆的影响。方法:1雄性SCA3小鼠来源于郑州大学实验动物中心,通过聚合酶链反应（PCR）鉴定。给各组小鼠不同浓度的Na HS溶液腹腔注射。监测小鼠体重和H2S含量。2各组小鼠的空间学习和记忆功能用Morris水迷宫实验评价。3亚甲基蓝分光光度法测定海马中硫化氢含量。4免疫组化法测定海马组织CA1区MBP表达情况。5统计学处理。结果:1 Morris水迷宫实验中,12月龄SCA3小鼠与WT小鼠相比,空间学习及记忆能力下降。2 12月龄SCA3小鼠相比WT野生型小鼠,海马内硫化氢的量明显下降。3免疫组化检测12月龄SCA3小鼠相比WT野生型小鼠,海马有髓神经纤维MBP含量明显下降。结论:给予硫氢化钠增加了SCA3小鼠海马硫化氢的含量和有髓神经纤维通路MBP含量,可能和改善SCA3小鼠的学习记忆障碍有关。
谢坤铭[7]（2017）在《SCA1、SCA2、SCA3发病年龄与APOE等位基因相关性及中医辨证探索》文中进行了进一步梳理载脂蛋白E(ApolipoproteinE,AP（OE）是血浆中参与人体脂质代谢的重要蛋白,研究显示,其可能是多种神经退行性疾病发病的重要调节因素。APOE基因定位在19号染色体长臂13区2带,共有三种等位基因,分别是E2、E3、E4,共形成6个基因型,分别是E2/2型、E3/3型、E4/4型、E2/3、E2/4、E3/4。APOE作为低密度脂蛋白的受体,通过与受体之间的相互作用,参与脂蛋白的吸收以及其它脂类在人体各细胞中的运输,影响胆固醇代谢。APOE可在各种器官里合成,包括肝脏、脑,脾脏和肾脏,感觉和运动神经元周围的星形胶质细胞可分泌合成这种载脂蛋白[2]。研究显示,APOEE2和E3等位基因有利于神经元轴突的生长,抑制细胞凋亡,而E4在这方面的作用较低。APOCE E4型等位基因是阿尔茨海默病、高脂血症、冠心病等脂代谢紊乱疾病的发病的风险因素,E2型等位基因则可降低冠心病的发病风险。不同的APOE基因型对神经系统退行性疾病的影响不同,有研究发现携带APOEE4型等位基因的肌张力障碍患者发病年龄比其他等位基因携带者早10年左右;APOEE2型等位基因增加了散发性帕金森病的发病几率;国外也有关于APOEE4型等位基因对亨廷顿舞蹈病的发病年龄影响的研究,但结论不一致,存在争议。脊髓小脑共济失调（Spinocerebellar Ataxia,SCA）是遗传性共济失调的主要类型,病理改变以小脑、脊髓和脑干变性为主。临床表现为慢性进行性的共济失调,可伴有视神经萎缩、视网膜色素变性、锥体束征、锥体外系体征、肌萎缩、周围神经病、认知障碍等。SCA1、SCA2同时作为SCA最常见的类型,国内尚无其与APOE基因型相关性的研究。有研究者发现APOEE2型等位基因可降低SCA3患者的发病年龄,也有研究者认为APOE基因型对SCA3患者发病年龄无显着影响,为了验证这一结论,并且探究APOE基因型对SCA1、SCA2患者发病年龄的关系,很有必要开展SCA1、SCA2、SCA3患者发病年龄等因素与APOE基因型相关性的研究。此外,由于脊髓小脑共济失调属于遗传病,无法治愈,西医对与此病没有有效的治疗方法,只能从延缓病情进展方面入手。中医讲究天人合一,从宏观诊治,调节人体气血阴阳,从整体上提高人体各脏腑的生理机能,所以,探索中医对于此类遗传病的辨证分型诊治,对于延缓病情进展,提高患者的生活质量有一定的帮助。目的:研究SCA1、SCA2、SCA3发病年龄与载脂蛋白E（APOE）等位基因的相关性以及中医对于SCA1、SCA2、SCA3辨证诊治的探索。材料和方法基于中日友好医院运动障碍与神经遗传病专病门诊收诊并经基因检测确诊的86例脊髓小脑共济失调1型（spinocerebellar ataxias 1,SCA1）患者,80例脊髓小脑共济失调2 型（spinocerebellar ataxias 2,SCA2）患者,300 例脊髓小脑共济失调 3 型（spinocerebellar ataxias 3,SCA3）患者,详细整理发病年龄、家族史、临床表现等资料。采用聚合酶链反应结合荧光标记毛细管电泳片段分析方法,确定SCA1、SCA2、SCA3患者的CAG重复次数。并选取350例正常人DNA样本做对照。应用等位基因特异性多重PCR技术对患者和对照组进行APOE基因分型。利用R软件统计分析APOE的基因型、等位基因以及患者的性别与SCA1、SCA2、SCA3患者发病年龄的相关性。采用中医望闻问切方法对部分脊髓小脑共济失调患者进行辨证论治,观察患者的中医证候特点,初步探索中医对SCA疾病的辨证诊治。结果:（一）SCA1:1、SCA1患者中,APOE3/3型者的最多,占65%;其次为3/4型,占18%;2/3型占 8.0%。