一、不同抗性型灰葡萄孢菌Botrytis cinerea对不同作用机制杀菌剂的敏感性研究(论文文献综述)
杨蕊[1](2021)在《灰葡萄孢自然群体交配型鉴定及有性生殖引起的遗传变异分析》文中指出灰葡萄孢(Botrytis cinerea)作为重要病原菌,寄主植物达1400多种,引起作物采前采后灰霉病,造成重大经济损失。灰葡萄孢属于异宗配合真菌,含有两种交配型,有性阶段形成子囊盘和子囊孢子。但是,在自然条件下,灰葡萄孢以无性繁殖为主,而有性繁殖则不常见。了解病原菌的生活史和繁殖方式对控制植物病害流行和危害具有重要意义。有性生殖产生遗传多样性,限制有害突变积累,有利于物种生存。灰葡萄孢群体变异较大,存在大量个体单倍型和营养体亲合群(vegetative compatibility groups,VCGs),暗示其可能通过有性繁殖发生遗传重组,但缺乏直接的试验证据。目前对灰葡萄孢变异研究集中在无性繁殖变异方面,包括突变、基因水平转移等。对灰葡萄孢交配型(Mating type)基因功能的认识多集中于对有性生殖转录调节的影响,是否有其它功能(如生长发育、致病性及杀菌剂敏感性等)目前还不知晓。保护地栽培的作物(如草莓和番茄)处于适温高湿的环境中,适合灰葡萄孢发生。目前,对于保护地草莓和番茄灰葡萄孢群体有性繁殖潜力还不清楚。针对上述问题,本论文对保护地草莓和番茄灰葡萄孢群体交配型进行鉴定,对交配型基因MAT1-1-1基因功能进行研究,并分析了有性生殖对灰葡萄孢遗传变异的影响。取得研究结果如下:1.明确了湖北省保护地草莓和番茄等作物上的灰葡萄孢群体的交配型构成采用多重PCR方法对706株分离自湖北省保护地草莓和番茄上的B.cinerea菌株的交配型进行了鉴定。研究结果发现,MAT1-1和MAT1-2两种交配型的菌株共同存在于保护地灰葡萄孢群体中。湖北省草莓和番茄B.cinerea群体总体两种交配型的分布偏离1:1比例(χ2=13.60,P=0.0002,df=1),MAT1-2型占据优势地位(56.9%)。另外,对湖北B.cinerea群体进一步分析发现,草莓群体和番茄群体两种交配型的分布存在显着差异,草莓群体交配型分布符合1:1比例(χ2=0.01,P=0.9151,df=1),而番茄群体分布则不符合1:1比例(χ2=26.03,P<0.0001,df=1);不同地区间,两种交配型分布比例也存在显着差异,在源于湖北12个市(县)的12个灰葡萄孢亚群体中,7个亚群体交配型分布符合1:1比例,5个亚群体(荆门亚群体、荆州亚群体、仙桃亚群体、孝感亚群体和宜昌亚群体)交配型分布比例偏离1:1。这些结果表明,保护地草莓和番茄灰葡萄孢部分群体可能存在有性生殖。2.明确了交配型基因BcMAT1-1-1在子囊盘产生中的作用以灰葡萄孢野生型菌株B05.10为基础,采用同源重组技术,敲除交配型基因BcMAT1-1-1,获得BcMAT1-1-1缺失突变体菌株,并从有性发育、生物学特性、致病力以及药剂敏感性等方面对BcMAT1-1-1基因功能进行分析。结果表明:ΔBcMAT1-1-1突变体在菌落形态(菌丝、菌核、大型和小型分生孢子)、菌丝生长速度、大型分生孢子和菌核产生量、孢子萌发率以及致病力等方面与野生型菌株没有显着差异。但是,BcMAT1-1-1对于灰葡萄孢有性生殖非常重要。以ΔBcMAT1-1-1菌株为母本(♀)或父本(♂),所测试交配组合均不能产生子囊盘柄和子囊盘。3.明确了灰葡萄孢有性生殖对其遗传变异的影响以黑色菌核(black sclerotia,简称B)菌株HBtom544(MAT1-2,♀)和黄色菌核(Yellow sclerotia,简称Y)菌株HBstr494(MAT1-1,♂)的交配组合(BY组合)以及B菌株HBtom544(♀)和B菌株B05.10(MAT1-1,♂)的交配组合(BB组合),在实验室条件下诱导子囊盘及子囊孢子产生。从BY组合中获得了57个单子囊孢子杂交后代,从BB组合中获得了32个单子囊孢子杂交后代。采用菌落形态观察(菌丝、大型分生孢子、菌核),交配型基因检测,菌丝亲合群(mycelial compatibility group,MCG)测定,菌丝生长速度测定,致病力,以及药剂敏感性测定等方法,评估子囊孢子后代的变异。(1)灰葡萄孢有性生殖子代菌株,在菌核产生、颜色和菌落形态上表现出多样性。BB后代菌株均产生黑色菌核,而BY后代菌株中出现黑色和黄色2种类型的菌核。这些子代菌株菌落形态类型可分为8种(3种菌丝型,5种菌核型)。BB后代发现4种菌核型(S2~S5),以S3亚型为主(46.9%)。BY后代发现3种菌丝型(M1、M3和M4),菌丝型中以M1亚型居多(38.6%);菌核型存在5种(S1~S5),以S2亚型为主(26.3%)。(2)MAT1-1和MAT1-2两种交配类型在有性生殖子代群体中普遍存在,且分布比例符合1:1。在BY后代群体中(n=57),MAT1-1交配类型有30株,MAT1-2型有27株,符合1:1比例(χ2=0.16,P=0.6911,df=1);在BB后代群体中(n=32),MAT1-1交配类型有15株和MAT1-2交配类型有17株,符合1:1比例(χ2=0.13,P=0.7237,df=1)。(3)有性生殖子代菌株在菌丝亲和群(MCG)上出现多样性分化。大多数菌株在菌丝接触时出现明显的拮抗作用,菌落接触区域出现深色色素沉积线或菌丝稀疏透明地带,表现出菌丝不亲和性。BB组合32个子代菌株分为12个菌丝亲合群(MCG 1BB~12BB),其中,优势亲和群为MCG 4BB,含6个菌株,其他菌丝亲和群则含有1~5个菌株,91.9%的菌株是不亲和的;BY组合57个子代菌株分为7个其它菌丝融合群(MCG1BY~7BY),其中,MCG 1BY、MCG 2BY和MCG 4BY分别含有16、15、和13个菌株,其他菌丝亲和群则含有1~5个菌株,79.8%的菌株是不亲和的。香农指数(H)和辛普森指数(D)多样性指数分析表明,BB组合后代(H=2.6630,D=0.8945)的多样性水平高于BY组合后代(H=1.6709,D=0.7842)。(4)有性生殖子代菌株在生长速率、致病力和药剂敏感性上表现出多样性。亲本菌株均为中等致病力菌株,而有性生殖后代菌株中出现了强、弱致病力菌株的分化,尤其在BY组合后代这种分化现象更加明显,弱致病力菌株出现的频率达到53.4%。所有亲本和单子囊孢子后代菌株对杀菌剂氟啶胺和咯菌腈都表现敏感性,但是菌株间敏感程度存在差异。对BY亲本和子代菌株的咯菌腈靶标基因Bos1氨基酸序列分析发现:父本菌株HBstr494存在P1186L和A1259T 2个点突变位,母本菌株HBtom544存在I926T和A1259T 2个突变位点,但子代菌株则出现了更多的突变位点,其中A1259T在亲本和子代菌株中均有发现。这些结果表明有性生殖对灰葡萄孢遗传变异具有重要作用。上述研究结果为认识保护地番茄和草莓上的灰葡萄孢群体结构、繁殖方式以及变异机制提供了线索。
李晓宇[2](2021)在《番茄中灰霉菌小种Taian致病力的探究》文中研究表明灰霉病(Gray mold)是一种重要的死体营养型真菌病害,在全球范围内发生,严重危害了多种经济作物。番茄是重要的经济作物,在生产过程中易遭受多种病原菌的侵害。灰霉菌对设施栽培番茄的危害尤其严重,是影响番茄产量和品质的关键病害之一。灰霉菌(Botrytis cinerea)寄主范围广、生理小种多,这增加了番茄抗病育种的难度,目前在番茄中仍未找到有效抗源。比较生理小种的致病力差异,解析灰霉菌的发病机理是阐明植物抗性机理和进行抗性育种的前提。为此,我们分离了新的灰霉菌小种,并在此基础上对它和参考菌株B05.10进行了致病力的比较。首先,从泰安地区感染灰霉病的番茄叶片中分离病原,通过ITS测序和人工接种确定分离到的病原菌为新的灰霉菌小种,命名为Taian。我们将Taian菌株与灰霉菌模式菌株B05.10进行了形态结构和生理特性上的对比。结果表明,Taian和B05.10的菌丝生长速率相似;在菌落形态和孢子形态上,Taian与B05.10具有明显差异;在产孢量上,Taian与B05.10相比产孢量较低。这些结果表明,Taian和B05.10存在遗传背景差异。实验室在前期已建立起成熟的灰霉菌接种体系,我们利用栽培番茄M82、CM、AC、MM,通过侵染离体番茄叶片的方式对两小种致病力进行测定。结果表明,与B05.10菌株相比,Taian菌株在番茄中的致病力较弱。且两个灰霉菌小种的致病力均受到宿主遗传背景影响。茉莉酸信号通路介导的植物免疫反应是植物防御死体营养型病原菌的重要机制。为了确定Taian和B05.10两灰霉菌小种的致病力与番茄中JA诱导抗性的关系,我们利用两灰霉菌小种分别对JA合成受阻突变体spr2和spr8进行接种实验。结果表明,被灰霉菌小种侵染后,spr2和spr8与其背景型相比更易感病。荧光定量PCR结果显示,灰霉菌侵染后,正常植物中JA响应基因PI-II和PR-STH2表达均被强烈诱导,而spr2中两基因的表达明显被抑制。上述结果表明,番茄对灰霉菌的免疫反应依赖于植物的JA信号传导。为了进一步探寻灰霉菌株Taian和B05.10的致病力差异是否与植物的JA信号通路相关,我们对M82与AC进行50μM JA预处理。外源JA处理后,两个灰霉菌小种均显着诱导了PI-II基因的转录表达。在M82中,外源JA处理后,植物对两个灰霉菌小种的抗性均显着增强。而在AC植株中,JA处理没有诱导植物对B05.10的抗性,但是显着增强了植物对Taian小种的抗性。本研究的结果表明,灰霉菌与番茄的互作机制在不同遗传背景的番茄(如AC和M82)中存在差异。AC中JA诱导的抗性反应不同于M82中JA诱导的抗性,这一差异和植物防御灰霉菌有关。Taian与B05.10小种在M82中致病力差异显着,而在AC中两个小种致病力差异不明显。这表明灰霉菌与番茄的互作和植物中JA诱导的抗性反应密切相关。本研究通过分析灰霉菌种和番茄种之间致病力的差异,为解析灰霉菌-番茄互作的分子机制提供了线索,为番茄抗病育种工作提供了理论依据。