2、SCA1患者的发病年龄的范围在13～63岁,平均值为37.98±10.17;异常扩增的ATXN1等位基因的CAG重复次数范围在41～72次,均值为49.74±6.35。3、SCA1患者异常CAG重复次数对患者的发病年龄有显着的影响（异常等位基因的扩展重复次数:P=0.000）,但只能解释12.40%的变化率（R2=0.124）。患者的性别、APOE基因型和等位基因对发病年龄的影响不显着（性别:P=0.539;E2型等位基因:P=0.272;E3型等位基因:P=0.123）;患者的性别与异常CAG重复次数的交互作用,对发病年龄的影响也不显着（P=0.516）。4、SCA1患者异常CAG重复次数对患者发病年龄的回归方程:患者异常CAG重复次数与患者的发病年龄呈负相关关系。（二）SCA2:1、SCA2患者中,APOE3/3型者的最多,占91%;其次为2/3型,占6.0%;3/4型占3.0%,未检测到2/2型、2/4型和4/4型。2、所有SCA2患者的发病年龄范围在6～60岁,均值为27.10±9.54。异常扩增的ATXN3等位基因的CAG重复范围在33～51次,均值为37.00±3.78。3、SCA2患者异常CAG重复次数对发病年龄的有显着影响（P=7.76e-11）,但也只能解释42.07%的变化率（R2=0.420）,患者的性别、APOE基因型和等位基因对发病年龄的影响不显着（性别:P=0.705;E2型等位基因:P=0.634;E3型等位基因:P=0.776）;患者的性别与异常CAG重复次数的交互作用,对发病年龄的影响也不显着（P=0.750）。4、SCA2患者异常CAG重复次数对患者发病年龄的回归方程:患者异常CAG重复次数与患者的发病年龄呈负相关关系。（三）SCA3:1、SCA3患者中,APOE3/3型者的最多,占65%;其次为3/4型,占18%;2/3型占 12%。2、SCA3患者发病年龄范围在8～62岁,均值为34.34±10.05;异常扩增的ATXN3等位基因的平均CAG重复次数范围在57～82次,均值为71.34±3.19。3、SCA3患者异常CAG重复次数对发病年龄有显着影响（异常CAG重复次数:P<2e-16）,大约能够解释59.90%的患病年龄的变化（R2=0.599）。患者的性别、APOE基因型和等位基因对发病年龄的影响不显着（性别:P=0.451;E2型等位基因:P=0.772;E3型等位基因:P=0.479）,性别和异常CAG重复次数的交互作用,对发病年龄的影响也不显着（P=0.416）。4、SCA3患者的异常CAG重复次数对患者发病年龄的回归方程:y = 209.1615-2.4505x1 + ε患者的异常CAG重复次数与发病年龄呈负相关关系。结论:1、SCA1、SCA2、SCA3患者的发病年龄,均与CAG的异常重复次数呈负相关。重复次数越高,发病年龄越低,但只能解释部分的发病年龄变异率。2、SCA1、SCA2、SCA3患者的发病年龄,与患者的性别,APOE等位基因,APOE基因型,性别与异常CAG重复次数的交互作用,无显着相关性。
丁曼[8]（2017）在《Ankfy1突变参与Charlevoix-Saguenay常染色体隐性痉挛性共济失调（ARSACS）发生及其机制研究》文中研究说明背景（1）遗传性共济失调根据其遗传模式分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁遗传和线粒体遗传。常染色体隐性遗传性小脑共济失调（ARCA）属于一种具有遗传异质性的神经退行性疾病。主要包括Friedreich共济失调、共济失调毛细血管扩张症、维生素E缺乏性共济失调、Charlevoix-Saguenay常染色体隐性痉挛性共济失调（ARSACS）、脂蛋白缺乏症以及1型和2型动眼神经失用性共济失调。（2）遗传性共济失调具有临床及遗传异质性,属于进展性神经退行性疾病的一种,可引起共济失调步态、构音障碍及其他神经系统体征,包括锥体系体征、锥体外系体征、眼球运动障碍及认知功能障碍等。致病机制中最常见的原因为三核苷酸CAG重复序列扩增,可引起细胞内聚集相应蛋白编码的多聚谷氨酰胺链;第二类常见原因为非编码核苷酸序列扩增,此类包括20余种不同致病基因。即便如此,仍有40%的遗传性共济失调个体病因多样化、原因不明确。因此,加强遗传性共济失调病因学及神经生物学研究,有助于发现治疗此类疾病的药物新靶标,并对提高人类生活质量和健康水平有重要意义。目的（1）本研究旨在揭示Ankfy1突变对小鼠共济失调行为学的影响,探索共济失调发病的新机制。（2）通过研究Ankfy1对Purkinje细胞的功能调节,揭示Purkinje细胞退行性改变在共济失调发病途径中的作用。（3）本研究为探索Purkinje细胞丢失的机制研究,为共济失调新药物研发提供理论依据。方法（1）Ankfy1在C67/B6野生型小鼠中枢神经系统（CNS）的表达:利用原位杂交方法检测Ankfy1 mRNA在不同时间点野生型小鼠CNS的表达特点;利用RT-qPCR方法检测Ankfy1在成年野生型小鼠不同组织器官内的表达;利用免疫荧光方法检测Ankfy1在小脑Purkinje细胞内的表达特点;利用western blot方法检测Ankfy1在成年野生型小鼠不同组织器官内的蛋白表达并量化分析蛋白表达量。（2）动物模型制作及行为学分析:利用基因捕获技术制作转基因小鼠动物模型;利用PCR方法进行小鼠基因型鉴定;利用western blot方法及RT-qPCR方法分别检测Ankfy1/+小鼠小脑内目的基因蛋白及mRNA的表达量;利用转棒实验、步态印迹实验分析小鼠行为学改变。（3）Ankfy1/+小鼠组织病理学改变:利用免疫荧光方法检测小鼠小脑组织Ankfy1及Calbindin-28k的表达特点;利用H&E染色小脑组织,分析Purkinje细胞数量改变情况;利用免疫荧光方法检测野生型（WT）和Ankfy1/+小鼠的小脑、黑质及前庭神经核胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达;利用依莱铬氰染色小脑、脊髓及胼胝体的髓鞘组织,并量化分析实验组及对照组胼胝体厚度;利用RT-qPCR方法检测MBP mRNA及RORa mRNA的表达差异;利用RT-qPCR方法检测P7、P14、P21及P30小鼠的小脑中BDNF、MANF和NT-3的mRNA表达水平。（4）体外培养Purkinje细胞进行形态学分析:体外培养Purkinje细胞,利用免疫荧光染色方法染色细胞;利用Sholl分析软件、Bonfire程序、ImageJ和NeuronStudio的NeuronJ插件及MATLAB（MathWorks）软件进行Purkinje细胞形态学分析。（5）Ankfy1下调影响凋亡的检测:利用TUNEL方法检测Ankfy1/+小鼠及WT小鼠小脑组织;利用western blot方法检测Ankfy1/+小鼠小脑凋亡相关蛋白表达;培养A172、SH-SY5Y细胞,利用Ankfy1 shRNA干扰细胞内目的基因的表达;利用western blot方法检测Ankfy1下调后,A172细胞内凋亡相关蛋白表达;利用western blot方法检测Ankfy1下调后,A172细胞内Akt及p-Akt的表达。结果（1）通过原位杂交实验研究发现,Ankfy1mRNA主要在脊髓、海马及小脑内特异性表达。体外培养Purkinje细胞,利用免疫荧光进行Ankfy1与Calbindin荧光双染,发现Ankfy1特异性表达于Purkinje细胞的胞体、树突及轴突,且主要表达于Purkinje细胞胞体的周边。利用基因捕获技术获得Ankfy1/+转基因小鼠,但未发现全基因突变小鼠,且杂合型小鼠与野生型小鼠数量比例符合子孟德尔定律,说明Ankfy1全基因敲除小鼠具有胚胎致死性。利用RT-qPCR及western blot检测方法检测Ankfy1表达,发现Ankfy1/+转基因小鼠目的基因的mRNA及蛋白表达量均降低。Ankfy1/+转基因小鼠疾病早期出现运动协调功能异常及肌张力障碍表型。（2）Ankfy1/+小鼠从60天开始小脑Purkinje细胞出现严重丢失,且转基因小鼠的共济失调步态异常表型出现早期,并未出现Purkinje细胞的大量丢失。Ankfy1/+小鼠胶质化表现,可能为Purjinje细胞丢失的一种保护机制。Ankfy1/+小鼠与WT小鼠髓鞘组织无差异,MBP表达量差异无统计学意义,说明Ankfy1/+小鼠未出现脱髓鞘改变。Ankfy1的突变影响小鼠中的BDNF、NT-3及MANF表达;Ankfy1的表达降低减少MANF及BDNF在ARSACS疾病动物模型中的表达,二者可能参与维持Purkinje细胞存活。（3）Ankfy1/+转基因小鼠Purkinje细胞出现轴突肿胀,较WT小鼠细胞更易受损。在距离Purkinje细胞胞体相同位置上,Ankfy1/+转基因小鼠Purkinje细胞树突分枝数量更少。Ankfy1/+小鼠单个Purkinje细胞树突总长度及总数量、树突总分枝点数量及总树突终末点数量明显低于WT小鼠的Purkinje细胞。Ankfy1/+小鼠及WT小鼠Purkinje细胞树突根部长度之间的差异不明显,而树突中间部分及终末部分明显少于WT小鼠。