高杨杨[3](2021)在《琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂对炭疽病菌的毒力差异机制》文中研究说明琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂作为世界第三大类杀菌剂,以其结构新颖、高活性、抑菌谱广等特点吸引了全球各大公司及科研单位的广泛关注。该类杀菌剂初期品种少抑菌谱较窄主要防治担子菌引起的病害,以第三代SDHI类杀菌剂啶酰菌胺为转折点后期开发的品种均具有广谱抑菌活性。实验室前期研究发现,新的SDHI类杀菌剂对不同种类甚至同一种类不同种间病原真菌的抑制活性差异大,原因及规律尚不明确,而进一步明晰该类药剂活性分子结构群与靶标群的作用模式可为广谱高效新药剂的研发指明方向。因此,围绕上述问题,比较了6种典型SDHI类杀菌剂的抑菌谱及田间防治炭疽病效果,系统评估了SDHI类杀菌剂与SDHA/B/C/D亚基的结合模式,探究了药剂与SDHB/C/D亚基结合偏好性,分析SDHI类药剂对病原菌菌体的膜渗透性能,从靶标和非靶标两方面系统阐述SDHI类杀菌剂的抑菌活性差异机制。主要研究结果如下:1.SDHI类杀菌剂抑菌谱差异大室内毒力结果发现6种典型SDHI类药剂对19种病原真菌表现生物选择活性。仅苯并烯氟菌唑对不同炭疽菌表现优异的抑制活性EC50<1.27 mg/L,吡唑萘菌胺和氟唑菌酰胺仅对炭疽菌的菌丝生长表现中等的抑制活性EC50<20.71 mg/L、对其他生长阶段EC50>500 mg/L,而炭疽菌对氟唑菌酰羟胺、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺表现天然不敏感,各生长阶段EC50>500 mg/L。离体活体试验和田间试验中苯并烯氟菌唑和吡唑萘菌胺180 g a.i./ha具有较高的潜力防治田间作物炭疽病。SDHI类杀菌剂中氟吡菌酰胺和啶酰菌胺对稻梨孢菌、贝格伦葡萄座腔菌和镰孢菌抑制活性低甚至无抑制活性,该敏感性结果与炭疽菌反应一致。SDHI类杀菌剂对灰葡萄孢菌、核盘菌、多主棒孢霉、黄褐孢霉菌、美澳型核果褐腐菌、菊池链格孢等病原真菌各生长阶段抑制活性均较高EC50<7.79 mg/L。其中吡唑酰胺类药剂的抑菌活性高于吡啶酰胺类和吡啶乙基苯甲酰胺类药剂。2.SDHI类杀菌剂对病原菌线粒体功能的影响与其抑菌活性呈正相关SDHI类杀菌剂中苯并烯氟菌唑对胶孢炭疽菌呼吸速率、线粒体活力、ATP含量和膜电位抑制作用最强。炭疽菌呼吸速率呈现先增加后降低的趋势,经高浓度处理后,苯并烯氟菌唑可显着抑制炭疽菌的呼吸速率且随着时间延长抑制率逐渐升高,其次吡唑萘菌胺和氟唑菌酰胺对炭疽菌呼吸速率的抑制活性略低于苯并烯氟菌唑,氟唑菌酰羟胺、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺对炭疽菌呼吸速率影响较小。随着处理时间的延长,6种SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌线粒体活力的抑制作用逐渐提高,苯并烯氟菌唑、吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺、氟唑菌酰羟胺、氟吡菌酰胺、啶酰菌胺处理12 h时,线粒体活力比空白对照组分别降低49.95%-57.84%、55.58%-61.53%、48.07%-60.91%、38.41%-8.38%、50.76%-52.47%和49.15%-57.71%。而药剂处理对炭疽菌菌体内ATP含量变化没有明显的时间效应,但与其他药剂相比,苯并烯氟菌唑仍能够显着降低菌体ATP的水平。药剂处理6 h后,胶孢炭疽菌膜电位均受到不同程度的影响,其中苯并烯氟菌唑对膜电位的影响程度最大,Q3区细胞所占比例为88.5%,其次氟唑菌酰胺比例为70.7%,吡唑萘菌胺处理后,Q3区细胞所占比例为60.6%。氟吡菌酰胺和啶酰菌胺对胶孢炭疽菌线粒体膜电位损伤较小,Q3区细胞比例为38.5%和20.3%。另外,6种SDHI类杀菌剂均可显着影响灰葡萄孢菌的线粒体功能,这与其对灰葡萄孢菌优异的抑制活性有关。3.SDHI类杀菌剂对不同菌琥珀酸脱氢酶抑制活性呈现多样性镰孢菌、稻梨孢菌与不同炭疽菌种SDHB/C/D亚基氨基酸序列亲缘关系近、保守性强在遗传进化中聚为一簇,且在结合腔区域内及非结合腔内存在一些比较保守的氨基酸位点:SDHB-113Q/G、185S、254T、256A;SDHC-69E/G、94F、148Y/F、162W;SDHD-89D、99I、127T/M、137V、142Y、170S,卵菌与植物遗传进化关系近聚为一簇,线虫、果蝇与哺乳动物聚为一簇,聚类分析的结果与病原菌对SDHI类药剂的敏感性反应一致。靶基因表达量是检测药剂能否激发靶标受体而对病原菌发挥抑制作用的关键指标。SDHI类杀菌剂处理并不会引起SDHA亚基基因表达量变化,随苯并烯氟菌唑、吡唑萘菌胺和氟唑菌酰胺处理时间的延长,炭疽菌SDHB/C/D亚基基因表达量显着升高;氟唑菌酰羟胺、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺处理后,灰葡萄孢菌SDHB/C/D亚基基因表达量显着升高,而炭疽菌SDHB/C/D亚基基因表达量并未发生显着变化,证明抑菌活性低的药剂可能与病原菌靶标蛋白结合力弱或进入菌体的量少而未能激发靶标基因的表达。SDHI类杀菌剂对炭疽菌活体酶活和离体酶活抑制作用呈现不同的规律。活体酶活试验中SDHI类杀菌剂对炭疽菌琥珀酸脱氢酶抑制活性与室内毒力结果一致。而离体酶活试验中SDHI类杀菌剂对炭疽菌酶活性均有抑制作用,其中苯并烯氟菌唑对酶活性抑制作用最强IC50值为0.16μM,其次氟唑菌酰胺IC50值为0.49μM,吡唑萘菌胺对酶的抑制活性略低于苯并烯氟菌唑和氟唑菌酰胺,IC50值为1.21μM,而氟唑菌酰羟胺、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺对酶的抑制活性较低,IC50值分别为31.31、22.45和16.35μM。由氟唑菌酰胺对酶活性的强抑制作用,推断除靶标因素参与SDHI类杀菌剂抑菌活性差异外,可能还存在其他途径。4.胶孢炭疽菌SDHA/B/C/D亚基的异源表达体系构建以p ET28A为载体成功构建p ET28A-SDHA、p ET28A-SDHB、p ET28A-SDHD和p ET28A-SDHC质粒并转入ROSETTA2表达菌株,测序成功后在适宜条件下诱导蛋白表达,其中炭疽菌SDHA/B/D亚基均在上清中高表达,而SDHC亚基通过尝试BL21、C43测序正确的菌株诱导蛋白表达,也未发现蛋白表达的条带;后续又将SDHA/B/C/D亚基基因同时构建至p ET28A,筛选测序正确的p ET28A-SDHA/B/C/D-ROSETTA2菌株诱导蛋白表达,也未发现SDHC亚基的目标条带;SDHC亚基存在3个跨膜蛋白,我们又尝试将跨膜区分开表达1+2、2+3并在载体上添加促溶标签MBP,最终获得可稳定表达SDHC亚基跨膜区2+3的菌株,通过Ni+柱亲和层析柱法获得高纯度的炭疽菌SDHA/B/C/D亚基。但进行MST试验时置换溶液过A柱后,SDHA/B/C/D亚基均出现不同程度沉淀,因此MST试验不能用于测定SDHI类杀菌剂与SDHA/B/C/D亚基的结合力。后续我们会尝试其他蛋白表达体系对SDHA/B/C/D亚基进行表达或利用DTNB-SH等方法测定SDHI类杀菌剂与胶孢炭疽菌SDHA/B/C/D亚基的结合力。5.SDHI类杀菌剂对Cg SDHB亚基结合偏好性在Colletotrichum gloeosporioides中敲除SDHB亚基基因后会导致其对苯并烯氟菌唑的敏感性显着降低,EC50为31.99 mg/L,而对吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺、氟唑菌酰羟胺、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺的敏感性未发生明显变化,EC50值分别为5.61、8.06、>500、>500和>500 mg/L。Cg SDHB亚基基因回复菌株对6种SDHI类杀菌剂的敏感性与野生型菌株无显着性差异。表明不同结构药剂对Cg SDHB亚基存在结合偏好性引起蛋白-药剂结合模式的特异性,是否与Cg SDHB亚基结合是SDHI类杀菌剂抑菌活性差异的原因之一。经过验证超过300个Cg SDHC/D亚基基因敲除转化子,均未发现正确的转化子,确定Cg SDHC/D亚基基因为敲除后易致死基因。表型方面,与野生型相比,Cg SDHB亚基基因敲除突变体生长速率明显降低,且菌丝末端尖端分支增加、菌丝间隔膜发育不全,分生孢子产量和萌发率显着降低,另外Cg SDHB亚基基因敲除突变体对渗透胁迫和氧化应激以及细胞壁干扰剂的抗性与野生型无明显差异。6.SDHI类杀菌剂与Cg SDHB/C/D亚基结合模式不同6种SDHI类杀菌剂与胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶结合力存在多样性。其中苯并烯氟菌唑与琥珀酸脱氢酶结合能力最强,结合能为-18.22 kcal/mol,其次为吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺、氟唑菌酰羟胺、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺,结合能分别为-16.80、-14.40、-10.07、-6.32和-5.61 kcal/mol。静电作用能、范德华作用能和非极性溶剂化作用能有助于药剂与琥珀酸脱氢酶的结合,范德华作用能贡献值最大,而极性作用能不利于药剂与琥珀酸脱氢酶结合。动力学结合模型分析结果表明苯并烯氟菌唑与炭疽菌SDHB/C/D亚基形成的结合构象最稳定,可与结合腔内的关键活性位点作用产生氢键和疏水作用力。自由能分解方法显示SDHI类杀菌剂与残基(B-200P、B-204W、C-76S、C-77I、D-135Y)的结合差异驱动SDHI类杀菌剂对炭疽菌的选择活性,后续我们将通过氨基酸定点突变的方法验证哪个氨基酸残基对选择活性起决定作用。7.苯并烯氟菌唑具有优异的膜渗透性能药剂膜渗透性能是药剂发挥抑菌活性的关键因素。SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌菌体的渗透率表现差异,对胶孢炭疽菌菌体的渗透率为苯并烯氟菌唑>吡唑萘菌胺>氟唑菌酰羟胺>啶酰菌胺>氟吡菌酰胺>氟唑菌酰胺,除吡唑萘菌胺(渗透率随处理时间延长而降低)外,其他5种药剂随着处理时间延长药剂的渗透率逐渐提高。对灰葡萄孢菌菌体渗透率,苯并烯氟菌唑>吡唑萘菌胺>氟唑菌酰羟胺>氟唑菌酰胺>啶酰菌胺>氟吡菌酰胺。对药剂在不同时间段内菌体渗透量的动力学模拟,发现SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌的渗透速率规律一致,随着处理时间延长,渗透速率逐渐降低,不同药剂高浓度处理的渗透速率高于低浓度处理。