（4）Ankfy1/+转基因小鼠Purkinje细胞发生凋亡,且caspase 3及cleaved caspase 3表达升高。下调A172细胞内的Ankfy1水平后,细胞发生凋亡,且cleaved caspase 3及caspase 8的表达水平升高。下调A172细胞及SH-SY5Y细胞内的Ankfy1对细胞增殖没有影响。结论（1）Ankfy1在小鼠体内广泛表达,在CNS主要表达于脊髓、海马及小脑,且特异性表达于小脑Purkinje细胞内。（2）下调小鼠体内的Ankfy1水平后,小鼠出现运动协调障碍表型。（3）Ankfy1/+小鼠异常表型与Purkinje细胞丢失相关。（4）体外培养Ankfy1/+小鼠Purkinje细胞,出现树突长度及分枝数量的减少,以及轴突肿胀,说明在Purkinje细胞丢失前已经发生了形态学改变。（5）Purkinje细胞的丢失与凋亡信号通路相关。（6）Ankfy1/+小鼠体内神经营养因子表达异常,且由PI3K/Akt信号通路参与调控。
王东浩,黄艳梅,杨保胜[9]（2016）在《脊髓小脑性共济失调的基因诊断及治疗研究进展》文中研究指明脊髓小脑性共济失调（SCAs）是一类常染色体显性遗传的神经退行性疾病,临床表现异质性大,分型困难。目前通过基因诊断可以确诊SCAs致病亚型,但仍有多数SCAs亚型致病基因未被发现和归类,发病机制暂不明确。为了完善SCAs致病基因信息,提供较为规范的基因诊断流程和治疗方案,本文就SCAs基因诊断的特点及流程、发病机制、临床治疗方案等方面进行系统总结,以展现SCAs基因诊断及治疗研究现况。
徐献群,余丹,杜鹏辉,彭春艳,肖劲松[10]（2016）在《4个脊髓小脑性共济失调家系的基因诊断与鉴别诊断》文中认为目的:探讨4个脊髓小脑性共济失调（SCA）家系的临床特征、基因诊断和鉴别诊断。方法:采用聚合酶链式反应（PCR）和琼脂糖凝胶电泳等技术对临床诊断为脊髓小脑性共济失调的4个家系8例患者及8名健康对照者进行相关SCA基因的诊断与分析,对异常等位基因片段进行DNA测序观察CAG三核苷酸重复次数,分析临床表现与基因突变的关系。结果:证实4个SCA家系分别为SCA1,SCA2,SCA3,SCA7亚型家系,4例先证者致病基因ATXN内CAG重复数分别为48次、43次、61次、63次。结论:基因检测确定4个SCA家系的亚型,其致病原因均为ATXN基因内CAG三核苷酸的重复异常扩增,基因检测有助于SCA诊断与分型。
二、脊髓小脑性共济失调的分子生物学发病机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脊髓小脑性共济失调的分子生物学发病机制（论文提纲范文）
（1）EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 神经退行性疾病国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 Emc3基因研究历史与现状 |
| 1.2.2 神经退行性疾病发病种类和机制研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.3.1 主要贡献 |
| 1.3.2 创新 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 EMC3基因在神经退行性疾病发病机制的功能研究 |
| 2.1 课题背景 |
| 2.1.1 脑神经元病变 |
| 2.1.2 视网膜神经元病变 |
| 2.2 选题依据 |
| 2.2.1 EMC1基因突变导致脑和视网膜退行性疾病 |
| 2.2.2 EMC3是果蝇感光细胞合成视紫红质和多通道膜蛋白所必需 |
| 2.2.3 EMC3和EMC1 是以复合物形式存在 |
| 2.3 研究背景 |
| 2.3.1 内质网相关蛋白的合成和降解途径 |
| 2.3.2 内质网应激介导的非折叠蛋白应答途径 |
| 2.4 研究流程和关键技术 |
| 2.5 前期研究 |
| 2.5.1 已经报道的EMC1突变进行WB分析 |
| 2.5.2 EMC3在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.3 EMC5在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.4 内质网膜蛋白复合物亚基免疫共沉淀及WB检测 |
| 2.6 展望未来 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 Emc3缺失导致小脑共济失调和浦肯野细胞变性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验技术原理 |
| 3.2.2 实验所用材料 |
| 3.2.3 实验所用方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9-lox P系统构建Emc3 基因敲除小鼠模型 |
| 3.3.2 利用PCR技术对Emc3 CKO小鼠DNA进行基因分型 |
| 3.3.3 Emc3 CKO条件性敲除小鼠生长发育异常 |
| 3.3.4 Emc3 CKO条件敲除型小鼠小脑发育异常 |
| 3.3.5 Emc3 CKO条件敲除型小鼠行为学异常 |
| 3.3.6 Emc3 CKO条件型敲除小鼠的磁共振成像 |
| 3.3.7 Emc3 CKO条件型敲除小鼠进行性小脑萎缩和浦肯野细胞丢失 |
| 3.3.8 Emc3 CKO条件敲除型小鼠浦肯野细胞变性和星形胶质细胞增生 |
| 3.3.9 Emc3 CKO小鼠浦肯野细胞中Emc3 的缺失导致内质网应激 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 浦肯野细胞Emc3缺失影响小鼠的运动协调能力 |
| 3.4.2 星形胶质细胞激活与浦肯野细胞死亡的关系 |
| 3.4.3 浦肯野细胞Emc3缺失怎样激发内质网应激 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Emc3的丢失导致视网膜杆状双极细胞变性 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 实验材料和方法 |
| 4.3.1 实验技术原理 |
| 4.3.2 实验所用材料 |
| 4.3.3 实验所用方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Emc3在视网膜上的表达定位 |
| 4.4.2 Emc3 CKO小鼠Emc3 表达水平降低 |
| 4.4.3 Emc3 CKO小鼠视网膜的生理功能分析 |
| 4.4.4 PKCα抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.5 感光细胞抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.6 免疫组化和H&E染色结果 |
| 4.4.7 Emc3缺失损害视杆细胞和视杆双极细胞之间的突触传递 |
| 4.4.8 Emc3 CKO视网膜中的反应性神经胶质增生 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 玻璃体视网膜病变FZD4和NDP基因突变研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 伦理声明 |
| 5.2.2 全外显子组测序和变异确认 |
| 5.2.3 表达质粒的构建 |
| 5.2.4 荧光素酶报告分析 |
| 5.2.5 FZD4在细胞中的表达研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 测序结果分析 |
| 5.3.2 突变FZD4 蛋白介导的Norrin信号缺陷 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写表 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（2）癫痫血浆蛋白质组学分析及相关基因功能鉴定（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 癫痫概况 |
| 1.2 本文工作 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 癫痫血浆蛋白质组学分析 |
| 2.1.1 蛋白质组学技术简介 |
| 2.1.2 人类癫痫蛋白质组学研究概况 |
| 2.1.3 儿童Rolandic癫痫概述 |
| 2.2 癫痫相关基因功能鉴定 |
| 2.2.1 进行性肌阵挛癫痫病因学研究概况 |
| 2.2.2 CACNA1A基因突变引起神经系统疾病的研究概况 |
| 2.2.3 电压依赖性钙通道蛋白突变引起细胞功能障碍的机制 |
| 第3章 儿童Rolandic癫痫血浆TMT定量蛋白质组学分析 |
| 3.1 本章提要 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 纳入标准 |