王瀚博[4](2021)在《茉莉酸甲酯对蓝莓果实采后品质及抗病性调控机制研究》文中指出蓝莓果实酸甜可口,质地细嫩,除了富含蛋白质、膳食纤维、维生素、矿物质等营养物质之外,还含有大量的生物活性物质如酚类、黄酮类、花青素等,对人体具有极高的保健价值。蓝莓多采收于高温多雨的夏季,加之自身代谢旺盛,采后衰老迅速,极大的降低了蓝莓的营养价值和经济价值。此外,由于缺乏坚硬外果皮的保护,蓝莓在采摘和储运阶段极易受到机械损伤和病原菌侵染,导致其腐烂变质。由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引发的灰霉病是蓝莓采后最主要的真菌性病害之一。茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)是一种天然植物生长调节剂,其在植物生长发育,果实成熟以及植物对各种生物或非生物胁迫的防御响应中起重要调控作用。然而,关于MeJA对采后蓝莓果实品质和灰霉病的调控作用未被深入研究。因此,本研究以采后蓝莓果实为实验材料,探究外源MeJA处理对蓝莓果实内营养物质含量、抗氧化体系、细胞壁降解以及能量代谢的影响,考察MeJA处理过的蓝莓果实在灰葡萄孢菌侵染下果实内生理生化、酶学、基因、信号转导以及代谢水平的变化,旨在揭示MeJA对采后蓝莓果实的调控机制,为MeJA在蓝莓保鲜的应用方面提供理论参考。主要研究结果展示如下:1.考察了MeJA处理对采后蓝莓抗氧化系统及果实品质的影响。MeJA处理能够延缓蓝莓果实内可溶性固形物、可滴定酸以及L*值下降,抑制失重率增加,维持了蓝莓采后品质。MeJA还明显促进了酚类物质、黄酮类物质、花青素、抗坏血酸和还原型谷胱甘肽在果实中的积累,同时诱导了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的升高。这增强了贮藏期间蓝莓果实对DPPH自由基的清除能力,抑制了过氧化氢(H2O2)在贮藏后期的积累,减轻了膜脂过氧化程度,抑制了丙二醛(MDA)含量的增加。这些结果表明,MeJA通过维持贮藏期间蓝莓果实的抗氧化能力,降低氧化损伤,延缓衰老,从而保持果实品质。2.探讨了MeJA处理对采后蓝莓果实细胞壁和能量代谢的影响。50μM MeJA能够维持蓝莓果实采后硬度。MeJA处理抑制了纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲酯酶和β-半乳糖苷酶的活性和转录丰度,抑制水溶性果胶的增加,减缓CDTA可溶性果胶、碳酸钠可溶性果胶、半纤维素和纤维素的下降趋势,从而延缓贮藏期间蓝莓果实细胞壁的降解进程。此外,MeJA还诱导了能量代谢相关酶如H+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、细胞色素C氧化酶和琥珀酸脱氢酶的活性和基因表达水平的增加,促进ATP和ADP在果实中的积累,为细胞壁修复和加固提供充足的能量供给。这些结果表明,MeJA能够通过调控细胞壁降解和能量代谢,延缓蓝莓果实采后软化。3.分析了MeJA处理对蓝莓采后灰霉病的调控作用。MeJA处理后,蓝莓果实的发病指数明显降低,这表明MeJA能够增强蓝莓果实对灰葡萄孢菌的防御反应。体外抑菌实验结果显示,MeJA对灰葡萄孢菌的萌发和生长没有显着影响。MeJA处理增加了蓝莓果实内NO和H2O2在贮藏早期的合成,抑制了H2O2在贮藏后期的积累。MeJA还诱导了蓝莓果实中SOD、CAT、APX、CHI、GLU、PAL、C4H和4CL酶活性的增加,提高酚类物质和黄酮类物质的含量,抑制MDA含量升高,从而降低了蓝莓果实对灰葡萄孢菌的敏感性。这些结果表明,MeJA能够通过诱导蓝莓果实抗病性,抑制采后灰霉病的发生。4.采用代谢组学的方法,研究了在灰葡萄孢菌侵染下,MeJA对蓝莓果实代谢水平的影响。主成分分析结果显示,MeJA处理导致蓝莓果实内代谢谱发生明显改变。随着贮藏时间的延长,对照组和MeJA处理组之间差异代谢物数量明显降低。MeJA处理激活了苯丙烷代谢途径,促进了蓝莓果实中芦丁、槲皮素、阿魏酸、原儿茶酸、没食子酸、芥子酸和金丝桃苷的积累。此外,MeJA还增强了不饱和脂肪酸的代谢,诱导油酸、亚麻酸和γ-亚麻酸的合成。这种增强作用可能与MeJA诱导蓝莓果实内糖酵解途径和TCA循环以提供充足的能量和碳骨架有关。5.探究NO和H2O2在MeJA对蓝莓抗病性调控过程中的作用。cPTIO处理不仅废除了MeJA对NO和H2O2的诱导作用,还显着抑制了NADPH氧化酶、SOD、CAT、APX、CHI、GLU、PAL、C4H和4CL的活性,下调了苯丙烷代谢途径关键基因VPAL、VaCHS、VaCHI、VaF3H、VaFLS和VaDFR的表达水平,导致蓝莓果实对灰葡萄孢菌的敏感性大幅增加。DPI处理能够削弱MeJA对蓝莓果实内防御相关酶以及苯丙烷代谢途径的促进作用,降低了蓝莓的抗病性,但对于MeJA所诱导的NOS活性升高和早期NO积累没有显着影响。这些结果表明,在MeJA介导蓝莓抵抗灰葡萄孢菌侵染的过程中NO位于H2O2上游发挥作用。
贾爽爽[5](2020)在《我国葡萄灰霉菌对主要杀菌剂的抗药突变型分布与多药抗性机制研究》文中认为由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的葡萄灰霉病主要使用化学杀菌剂进行防治,但该病菌已对多种杀菌剂产生不同程度的抗性。本研究对黑龙江省哈尔滨市、辽宁省北镇市、山东省蓬莱市、山西省太谷县、湖北省荆州市和云南省宾川县6个葡萄主产区的1106株葡萄灰霉病菌的多菌灵、异菌脲、啶酰菌胺的抗性突变和咯菌腈的抗药性进行检测,主要结果如下:1.明确了我国葡萄灰霉病菌对多菌灵、异菌脲和啶酰菌胺的抗性突变型及分布利用测序技术检测供试菌株对多菌灵、异菌脲和啶酰菌胺的抗性突变,结果显示:(1)我国葡萄灰霉病菌对多菌灵的抗性频率和抗性水平都很高,抗性突变型为β-Tubulin基因上的E198A和E198V,均引起对多菌灵的高水平抗性。E198A突变在北部产区占绝大多数,而在中南部产区E198V突变占比相对较高。可根据上述两种突变类型开发快速检测技术,用于我国葡萄灰霉病菌对多菌灵的抗性监测。(2)我国葡萄灰霉病菌对异菌脲的抗性频率较高,抗性突变型为BosI基因上的I365N/S、Q369P+N373S和Q369P,以I365N和I365S突变为主,黑龙江省哈尔滨市的I365N突变频率远高于I365S,而云南省宾川县的I365N突变频率远低于I365S。突变位点I365N/S和Q369P可作为靶标位点开发快速检测技术,用于我国葡萄灰霉病菌对异菌脲抗性监测。(3)我国葡萄灰霉病菌对啶酰菌胺的总体抗性频率相对较低,抗性突变为SdhB基因上的H272R/Y/L、P225F/L/T和N230I,以H272R/Y突变为主,可根据上述两种突变建立葡萄灰霉病菌的啶酰菌胺抗性快速检测技术用于我国葡萄灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性监测。(4)我国葡萄灰霉病菌对多菌灵、异菌脲和啶酰菌胺的多药抗性类型共有8种,以对多菌灵和异菌脲产生双抗和对这三种药剂同时产生抗性的菌株为主。2.明确了我国葡萄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性和mrr1基因部分突变位点与MDR1型多药抗性的关系采用菌丝生长速率法检测了372株葡萄灰霉病菌对咯菌腈的敏感性,结果显示,我国葡萄灰霉病菌对咯菌腈高度敏感,未检测到咯菌腈抗性菌株,敏感基线为0.007(±0.004)μg/mL。我国葡萄灰霉病菌未检测到MDR1型多药抗性菌株,mrr1基因上的I443L和H353D突变以及在该基因上新检测到的22种突变类型均不能引起MDR1型多药抗性。本研究结果对我国葡萄灰霉病菌抗药性快速分子检测技术的开发奠定了基础,对生产上防治葡萄灰霉病药剂的选择具有指导意义。
徐倩茹[6](2020)在《指状青霉菌对啶酰菌胺的抗性风险和抗性机制的研究》文中认为指状青霉菌(Penicillium digitatum)引起的绿霉病是为害最严重的柑橘采后病害之一,可导致柑橘产业的巨大损失。当前登记的甾醇合成脱甲基抑制剂(DMI)类杀菌剂抗性问题日益严峻,亟需筛选新的替代药剂。本论文研究了琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂啶酰菌胺对指状青霉菌的生物活性以及指状青霉菌对啶酰菌胺的抗性风险和抗性机制,对将来利用啶酰菌胺防治柑橘绿霉病具有重要的理论和实践意义。2017年和2018年从全国五个地区采集并分离到189株指状青霉菌,通过测定啶酰菌胺对菌丝生长抑制的有效中浓度(EC50),建立了啶酰菌胺的敏感性基线,EC50值分布呈单峰,平均值为0.099±0.041μg/m L(SD)。菌丝生长抑制法测定的啶酰菌胺和咯菌腈的EC50值之间没有显着相关性(r=0.114,P=0.338)。啶酰菌胺对指状青霉菌孢子萌发和对菌丝生长的EC50值之间相关性不显着(r=0.126,P=0.168)。100和200μg/m L啶酰菌胺对柑橘绿霉病的保护作用防效分别为67.3%和79.3%。20μg/m L啶酰菌胺延迟了指状青霉菌孢子在PDA上的萌发,萌发后的菌丝在无药PDA上的生长速率降低了77.4%,在柑橘果实上的致病力也下降了27.8%(P=0.002)。啶酰菌胺浓度为0.03(P=0.001)和0.12μg/m L(P<0.001)时显着降低了指状青霉菌在PDA上的产孢量,但产生的孢子致病力与对照相比无显着差异。用50μg/m L啶酰菌胺浸果后接种孢子悬浮液,果实上的病斑直径和产孢量分别减小了33.5%和81.3%,将果实上产生的孢子接种至无药的柑橘果实上,致病力与产孢量分别减小了30.1%和70.5%。啶酰菌胺使PDA上生长的菌丝形态变形,弯曲成弧状。浓度为0.03和0.12μg/m L的啶酰菌胺使靶标酶琥珀酸脱氢酶的活性分别降低42.4%和61.9%。啶酰菌胺浓度为0.12μg/m L时使超氧化物歧化酶活性降低71.1%和H2O2含量降低59.6%,但使过氧化物酶活性升高43.2%和超氧根阴离子含量升高61.9%。通过室内紫外诱导与药剂驯化共获得7株啶酰菌胺抗性突变体,在无药PDA上连续转接16代后,5株EC50值大于1000μg/m L的突变体抗性均能稳定遗传,而突变体HBWH20BR1的EC50值由193.2μg/m L降低为21.7μg/m L,另一突变体HBYCA44BR的EC50值由14.5μg/m L降低为4.3μg/m L。啶酰菌胺与同类型杀菌剂萎锈灵存在正交互抗性(r=0.817,P=0.002),但与咯菌腈(r=0.372,P=0.260)和咪鲜胺(r=-0.467,P=0.147)无交互抗性。与它们各自的亲本相比,7株抗性突变体在菌丝生长速率、孢子产量、孢子萌发率、致病力、以及对Na Cl、水杨羟肟酸和双氧水的敏感性等适合度方面没有统一的变化趋势,多数抗性突变体没有明显的适合度下降。抗性机制研究发现,所有抗性突变体的琥珀酸脱氢酶Sdh A、Sdh C和Sdh D亚基均未发生突变,对于Sdh B亚基,仅有抗性突变体JXGZ96BR1、JXGZ96BR2和HBYC51BR2在第243位由组氨酸突变为酪氨酸(H243Y),该突变可能与啶酰菌胺抗性有关。Sdh B和Sdh C基因的表达水平变化在不同的突变体之间没有统一的趋势。PDA中1000μg/m L的啶酰菌胺抑制突变体HBYC51BR1的产孢,分子机制研究表明啶酰菌胺处理后,突变体HBYC51BR1的产孢相关基因Brl A,Aba A和Wet A基因分别下调了99.3%、98.4%和80.8%,而对照菌株HBYC51BR2只有Wet A下调了47.7%。