| 3.3.2 排除标准 |
| 3.3.3 血浆采集 |
| 3.3.4 蛋白提取 |
| 3.3.5 胰酶酶解 |
| 3.3.6 TMT标记 |
| 3.3.7 HPLC分级 |
| 3.3.8 液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)分析 |
| 3.3.9 数据库搜索 |
| 3.3.10 质谱质控检测 |
| 3.3.11 生物信息学分析 |
| 3.3.12 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 TMT定量蛋白质组学初始数据分析及蛋白鉴定 |
| 3.4.2 差异表达蛋白(DEP)的筛选 |
| 3.4.3 差异表达蛋白(DEP)的GO分析 |
| 3.4.4 差异表达蛋白(DEP)的KEGG通路分析 |
| 3.4.5 蛋白互作(PPI)网络的构建 |
| 3.4.6 差异表达蛋白的核心基因筛选 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 主要上调差异表达蛋白的功能分析 |
| 3.5.2 主要下调差异表达蛋白的功能分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章PME基因CACNA1A中CAG扩增突变引起SH-SY5Y细胞凋亡的机制研究 |
| 4.1 本章提要 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞系 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 质粒及序列合成 |
| 4.3.2 细胞培养 |
| 4.3.3 质粒及GFP融合蛋白基因构建 |
| 4.3.4 蛋白结构预测 |
| 4.3.5 细胞转染 |
| 4.3.6 RNA提取、逆转录反应及实时定量PCR(q PCR) |
| 4.3.7 细胞增殖检测 |
| 4.3.8 细胞周期及凋亡检测 |
| 4.3.9 蛋白提取 |
| 4.3.10 免疫印迹(Western blot) |
| 4.3.11 免疫荧光及DAPI染色 |
| 4.3.12 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Cav2.1mt(26 poly Q)抑制SH-SY5Y细胞增殖 |
| 4.4.2 Cav2.1 各种截短突变型分子的生物学功能分析 |
| 4.4.3 Cav2.1wt、Cav2.1mt、Cav2.1dm3 对SH-SY5Y细胞周期分布的影响 |
| 4.4.4 Cav2.1 截短突变促进SH-SY5Y细胞凋亡 |
| 4.4.5 Cav2.1 截短突变在SH-SY5Y细胞内的核转移 |
| 4.4.6 Cav2.1 截短突变通过Bcl-2/Bax-Caspase3-PARP信号途径诱导SH-SY5Y细胞凋亡 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 创新点以及展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）CHIP蛋白参与脊髓小脑共济失调3型的发病机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要中英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 SCA3疾病模型中CHIP蛋白水平改变及其机制研究 |
| 背景 |
| 目的 |
| 第一章 SCA3相关细胞系的构建及ATAXIN 3扩增突变对细胞活力及凋亡的影响 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 第二章 CHIP在SCA3动物及细胞中的蛋白及转录水平改变 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 第三章 SCA3疾病模型中CHIP蛋白的降解与分布改变 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 第四章 重编程SCA3患者来源的皮肤成纤维细胞所得神经干细胞中CHIP蛋白水平的改变 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 本部分讨论 |
| 本部分小结 |