冯庭跃[7](2020)在《磺酰胺类化合物SYAUP-CN-26对灰葡萄孢菌作用机理研究》文中研究说明磺酰胺类化合物作为当今世界的研究热点,被广泛应用于农业领域,控制田间有害生物的危害。本实验室经过一系列环烷基磺酰胺类化合物的合成与筛选,得到供试化合物(1S,2R-((3-溴苯乙基)氨基)-N-(4-氯-2-三氟甲基苯基)环己烷基-1-磺酰胺)(代号:SYAUP-CN-26)。研究结果表明,SYAUP-CN-26对灰葡萄孢菌具有相当优异的抑菌活性,因其结构新颖,同市面上常用的预防与治疗灰霉病所用的杀菌剂作用机理不同,有成为防治灰霉病的杀菌剂的先导化合物的潜力。为了深入探究SYAUP-CN-26对灰葡萄孢菌的作用机制,本文研究了其对灰葡萄孢菌物质合成能力、呼吸代谢能力和线粒体功能的影响,测定了化合物SYAUP-CN-26在EC50(1.823 mg/L)、EC90(19.263 mg/L)和MIC(79.754 mg/L)三个浓度下对灰葡萄孢菌细胞壁、细胞膜、蛋白质、还原糖、呼吸代谢、ATP含量和线粒体功能的作用。具体结果如下:通过对灰葡萄孢菌几丁质酶活性测定发现,几丁质酶的活性在整个测定区间内各个浓度处理组均保持稳定,并与对照组几丁质酶的活性相比偏差不大,差异不显着,表明化合物SYAUP-CN-26对灰葡萄孢菌的细胞壁没有抑制作用;经过79.754 mg/L的SYAUP-CN-26处理24 h后,灰葡萄孢菌细胞内还原糖的含量同对照组相比有比较明显的下降,但细胞外还原糖的含量在整个测定区间内保持平稳状态,说明在一定浓度下化合物SYAUP-CN-26可以抑制还原糖的合成;随着化合物SYAUP-CN-26浓度的增加和处理时间的延长,可溶性蛋白的含量呈现严重的下降趋势,受到的抑制效果明显,而麦角甾醇的含量在化合物SYAUP-CN-26处理12 h以后受到抑制;经过化合物SYAUP-CN-26处理后,各个浓度处理组的菌体电导率、丙二醛(MDA)、细胞外DNA和RNA的含量都呈现上升趋势。综合上述结果来看,化合物SYAUP-CN-26对灰葡萄孢菌的细胞膜存在抑制作用,并且造成细胞合成物质能力下降。通过氧电极测定了化合物SYAUP-CN-26对灰葡萄菌呼吸速率的影响。经过三个浓度化合物SYAUP-CN-26处理24 h后,灰葡萄孢菌的呼吸速率抑制率分别为54.74%,76.89%和82.48%,呼吸代谢受到严重的抑制;对于不同菌龄的灰葡萄孢菌,随着其菌龄的增加抑制程度略微下降;化合物SYAUP-CN-26和丙二酸,碘乙酸、磷酸钠三种典型呼吸抑制剂中的丙二酸叠加率最小,该结果表明化合物SYAUP-CN-26可能抑制了灰葡萄孢菌的三羧酸循环途径中的某些过程或支持生命活动的重要反应。除此之外,ATP的含量也受到严重抑制。采用试剂盒测定了线粒体复合体ⅠⅤ活性的变化,结果显示5个复合体的活性都受到了不同程度的抑制。其中复合体Ⅰ、复合体Ⅱ和复合体Ⅳ的活性受到的抑制作用最显着,且复合体Ⅱ活性的抑制不受浓度的影响;复合体Ⅲ活性同对照组相比,基本保持平稳;复合体Ⅴ的活性受到的抑制作用显着。此外,在药剂作用下菌体线粒体膜通透性转运孔(MPTP)的开放度增加。综上所述,化合物SYAUP-CN-26能够抑制灰葡萄孢菌还原糖和可溶性蛋白的合成,改变细胞膜的通透性。但更重要的是化合物SYAUP-CN-26抑制了灰葡萄孢菌线粒体呼吸链复合体的活性,使其呼吸代谢和ATP合成受到抑制。
刘琨[8](2020)在《人参灰霉病菌遗传多样性分析及抗药性研究》文中提出人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,是我国传统名贵中药材。近年,灰霉病在东北人参产区为害逐年加重,已成为影响人参产业健康发展的重要因素之一。鉴于人参灰霉病普遍发生的严峻形势,本研究在对辽宁、吉林、黑龙江人参产区灰霉病菌分离鉴定基础上,开展了室内抗药性和致病力测定;结合ISSR分子标记技术,分析了不同地理来源人参灰葡萄孢的遗传差异。本研究基本摸清了我国人参产区灰葡萄孢对4种杀菌剂的抗药性情况,相对清晰地阐述了不同地域来源人参灰葡萄孢致病力差异及遗传分化,为人参灰霉病科学防控提供了参考依据。研究结果汇总如下:(1)从我国辽宁、吉林和黑龙江采集的人参灰霉病样品中共计分离到102株灰霉病菌;经菌落形态学及分子生物学鉴定,均为灰葡萄孢Botrytis cinerea。(2)灰葡萄孢群体的遗传多样性(Ht)均值为0.3395,地理分布种群内遗传多样性(Hs)均值为0.2937,地理分布种群间遗传多样性(Dst)均值为0.0458,地理分布种群间的差异不如地理分布种群内的差异明显;各群体间遗传分化系数(Gst)均值为0.1348,基因流(Nm)均值为3.2084,说明东北人参产区灰葡萄孢种群间遗传分化不明显,遗传变异主要来自种群内。聚类分析结果表明,供试灰葡萄孢遗传相似系数为0.38~0.99,阈值0.52时可将全部菌株分为4组;阈值0.65时可将供试菌株划分为13组(组A—组M),除了 A组、D组、E组、F组和J组外,其余组仅含1个菌株。结果表明,灰葡萄孢的遗传聚类与地理来源无关。(3)根据人参叶片上病斑大小,将人参灰葡萄孢分为弱致病力、中等致病力和强致病力3个等级。其中,中等致病力菌株最多(77.45%);其次是弱致病力菌株(16.67%);强致病力菌株最少(5.88%)。致病力检测结果表明,人参灰葡萄孢存在明显的致病力分化。(4)采用最小浓度抑制法,选取人参生产上常用的4种灰霉病杀菌剂,对分离的102株人参灰葡萄孢进行抗药性检测。结果表明,灰葡萄孢对多菌灵(C)、嘧霉胺(P)、异菌脲(I)、咯菌腈(F)的抗药性频率分别为100%、86.27%、73.53%和30.39%,辽宁、吉林省的人参灰葡萄孢对嘧霉胺、异菌脲的抗药性高于三省平均水平。根据抗药性检测结果,最终将人参灰葡萄孢分为7种抗性类型,即CRPRIRFR、CRPRIRFs、CRPRISFR、CRPRISFS、CRPsIRFs、CRPSISFR 和 CRPsIsFs,其所占比例分别为 26.47%、39.22%、4.90%、14.71%、5.88%、0.98%和 7.84%,未发现对供试 4 种杀菌剂均表现敏感的人参灰葡萄孢。
任维超[9](2019)在《灰葡萄孢细胞自噬的生物学功能及其调控咯菌腈敏感性的机制研究》文中认为由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是世界上发生和危害最严重的病害之一。该病原菌寄主范围广泛,可以侵染包括多种水果、蔬菜、花卉在内的500余种植物,给农业生产造成巨大的经济损失。目前,由于缺乏有效的抗病品种,灰霉病的田间防控主要以化学防治为主。然而,随着杀菌剂的长期大量使用,以及灰霉病菌自身所具有的寄主范围广、繁殖速度快、遗传变异频繁的特点,导致灰霉病的抗药性问题日益突出。咯菌腈(fludioxonil)属于苯基吡咯类化合物,是一种高效、低毒、广谱的新型杀菌剂,对灰霉病的防治有特效。咯菌腈的作用机制独特,与现有杀菌剂无交互抗性,国际上杀菌剂抗性行动委员会(FRAC)认为咯菌腈的作用机制是干扰渗透压调节信号途径相关的组氨酸激酶的活性,导致菌体自身的渗透压失衡,从而达到杀菌的效果,但是具体的作用机制还不清楚。目前,国外田间已经有病原菌对咯菌腈低等水平的抗药性报道。在我国,咯菌腈的使用尚处于早期阶段,然而,在2016年田间已经发现了灰霉病菌对咯菌腈高等水平的抗性菌株,尽管这些抗性菌株的生物适合度普遍都很低。细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内的物质进行代谢循环的重要过程。该过程中一些老化的蛋白质或损坏的细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后,运送到溶酶体(动物)或液泡(酵母和植物)中进行降解并得以循环利用。近年来的研究表明,细胞自噬不仅是细胞在饥饿状态下获取能量的一种应激反应,而且参与许多重要的生理生化过程,在生物体应对外界胁迫的过程中起重要的作用。细胞自噬在部分真菌中已经有所报道,但其生物学功能会根据寄生营养型的不同而有所差异。因此,研究细胞自噬在灰葡萄孢中的生物学功能,将为科学防治灰霉病和新型杀菌剂的开发提供理论基础。本文主要研究了细胞自噬调控灰葡萄孢对咯菌腈敏感性的机制,同时,报道了细胞自噬在灰葡萄孢生长发育和致病性中的生物学作用。主要获得的研究结果如下:(1)细胞自噬在灰葡萄孢对杀菌剂敏感性中的作用。通过靶向基因敲除技术,我们构建了灰葡萄孢细胞自噬途径关键基因的缺失突变体。显微观察和生理生化实验证明,灰葡萄孢细胞自噬途径关键基因的缺失导致其细胞自噬过程被阻断。药敏性实验测定了灰葡萄孢细胞自噬基因缺失突变体对防治灰霉病常规杀菌剂的敏感性,包括苯基吡咯类杀菌剂咯菌腈、二甲酰亚胺类杀菌剂异菌脲和腐霉利、琥珀酸脱氢酶抑制剂啶酰菌胺和吡啶胺类杀菌剂氟啶胺。结果发现,细胞自噬途径阻断导致灰葡萄孢菌体对咯菌腈、异菌脲和腐霉利的敏感性显着上升,但是对啶酰菌胺和氟啶胺的敏感性保持不变。以上结果表明,细胞自噬途径参与调控灰葡萄孢对咯菌腈、异菌脲和腐霉利的敏感性。(2)灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG1的生物学和药理学功能研究。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,ATG1编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Atg1,当细胞处于饥饿状态时,Atg1与Atg13结合形成复合体从而诱导细胞自噬过程的发生,当细胞处于营养充足的状态时,Atg13通过磷酸化降低与Atg1的结合力从而抑制细胞自噬过程。同源比对鉴定到BcATG1为灰葡萄孢中ATG1的同源基因。BcATG1可以回补酿酒酵母同源基因缺失突变体对氮饥饿的耐受性,并且响应菌体对碳和氮饥饿的诱导。基因敲除BcATG1导致菌体的细胞自噬过程阻断。药敏性实验测定发现,BcATG1缺失突变体对咯菌腈、异菌脲和腐霉利的敏感性上升。在生物学表型方面,BcATG1缺失突变体的气生菌丝减少,菌丝分支异常,色素含量升高,在营养匮乏的培养基上生长速率减慢,并且产孢量下降,孢子形态畸形,丧失了在PDA平板上形成菌核的能力。致病性实验表明,BcATG1的缺失影响了分生孢子萌发后侵染结构的形成,使菌体的表皮穿透能力下降,进而导致在不同寄主上的致病力严重减弱。另外,BcATG1缺失突变体的孢子中脂滴含量下降,菌体甘油含量升高。通过目的基因回复,BcATG1缺失突变体的表型缺陷都能得到恢复。以上结果表明,BcATG1在灰葡萄孢对咯菌腈的敏感性、发育和致病过程中发挥重要的作用。(3)灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG8和BcATG4的生物学和药理学功能研究。在酿酒酵母中(S.cerevisiae)中,ATG8编码类泛素蛋白Atg8,ATG4编码半胱氨酸蛋白酶Atg4。在细胞自噬的自噬泡形成过程中,Atg8首先被Atg4在碳末端进行修饰,然后在Atg3和Atg7的共同修饰作用下与磷脂酰乙醇胺结合形成泛素样共轭系统。根据同源比对,在灰葡萄孢基因组数据库中鉴定到了BcATG8和BcATG4,这两个基因均能同源互补各自的同源基因酵母缺失突变体,而且彼此之间存在直接的物理相互作用。通过绿色荧光蛋白(GFP)与BcAtg8的氮末端融合蛋白GFP-BcAtg8,成功构建了灰葡萄孢细胞自噬过程的发生标记。分别基因敲除BcATG8和BcATG4都能导致灰葡萄孢的细胞自噬过程阻断,而且对咯菌腈、异菌脲和腐霉利的敏感性上升。生物学表型方面,BcATG8缺失突变体的气生菌丝减少,生长速率减慢,产孢量下降,在饥饿条件下孢子萌发延迟,而且丧失了在PDA平板的菌核形成能力。BcATG4缺失突变体生长速率减慢,气生菌丝减少,产孢量下降,孢子畸形,在PDA平板上不能形成菌核。寄主侵染实验表明,BcATG8和BcATG4缺失突变体在不同寄主上的致病力均显着下降。此外,BcATG8和BcATG4的单基因缺失突变体脂滴含量下降,甘油含量升高。这些结果表明,BcATG8和BcATG4均参与灰葡萄孢发育、致病和对咯菌腈的敏感性调控过程。(4)细胞自噬基因BcATG3和BcATG7的生物学功能研究。在酿酒酵母(S.cerevisiae)中,ATG3和ATG7分别编码类泛素激活蛋白E2和类泛素激活蛋白E1,在细胞自噬发生过程中,E2和E1协同修饰类泛素蛋白Atg8以促进自噬泡的形成。通过同源基因比对,在灰葡萄孢基因组数据库中鉴定到了BcATG3和BcATG7。酵母双杂实验表明BcATG3和BcATG7所编码的蛋白之间存在直接的相互作用。基因敲除BcATG3或BcATG7都能导致灰葡萄孢细胞自噬过程的阻断。BcATG3和BcATG7缺失突变体表现出相似的生物学表型,包括气生菌丝减少,生长速率减慢,产孢量下降。值得注意的是,尽管BcATG3和BcATG7的缺失突变体都不能在PDA平板上形成菌核,但却可以在CM和MM培养基上产生少量的菌核。致病性实验表明,BcATG3和BcATG7的缺失突变体在不同寄主植物上的致病力均显着下降。以上结果表明,BcATG3和BcATG7是灰葡萄孢营养分化和致病力正常发生所必需的。
丛梦龙[10](2018)在《多菌灵对灰葡萄孢菌致病力低剂量刺激作用的研究》文中研究指明灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是一种死体营养型植物病原真菌,属于子囊菌门葡萄孢属。本论文研究了多菌灵对灰葡萄孢菌两株敏感菌株(HBtom536、HBtom459)和两株多菌灵抗性菌株(HBtom451、HBstr491)致病力的低剂量刺激作用。多菌灵对灰葡萄孢菌在黄瓜叶片上的致病力具有显着的低剂量刺激作用。叶面喷施多菌灵浓度为10μg/mL和50μg/mL时分别对抗性菌株HBtom451和HBstr491致病力的刺激率最高,为16.7%和13.5%;叶面喷施多菌灵浓度为0.02μg/mL和0.005μg/mL时分别对敏感菌株HBtom536和HBtom459致病力刺激率最高,为18.8%和12.5%。在含药的PDA上生长72 h后接种到黄瓜叶片上,PDA中多菌灵浓度在50μg/mL时对抗性菌株HBtom451和HBstr491致病力刺激率最高,分别为7.9%和9.5%;多菌灵浓度在0.02μg/mL和0.005μg/mL时分别对敏感菌株HBtom536和HBtom459致病力刺激率最高,为12.9%和9.1%。抗性菌株在含200μg/mL多菌灵的PDA上生长48 h作为预处理,接种到黄瓜叶片上,与未喷施药剂的对照相比,喷施多菌灵浓度为200μg/mL和400μg/mL时分别对抗性菌株HBtom451和HBstr491致病力的刺激率最高,为18.0%和27.4%;敏感菌株HBtom536和HBtom459分别在含0.05μg/mL和0.02μg/mL多菌灵的PDA上生长48 h作为预处理,接种到黄瓜叶片上,喷施多菌灵浓度为0.05μg/mL和0.02μg/mL时分别对敏感菌株HBtom536和HBtom459致病力的刺激率最高,为22.2%和17.2%。含低剂量多菌灵PDA可显着提高灰葡萄孢菌产生菌核的个数和干重。PDA中多菌灵浓度为50μg/mL时对抗性菌株HBtom451和HBstr491菌核数量和干重刺激率最高,对菌核数量最高刺激率分别为19.8%和26.6%,对菌核干重最高刺激率分别为10.3%和12.6%;对菌株HBstr491孢子萌发率刺激率为4.4%。PDA中多菌灵浓度为0.02μg/mL时对敏感菌株HBtom536菌核数量和干重的刺激率最高,分别为22.6%和20.8%;PDA中多菌灵浓度为0.005μg/mL时对敏感菌株HBtom459菌核数量和干重的刺激率最高,分别为19.7%和14.8%,对孢子萌发率刺激率为4.0%。在喷施50μg/mL多菌灵的黄瓜叶片上接种抗性菌株HBstr491,24 h后可观察到侵染病斑,而对照24 h时无明显病斑。扫描电镜观察显示,接种16 h后,处理组可观察到侵染垫结构,而未喷施多菌灵的对照侵染垫结构不明显,表明多菌灵对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用在侵染的早期就表现出来,是一种直接刺激作用,而不是抑制后的过度补偿作用。对低剂量刺激作用生理生化及分子机制的研究表明,多菌灵对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用与草酸的合成、漆酶活性和耐H2O2能力无关,与致病相关基因果胶甲酯酶基因Bcpme1、聚半乳糖醛酸酶基因Bcpg2、角质酶基因CutA、木聚糖酶基因Xyn11A和NADPH氧化酶基因BcnoxA的表达无关。在黄瓜叶片上同时喷施多菌灵和异菌脲,其浓度分别为3+0.0001μg/mL、10+0.0005μg/mL、50+0.0025μg/mL和200+0.0125μg/mL时,对多菌灵抗性菌株HBtom451和HBstr491致病力表现出低剂量刺激作用,最大刺激率分别为18.4%和22.8%。与喷施多菌灵和异菌脲单剂相比,同时喷施多菌灵和异菌脲的最大刺激幅度差异不大,但在最低浓度时,刺激幅度增加明显。与单剂相比,多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌耐H2O2能力、细胞膜通透性、渗透压敏感性和胞外多糖含量的影响差异不显着。
二、不同抗性型灰葡萄孢菌Botrytis cinerea对不同作用机制杀菌剂的敏感性研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同抗性型灰葡萄孢菌Botrytis cinerea对不同作用机制杀菌剂的敏感性研究(论文提纲范文)
(1)灰葡萄孢自然群体交配型鉴定及有性生殖引起的遗传变异分析(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 文献综述 |
1 研究进展 |
1.1 灰葡萄孢研究现状 |
1.1.1 生物学特性 |
1.1.2 种群多样性 |
1.1.3 作物灰霉病防治现状 |
1.2 丝状子囊菌有性生殖 |
1.2.1 交配系统及演化 |
1.2.2 交配型位点结构 |
1.2.3 交配型基因功能 |
1.3 灰葡萄孢有性生殖 |
1.3.1 生活史 |
1.3.2 交配系统 |
1.3.3 交配型基因功能 |
1.3.4 有性生殖的意义 |
2 研究目的和意义 |
第二章 保护地草莓和番茄灰葡萄孢群体交配型构成分析 |
1 材料和方法 |
1.1 试验材料、试剂及仪器 |
1.1.1 供试材料 |
1.1.2 培养基及试剂 |
1.1.3 仪器设备 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 菌株基因组DNA提取 |
1.2.2 DNA片段的回收、连接及转化 |
1.2.3 灰葡萄孢菌株交配型鉴定 |
1.2.4 同一生境灰葡萄孢群体交配型构成分析 |
1.2.5 其他Botrytis属菌株交配型鉴定 |
1.3 数据统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 交配型鉴定 |
2.2 群体交配型构成分析 |
2.2.1 不同寄主灰葡萄孢群体交配型构成 |
2.2.2 灰葡萄孢菌株交配型地理分布 |
2.2.3 同一生境下交配型构成 |
2.3 其他Botrytis属菌株交配型 |
3 结论与讨论 |
3.1 保护地草莓和番茄灰葡萄孢群体交配型构成分析 |
3.2 保护地灰葡萄孢群体有性生殖潜力分析 |
3.3 保护地灰葡萄孢群体有性生殖难于发生的原因分析 |
3.4 其他葡萄孢属交配型分子鉴定的可行性分析 |
第三章 灰葡萄孢BcMAT1-1-1的功能研究 |
1 材料和方法 |