| 第二部分 CHIP蛋白降低导致SCA3细胞热应激不耐受及分子机制 |
| 背景 |
| 目的 |
| 第一章 SCA3相关细胞系的热应激不耐受及相关分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 第二章 过表达CHIP蛋白对SCA3细胞模型的保护作用 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料与方法 |
| 4 结果 |
| 本部分讨论 |
| 本部分小结 |
| 第三部分 CHIP蛋白水平在SCA3患者血清中的改变 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的 |
| 3 材料方法 |
| 4 结果 |
| 5 本部分讨论 |
| 6 本部分小结 |
| 全文讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脊髓小脑共济失调3型的发病机制及CHIP蛋白对神经退行性疾病的治疗策略研究进展 |
| 1 SCA3的研究进展 |
| 2 CHIP蛋白在神经退行性疾病中的研究 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 博士在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（4）CAG重复长度与脊髓小脑性共济3型发病年龄相关性的meta分析（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）SCA3小鼠的脑电研究和生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分：脊髓小脑性共济失调3型小鼠的脑电研究 |
| 1 前言与背景 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分：SCA3小鼠差异性表达基因mRNA的生物信息学分析 |
| 1 前言与背景 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分：脊髓小脑共济失调3型差异表达microRNAs的生物信息学分析 |
| 1 前言与背景 |
| 2 实验材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（6）脊髓小脑性共济失调3型小鼠学习记忆的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分：AVP对SCA3小鼠的学习和记忆的影响 |
| 1 前言与背景 |
| 2 资料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分：不同月龄下SCA3小鼠学习记忆的发展和AVP含量的关系 |
| 1 前言与背景 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分：硫氢化钠对SCA3小鼠海马的影响 |
| 1 前言与背景 |
| 2 资料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 AVP与SCA患者认知功能障碍相关性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）SCA1、SCA2、SCA3发病年龄与APOE等位基因相关性及中医辨证探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 APOE基因多态性与多种神经退行性疾病关系的研究 |
| APOE的结构 |
| APOE的多态性 |
| APOE的生理功能 |
| APOE的分布 |
| APOE与阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD) |
| APOE与心血管疾病(Coronary heart disease, CHD) |
| APOE与亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease, HD) |
| APOE与肌张力障碍(Dystonia, DTY) |
| APOE与帕金森病(Parkinson's disease, PD) |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 脊髓小脑共济失调的临床研究 |