1.1 试验材料、试剂及仪器 |
1.1.1 试验材料 |
1.1.2 试剂和培养基 |
1.1.3 仪器与设备 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 BcMAT1-1-1敲除同源重组片段的扩增 |
1.2.2 原生质体制备及转化 |
1.2.3 BcMAT1-1-1缺失突变体的PCR验证 |
1.2.4 BcMAT1-1-1缺失突变体有性交配能力测定 |
1.2.5 BcMAT1-1-1缺失突变体生物学特性测定 |
1.2.6 BcMAT1-1-1缺失突变体致病力测定 |
1.2.7 BcMAT1-1-1缺失突变体药剂敏感性测定 |
1.3 数据统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 BcMAT1-1-1基因缺失突变体的获得 |
2.2 BcMAT1-1-1缺失突变体有性交配能力 |
2.3 BcMAT1-1-1缺失突变体生物学特性分析 |
2.3.1 菌落及微观形态观察 |
2.3.2 菌核产量、大型分生孢子产孢量及萌发率 |
2.4 致病力 |
2.5 药剂敏感性 |
3 结论与讨论 |
3.1 BcMAT1-1-1对菌株生物学特性的影响 |
3.2 BcMAT1-1-1对菌株田间适合度的影响 |
3.3 BcMAT1-1-1对菌株有性生殖的影响 |
第四章 灰葡萄孢有性生殖对其遗传变异的影响 |
1 材料和方法 |
1.1 试验材料、试剂及仪器 |
1.1.1 试验材料 |
1.1.2 试剂和培养基 |
1.1.3 仪器与设备 |
1.2 试验方法 |
1.2.1 子囊盘诱导 |
1.2.2 子囊孢子的获得 |
1.2.3 有性子代菌株交配型构成分析 |
1.2.4 有性子代菌株菌落表型分析 |
1.2.5 有性子代菌株菌丝亲和性测定 |
1.2.6 有性子代菌株菌丝生长速率测定 |
1.2.7 有性子代菌株致病力测定 |
1.2.8 有性子代菌株药剂敏感性测定 |
1.2.9 咯菌腈靶标基因组氨酸激酶基因Bos1 序列分析 |
1.3 数据统计分析 |
2 结果与分析 |
2.1 灰葡萄孢子囊盘诱导 |
2.2 有性子代菌株交配型构成 |
2.3 有性子代变异分析 |
2.3.1 菌株表型 |
2.3.2 菌丝亲合群 |
2.3.3 菌丝生长速度 |
2.4 致病力 |
2.5 药剂敏感性 |
2.6 组氨酸激酶Bos1序列分析 |
3 结论与讨论 |
3.1 子囊盘诱导条件分析 |
3.2 有性子代群体交配型构成分析 |
3.3 有性子代菌株表型多样性分析 |
3.4 有性子代菌株菌丝亲和群多样性分析 |
3.5 有性子代菌株田间适合度变异分析 |
第五章 全文总结、创新点及展望 |
1 总结 |
2 创新点 |
3 展望 |
参考文献 |
附录1 PCR扩增MAT基因序列及第三章PCR反应体系及程序 |
附录2 攻读博士学位期间发表论文 |
致谢 |
(2)番茄中灰霉菌小种Taian致病力的探究(论文提纲范文)
符号说明 |
中文摘要 |
Abstract |
1 前言 |
1.1 植物灰霉病研究进展 |
1.1.1 灰霉菌的生物学特性 |
1.1.2 灰霉菌的病害循环 |
1.1.3 灰霉菌的致病机制 |
1.1.4 灰霉病对植物的危害 |
1.1.5 灰霉病的防治措施 |
1.2 植物对病原菌的免疫防御 |
1.2.1 植物病原菌概况 |
1.2.2 植物的免疫机制 |
1.2.3 茉莉酸参与植物抵御病原菌 |
1.2.4 水杨酸参与植物抵御病原菌 |
1.2.5 茉莉酸水杨酸的相互作用 |
1.3 本研究的目的意义 |
2 材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 植物材料 |
2.1.2 菌株 |
2.1.3 软件及网络信息资源 |
2.1.4 主要仪器 |
2.1.5 常用试剂的配置 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 番茄材料培养 |
2.2.2 灰霉菌株的分离 |
2.2.3 灰霉菌株的保存与活化 |
2.2.4 灰霉菌株的鉴定 |
2.2.5 灰霉菌株生物学特性研究 |
2.2.6 灰霉菌侵染番茄 |
2.2.7 激素预处理番茄 |
2.2.8 番茄基因表达的检测 |
3 结果与分析 |
3.1 分离到灰霉菌小种Taian |
3.2 不同灰霉菌小种的形态学差异 |
3.2.1 灰霉菌小种菌落形态的观察 |
3.2.2 灰霉菌小种菌丝生长速率的测定 |
3.2.3 灰霉菌小种的孢子特性 |
3.3 灰霉菌小种的番茄致病力 |
3.4 灰霉菌小种的致病力与JA介导的植物免疫 |
3.4.1 番茄对灰霉菌的防御依赖JA信号通路 |
3.4.2 灰霉菌小种致病力与JA诱导抗性的关系 |
4 讨论 |
4.1 灰霉菌-番茄互作的机制研究 |
4.2 灰霉菌小种致病力差异机理分析 |
5 结论 |
参考文献 |
致谢 |
(3)琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂对炭疽病菌的毒力差异机制(论文提纲范文)
符号说明 |
中文摘要 |
Abstract |
1 前言 |
1.1 线粒体复合物Ⅱ(琥珀酸脱氢酶)的研究现状 |
1.1.1 线粒体复合物Ⅱ结构 |
1.1.2 线粒体复合物Ⅱ的功能研究 |
1.1.3 线粒体复合物Ⅱ抑制剂类杀菌剂抑菌谱及生物活性 |
1.1.3.1 氧硫杂环己二烯-酰胺类 |
1.1.3.2 苯基-苯甲酰胺类 |
1.1.3.3 呋喃酰胺类 |
1.1.3.4 噻唑-酰胺类 |
1.1.3.5 吡啶-酰胺类 |
1.1.3.6 吡啶-乙基-苯甲酰胺类 |
1.1.3.7 苯基氧代乙基噻吩酰胺类 |
1.1.3.8 吡嗪-酰胺类 |
1.1.3.9 吡唑-4-酰胺类 |
1.2 影响药剂活性的因素分析 |
1.2.1 药物与靶标的结合模式 |
1.2.2 靶标多样性 |
1.2.3 靶基因过表达 |
1.2.4 药代动力学 |
1.2.4.1 药剂代谢 |
1.2.4.2 药剂外排 |
1.2.4.3 药剂渗透 |
1.3 农药分子结构与生物活性的构效关系 |
1.3.1 分子设计 |
1.3.1.1 分子聚集态的定量构效关系(QAAR) |
1.3.1.2 生物大分子定量构效关系(MB-QSAR) |
1.3.1.3 基于密度泛函数理论的定量构效关系(DFT/QSAR) |
1.3.1.4 构象柔性度分析 |
1.3.1.5 活性碎片法 |
1.3.1.6 构型控制 |
1.4 本研究目的及意义 |
1.5 技术路线 |
2 材料与方法 |
2.1 供试材料 |
2.1.1 供试病原真菌 |
2.1.2 供试药剂 |
2.1.3 主要仪器 |
2.1.4 工具酶和主要试剂 |
2.1.5 相关培养基的配置 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂(SDHIs)生物活性评估 |
2.2.1.1 SDHI类杀菌剂的离体抑菌活性测定 |
2.2.1.2 SDHI类杀菌剂对辣椒炭疽病的保护和治疗作用 |
2.2.1.3 苯并烯氟菌唑、吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺防治辣椒炭疽病的田间试验 |
2.2.2 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌的线粒体功能影响 |
2.2.2.1 呼吸速率 |
2.2.2.2 线粒体活力 |
2.2.2.3 ATP含量 |
2.2.2.4 膜电位 |
2.2.3 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶功能影响 |
2.2.3.1 SDHB/C/D亚基的系统发育分析 |
2.2.3.2 SDHB/C/D亚基的氨基酸序列比对及Motif分析 |
2.2.3.3 胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌组织收集及总RNA提取 |
2.2.3.4 利用q RT-PCR评估胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌SDHA/B/C/D亚基基因的表达特征 |
2.2.3.5 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌的离体线粒体复合物Ⅱ活性影响 |
2.2.3.6 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌的活体线粒体复合物Ⅱ活性影响 |
2.2.4 胶孢炭疽菌SDHA/B/D亚基的原核表达及纯化 |
2.2.4.1 Cg SDHA/B/D亚基蛋白特征分析 |
2.2.4.2 Cg SDHA/B/D亚基基因克隆 |
2.2.4.3 原核表达载体的构建 |
2.2.4.4 融合蛋白的诱导表达 |
2.2.4.5 融合蛋白的纯化 |
2.2.5 胶孢炭疽菌SDHC亚基的原核表达及纯化 |
2.2.5.1 Cg SDHC亚基基因克隆 |
2.2.5.2 原核表达载体的构建 |
2.2.5.3 融合蛋白的诱导表达 |
2.2.5.4 融合蛋白的纯化 |
2.2.6 胶孢炭疽菌琥珀酸脱氢酶与SDHI类杀菌剂的结合特征分析 |
2.2.6.1 蛋白浓度测定 |
2.2.6.2 MST试验 |
2.2.7 胶孢炭疽菌SDHB/C/D亚基与SDHI类杀菌剂的分子动力学试验 |
2.2.7.1 序列联配及Cg SDHB/C/D亚基的同源建模 |
2.2.7.2 分子对接 |
2.2.7.3 分子动力学 |
2.2.8 胶孢炭疽菌SDHB亚基基因功能分析 |
2.2.8.1 基因组DNA的提取 |
2.2.8.2 敲除片段构建 |
2.2.8.3 原生质体制备和转化 |
2.2.8.4 敲除转化子的验证 |
2.2.8.5 回复子的构建 |
2.2.8.6 Cg SDHB亚基基因缺失突变体的表型分析 |
2.2.9 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌菌体渗透性能分析 |
2.2.9.1 胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌培养及菌丝样品的收集 |
2.2.9.2 菌丝内药剂的提取和检测 |
2.2.9.3 质谱条件 |
2.2.9.4 分析方法的可靠性检验 |
3 结果与分析 |
3.1 SDHI类杀菌剂的抑菌谱及防治效果差异 |
3.1.1 SDHI类杀菌剂的室内抑菌活性 |
3.1.2 SDHI类杀菌剂对辣椒炭疽病的保护和治疗效果 |
3.1.3 苯并烯氟菌唑、吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺防治辣椒炭疽病田间试验 |
3.2 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌的线粒体功能影响 |
3.2.1 对菌体呼吸速率的影响 |
3.2.2 对线粒体活力的影响 |
3.2.3 对菌体ATP含量的影响 |
3.2.4 对线粒体膜电位影响 |
3.3 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶功能影响 |
3.3.1 SDHB/C/D亚基氨基酸序列的对比分析 |
3.3.2 SDHI类杀菌剂对SDHA/B/C/D亚基基因在胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌中表达特征的影响 |
3.3.3 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶离体抑制活性 |
3.3.4 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌琥珀酸脱氢酶活体抑制活性 |
3.4 胶孢炭疽菌SDHA/B/C/D亚基原核表达及蛋白纯化 |
3.4.1 Cg SDHA/B/C/D亚基基因序列分析 |
3.4.2 Cg SDHA/B/C/D亚基基因的克隆及表达载体纯化 |
3.4.3 Cg SDHA/B/C/D亚基的表达纯化 |
3.5 胶孢炭疽菌SDHB/C/D亚基与6种SDHI类杀菌剂互作的分子动力学模拟 |
3.5.1 同源建模结果分析 |
3.5.2 动力学特征 |
3.5.3 MM-GBSA结合自由能 |
3.5.4 相互作用分析 |
3.6 胶孢炭疽菌SDHB亚基基因功能验证 |
3.6.1 Cg SDHB亚基基因敲除突变体及回复子的获得 |
3.6.2 Cg SDHB亚基基因缺失突变体对6种SDHI类杀菌剂敏感性分析 |
3.6.3 △Cg SDHB突变体的表型分析 |
3.6.3.1 △Cg SDHB突变体的菌丝生长速率及菌丝形态变化 |
3.6.3.2 △Cg SDHB突变体的分生孢子产生、萌发情况及形态变化 |
3.6.3.3 △Cg SDHB突变体在胁迫条件下生长情况 |
3.7 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌菌体渗透性能 |
3.7.1 SDHI类杀菌剂分析方法可靠性检验 |
3.7.2 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌菌体的渗透率 |
3.7.3 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌和灰葡萄孢菌菌体的渗透速率 |
4 讨论 |
4.1 研究杀菌剂抑菌谱差异的价值 |
4.2 SDHI类杀菌剂对胶孢炭疽菌线粒体功能影响与其抑菌活性呈正相关 |
4.3 SDHI类杀菌剂对琥珀酸脱氢酶酶活抑制作用及与靶标结合力是决定其抑菌活性差异因素之一 |
4.4 SDHI类杀菌剂与胶孢炭疽菌SDHB亚基存在结合偏好性 |
4.5 SDHI类杀菌剂对病原菌菌体渗透能力差异 |
5 结论 |
6 展望 |
7 本论文创新之处 |
8 参考文献 |
9 附录 |
10 致谢 |
11 项目资助 |
12 攻读学位期间发表论文、专利申请与获奖情况 |
(4)茉莉酸甲酯对蓝莓果实采后品质及抗病性调控机制研究(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
abstract |
第一章 前言 |
1.1 文献综述 |
1.1.1 蓝莓简介 |
1.1.2 蓝莓果实在储运过程中存在的主要问题 |
1.1.3 采后蓝莓保鲜研究进展 |
1.1.4 茉莉酸甲酯简介 |
1.1.5 茉莉酸甲酯简在果蔬采后中的应用 |
1.1.6 信号分子在茉莉酸甲酯所介导的抗性中的作用 |
1.2 本研究的立题背景与意义 |
1.3 本课题的主要研究内容 |
1.4 技术路线 |
第二章 MeJA对采后蓝莓抗氧化系统及果实品质的影响 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 实验材料 |
2.1.2 实验处理 |
2.1.3 主要试剂 |
2.1.4 主要仪器设备 |
2.1.5 失重率、TSS、TA和色度的测定 |
2.1.6 茉莉酸甲酯含量测定 |
2.1.7 总酚、总黄酮和花青素含量测定 |
2.1.8 AsA和GSH含量的测定 |
2.1.9 H_2O_2、MDA和 DPPH自由基清除率的测定 |
2.1.10 抗氧化酶活性测定 |
2.1.11 统计分析 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 茉莉酸甲酯对采后蓝莓失重率、TSS、TA和色泽的影响 |
2.2.2 茉莉酸甲酯对采后蓝莓TPC、TFC和 TAC的影响 |
2.2.3 茉莉酸甲酯对采后蓝莓AsA和GSH含量的影响 |
2.2.4 茉莉酸甲酯对采后蓝莓H_2O_2、MDA含量和DPPH自由基清除率的影响 |
2.2.5 茉莉酸甲酯对采后蓝莓抗氧化酶活性的影响 |
2.2.6 茉莉酸甲酯对采后蓝莓内MeJA含量的影响 |
2.3 讨论 |
2.4 本章小结 |
第三章 MeJA处理对采后蓝莓果实细胞壁和能量代谢的影响 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 实验材料 |
3.1.2 主要试剂 |
3.1.3 主要仪器设备 |
3.1.4 实验处理 |
3.1.5 采后蓝莓果实硬度的测定 |
3.1.6 采后蓝莓果实失重率的测定 |
3.1.7 采后蓝莓细胞壁分组的提取与测定 |
3.1.8 采后蓝莓细胞壁降解相关酶活性测定 |
3.1.9 采后蓝莓ATP、ADP、AMP和能荷的测定 |
3.1.10 采后蓝莓能量代谢相关酶活性测定 |
3.1.11 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析 |
3.1.12 统计分析 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 MeJA处理对采后蓝莓果实硬度的影响 |
3.2.2 MeJA处理对采后蓝莓失重率的影响 |
3.2.3 MeJA处理对采后蓝莓细胞壁组分的影响 |
3.2.4 MeJA处理对采后蓝莓细胞壁降解相关酶活性的影响 |
3.2.5 MeJA处理对采后蓝莓ATP、ADP、AMP和能荷的影响 |
3.2.6 MeJA处理对采后蓝莓能量代谢相关酶活性的影响 |
3.2.7 MeJA处理对采后蓝莓细胞壁降解相关基因表达水平的影响 |
3.2.8 MeJA处理对采后蓝莓能量代谢相关基因表达水平的影响 |
3.3 讨论 |
3.4 本章小结 |
第四章 MeJA处理对蓝莓采后灰霉病的调控机制研究 |
4.1 材料与方法 |
4.1.1 实验材料 |
4.1.2 主要试剂 |
4.1.3 主要仪器设备 |
4.1.4 实验处理 |
4.1.5 MeJA对灰葡萄孢菌体外抑菌效果研究 |
4.1.6 采后蓝莓果实发病指数的测定 |
4.1.7 采后蓝莓果实内NO和H_2O_2含量测定 |
4.1.8 采后蓝莓果实内抗氧化酶活性的测定 |
4.1.9 采后蓝莓果实内MDA含量的测定 |
4.1.10 采后蓝莓果实内防御酶活性的测定 |
4.1.11 采后蓝莓果实内TPC和TFC的测定 |
4.1.12 采后蓝莓果实内苯丙烷途径相关酶活性的测定 |
4.1.13 统计分析 |
4.2 结果与分析 |
4.2.1 MeJA处理对采后蓝莓果实发病指数的影响 |
4.2.2 MeJA对灰葡萄孢菌离体生长的影响 |
4.2.3 MeJA处理对采后蓝莓果实中NO和H_2O_2含量的影响 |
4.2.4 MeJA处理对采后蓝莓果实中抗氧化酶活性的影响 |
4.2.5 MeJA处理对采后蓝莓果实中MDA含量的影响 |
4.2.6 MeJA处理对采后蓝莓果实中防御酶活性的影响 |
4.2.7 MeJA处理对采后蓝莓果实中TPC和TFC的影响 |
4.2.8 MeJA处理对采后蓝莓果实中苯丙烷途径相关酶活性的影响 |
4.3 讨论 |
4.4 本章小结 |
第五章 MeJA处理对采后蓝莓抵抗灰霉病侵染的代谢组分析 |
5.1 材料与方法 |
5.1.1 实验材料 |
5.1.2 主要试剂 |
5.1.3 主要仪器设备 |
5.1.4 实验处理 |
5.1.5 代谢物提取 |
5.1.6 液相色谱条件 |
5.1.7 质谱条件 |
5.1.8 数据预处理 |
5.1.9 多元统计分析 |
5.1.10 差异代谢物分析 |
5.1.11 差异代谢物通路分析 |
5.2 结果与分析 |
5.2.1 质控分析 |
5.2.2 PCA分析 |
5.2.3 PLS-DA分析 |
5.2.4 代谢物分析 |
5.2.5 代谢物KEGG注释 |
5.2.6 差异代谢物分析 |
5.2.7 差异代谢物KEGG通路富集分析 |
5.3 讨论 |
5.4 本章小结 |
第六章 NO和H_2O_2在MeJA诱导蓝莓对灰霉病抗性中的作用 |
6.1 材料与方法 |
6.1.1 实验材料 |
6.1.2 主要试剂 |
6.1.3 主要仪器设备 |
6.1.4 实验处理 |
6.1.5 采后蓝莓果实发病指数的测定 |
6.1.6 采后蓝莓果实内NO和H_2O_2含量测定 |
6.1.7 采后蓝莓果实内NO代谢相关酶活性的测定 |
6.1.8 采后蓝莓果实内H_2O_2代谢相关酶活性的测定 |
6.1.9 采后蓝莓果实内防御酶活性的测定 |
6.1.10 采后蓝莓果实内TPC和TFC的测定 |
6.1.11 采后蓝莓果实内苯丙烷代谢途径相关酶活性的测定 |
6.1.12 qRT-PCR分析 |
6.1.13 统计分析 |
6.2 结果与分析 |
6.2.1 不同浓度cPTIO和DPI处理对采后蓝莓发病指数、NO和H_2O_2的影响 |