| SCA的分子生物学机制研究 |
| SCA的临床特征 |
| SCA的基因型和表型特征 |
| SCA诊断 |
| SCA治疗 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 中篇 实验研究 |
| 前言 |
| 1 研究对象 |
| 2 主要实验材料、器械及仪器 |
| 3 实验方法 |
| 4 统计方法 |
| 5 统计结果 |
| 6 结论 |
| 7 讨论 |
| 参考文献 |
| 下篇 脊髓小脑共济失调中西医结合临床实践 |
| 痿躄 |
| 颤证 |
| 骨摇 |
| 从肾论治 |
| 从肝论治 |
| 从脾论治 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 简历 |
（8）Ankfy1突变参与Charlevoix-Saguenay常染色体隐性痉挛性共济失调（ARSACS）发生及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstracts |
| 引言 |
| 第一部分 Ankfy1的表达特点及ARSACS动物模型制作 |
| 前言 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 Ankfy1/+小鼠共济失调行为学、Purkinje细胞丢失及胶质化 |
| 前言 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 Ankfy1下调Purkinje细胞形态学影响 |
| 前言 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 Ankfy1/+小鼠Purkinje细胞丢失的机制研究 |
| 前言 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）脊髓小脑性共济失调的基因诊断及治疗研究进展（论文提纲范文）
| 1 SCAs基因诊断的特点及流程 |
| 1.1 SCAs分子分型及基因学特点 |
| 1.2 SCAs基因诊断筛查流程 |
| 2 SCAs致病机制假说 |
| 3 SCAs临床治疗方案 |
| 3.1 临床对症治疗 |
| 3.2 其他药物治疗 |
| 3.3 基因治疗及神经干细胞移植 |
| 3.4 其他辅助治疗 |
| 3.5 预防措施 |
| 4 展望 |
（10）4个脊髓小脑性共济失调家系的基因诊断与鉴别诊断（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 基因组DNA提取 |
| 1.2.2 SCAs不同基因亚型三核苷酸重复片段PCR扩增及产物测序 |
| 2 结果 |
| 2.1 SCA家系患者临床资料 |
| 2.1.1 家系1 |
| 2.2 检测结果 |
| 2.2.1 PCR产物电泳结果 |
| 2.2.2 4个家系重复序列结果 |
| 3 讨论 |
四、脊髓小脑性共济失调的分子生物学发病机制（论文参考文献）
- [1]EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究[D]. 朱雄. 电子科技大学, 2020(03)
- [2]癫痫血浆蛋白质组学分析及相关基因功能鉴定[D]. 孙觊. 吉林大学, 2020(08)
- [3]CHIP蛋白参与脊髓小脑共济失调3型的发病机制研究[D]. 唐秘博. 郑州大学, 2020(02)
- [4]CAG重复长度与脊髓小脑性共济3型发病年龄相关性的meta分析[D]. 余立丹. 昆明医科大学, 2018(01)
- [5]SCA3小鼠的脑电研究和生物信息学分析[D]. 潘登. 郑州大学, 2017(05)
- [6]脊髓小脑性共济失调3型小鼠学习记忆的机制研究[D]. 姜洪波. 郑州大学, 2017(05)
- [7]SCA1、SCA2、SCA3发病年龄与APOE等位基因相关性及中医辨证探索[D]. 谢坤铭. 北京中医药大学, 2017(08)
- [8]Ankfy1突变参与Charlevoix-Saguenay常染色体隐性痉挛性共济失调（ARSACS）发生及其机制研究[D]. 丁曼. 武汉大学, 2017(06)
- [9]脊髓小脑性共济失调的基因诊断及治疗研究进展[J]. 王东浩,黄艳梅,杨保胜. 新乡医学院学报, 2016(07)
- [10]4个脊髓小脑性共济失调家系的基因诊断与鉴别诊断[J]. 徐献群,余丹,杜鹏辉,彭春艳,肖劲松. 临床血液学杂志, 2016(06)