6.2.2 不同蓝莓果实处理组发病指数的变化 |
6.2.3 不同蓝莓果实处理组NO和H_2O_2含量的变化 |
6.2.4 不同蓝莓果实处理组NO代谢相关酶活性的变化 |
6.2.5 不同蓝莓果实处理组H_2O_2代谢相关酶活性的变化 |
6.2.6 不同蓝莓果实处理组防御酶活性的变化 |
6.2.7 不同蓝莓果实处理组TPC和 TFC的变化 |
6.2.8 不同蓝莓果实处理组苯丙烷代谢途径相关酶活性的变化 |
6.2.9 不同蓝莓果实处理组苯丙烷代谢途径相关基因表达水平的变化 |
6.3 讨论 |
6.4 本章小结 |
第七章 全文结论和展望 |
7.1 主要结论 |
7.2 论文主要创新点 |
7.3 展望 |
博士期间发表的论文 |
参考文献 |
附录 |
(5)我国葡萄灰霉菌对主要杀菌剂的抗药突变型分布与多药抗性机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
主要符号对照表 |
第一章 绪论 |
1.1 葡萄灰霉病概述 |
1.1.1 葡萄灰霉病的发生与分布 |
1.1.2 葡萄灰霉病的防治 |
1.2 葡萄灰霉病防治常用化学杀菌剂的作用机制及抗性研究现状 |
1.2.1 二甲酰亚胺类 |
1.2.2 苯并咪唑类 |
1.2.3 苯吡咯类 |
1.2.4 苯氨基嘧啶类 |
1.2.5 烟酰胺类 |
1.2.6 咪唑类 |
1.2.7 有机硫类 |
1.3 葡萄灰霉病菌多药抗性研究概况 |
1.4 葡萄灰霉病菌抗药性检测方法 |
1.5 本研究的目的及意义 |
1.6 技术路线 |
第二章 我国葡萄灰霉病菌的多菌灵和异菌脲抗性突变型分布研究 |
2.1 试验材料 |
2.1.1 供试菌株 |
2.1.2 培养基 |
2.1.3 主要仪器 |
2.1.4 主要试剂 |
2.1.5 试验药剂 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 葡萄灰霉病菌的活化 |
2.2.2 葡萄灰霉病菌DNA的提取 |
2.2.3 目的基因片段的扩增 |
2.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳 |
2.2.5 扩增产物测序 |
2.2.6 不同抗性突变类型菌株的抗性水平测定 |
2.3 数据分析 |
2.4 结果与分析 |
2.4.1 葡萄灰霉病菌对多菌灵的抗性频率 |
2.4.2 葡萄灰霉病菌对多菌灵的抗性突变型分布 |
2.4.3 多菌灵不同抗性突变型菌株的抗性水平 |
2.4.4 葡萄灰霉病菌对异菌脲的抗性突变频率 |
2.4.5 葡萄灰霉病菌对异菌脲的抗性突变型分布 |
2.4.6 异菌脲不同抗性突变型菌株的抗性水平 |
2.5 小结与讨论 |
第三章 我国葡萄灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性突变型分布研究 |
3.1 试验材料 |
3.1.1 供试菌株 |
3.1.2 培养基 |
3.1.3 主要仪器 |
3.1.4 主要试剂 |
3.1.5 试验药剂 |
3.2 试验方法 |
3.2.1 利用测序技术检测抗性突变类型 |
3.2.2 不同突变型葡萄灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性验证 |
3.2.3 不同抗性突变类型菌株的抗性水平测定 |
3.3 数据处理 |
3.4 结果与分析 |
3.4.1 葡萄灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性频率 |
3.4.2 葡萄灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性突变型分布 |
3.4.3 不同突变型葡萄灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性验证 |
3.4.4 啶酰菌胺的抗性突变型与抗性水平的关系 |
3.5 小结与讨论 |
第四章 我国葡萄灰霉病菌对多菌灵、异菌脲和啶酰菌胺的多药抗性研究 |
4.1 供试菌株 |
4.2 试验方法 |
4.3 数据分析 |
4.4 结果与分析 |
4.4.1 葡萄灰霉病菌对多菌灵、异菌脲和啶酰菌胺的多药抗性类型及其频率 |
4.4.2 葡萄灰霉病菌对多菌灵、异菌脲和啶酰菌胺的多药抗性突变分布 |
4.5 小结与讨论 |
第五章 我国葡萄灰霉病菌对咯菌腈的抗性及MDR1型多药抗性机制研究 |
5.1 试验材料 |
5.1.1 供试菌株 |
5.1.2 培养基 |
5.1.3 主要仪器 |
5.1.4 主要试剂 |
5.2 试验方法 |
5.2.1 葡萄灰霉病菌的活化 |
5.2.2 葡萄灰霉病菌对咯菌腈的抗性初测 |
5.2.3 葡萄灰霉病菌对咯菌腈敏感基线的建立 |
5.2.4 葡萄灰霉病菌MDR1型多药抗性的机制研究 |
5.3 数据分析 |
5.4 结果与分析 |
5.4.1 葡萄灰霉病菌对咯菌腈的抗性现状及敏感基线的建立 |
5.4.2 MDR1型多药抗性机制的研究 |
5.5 小结与讨论 |
第六章 结论 |
参考文献 |
附录A |
致谢 |
作者简历 |
(6)指状青霉菌对啶酰菌胺的抗性风险和抗性机制的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 前言 |
1.1 指状青霉菌 |
1.1.1 指状青霉菌和柑橘绿霉病 |
1.1.2 指状青霉菌抗药性的发生 |
1.2 琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂 |
1.2.1 琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂简介 |
1.2.2 啶酰菌胺 |
1.2.3 植物病原菌对啶酰菌胺的抗药性风险 |
1.2.4 植物病原菌对啶酰菌胺的抗性发生情况及抗性机制 |
1.3 研究的目的及意义 |
第二章 啶酰菌胺对指状青霉菌的抑制作用 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 供试菌株及供试柑橘 |
2.1.2 供试药剂及试剂 |
2.1.3 仪器设备 |
2.1.4 培养基制备、母液配制 |
2.1.5 供试菌株的分离纯化 |
2.1.6 供试菌株的活化、孢子悬浮液及接种菌饼的制备 |
2.1.7 指状青霉菌对啶酰菌胺敏感性基线的建立 |
2.1.8 啶酰菌胺和咯菌腈对指状青霉菌菌丝生长EC50值相关性分析 |
2.1.9 啶酰菌胺对指状青霉菌孢子萌发与菌丝生长EC50值相关性分析 |
2.1.10 啶酰菌胺在柑橘果实上对柑橘绿霉病的保护作用 |
2.1.11 啶酰菌胺对指状青霉菌孢子萌发率及萌发后菌丝的生长和致病力的影响 |
2.1.12 啶酰菌胺对指状青霉菌孢子产量及孢子致病力的影响 |
2.1.12.1 PDA上啶酰菌胺对指状青霉菌孢子产量及孢子致病力的影响 |
2.1.12.2 果实上啶酰菌胺处理对指状青霉菌孢子产量及孢子致病力的影响 |
2.1.13 啶酰菌胺对指状青霉菌菌丝形态的影响 |
2.1.14 啶酰菌胺对指状青霉菌菌丝体内活性氧(ROS)含量的影响 |
2.1.14.1 啶酰菌胺对指状青霉菌菌丝体内超氧根阴离子(O2-)含量的影响 |
2.1.14.2 啶酰菌胺对指状青霉菌菌丝体内过氧化氢(H2O2)含量的影响 |
2.1.15 啶酰菌胺对指状青霉菌琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的影响 |
2.1.16 啶酰菌胺对指状青霉菌超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 |
2.1.17 啶酰菌胺对指状青霉菌过氧化物酶(POD)活性的影响 |
2.1.18 数据处理与分析 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 指状青霉菌对啶酰菌胺的敏感性基线 |
2.2.2 啶酰菌胺和咯菌腈对指状青霉菌菌丝生长EC50值相关性分析 |
2.2.3 啶酰菌胺对指状青霉菌孢子萌发与菌丝生长EC50值相关性分析 |
2.2.4 啶酰菌胺对柑橘绿霉病的防效 |
2.2.5 啶酰菌胺对指状青霉菌孢子萌发及萌发后菌丝生长和致病力的影响 |
2.2.6 啶酰菌胺对指状青霉菌孢子产量及孢子致病力的影响 |
2.2.6.1 PDA中啶酰菌胺对指状青霉菌孢子产量及孢子致病力的影响 |
2.2.6.2 果实上啶酰菌胺处理对指状青霉菌孢子产量及孢子致病力的影响 |
2.2.7 啶酰菌胺对指状青霉菌菌丝形态的影响 |
2.2.8 啶酰菌胺对指状青霉菌菌丝体内ROS含量的影响 |
2.2.9 啶酰菌胺对指状青霉菌SOD和 POD酶活性的影响 |
2.2.10 啶酰菌胺对指状青霉菌靶标酶SDH酶活性的影响 |
2.3 讨论 |
第三章 指状青霉菌对啶酰菌胺抗性风险及抗性机制的研究 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 供试菌株与柑橘 |
3.1.2 供试药剂及试剂 |
3.1.3 仪器设备 |
3.1.4 培养基制备、母液配制和菌株活化 |
3.1.5 啶酰菌胺抗性突变体的诱导 |
3.1.6 啶酰菌胺抗性突变体的抗性稳定性 |
3.1.7 啶酰菌胺与其它杀菌剂的交互抗性 |
3.1.8 啶酰菌胺抗性突变体的适合度 |
3.1.8.1 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本的菌丝生长速率、孢子产量及孢子萌发速率 |
3.1.8.2 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本的致病力 |
3.1.8.3 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本对渗透压的敏感性 |
3.1.8.4 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本对水杨羟肟酸(SHAM)的敏感性 |
3.1.8.5 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本对双氧水的敏感性 |
3.1.9 指状青霉菌琥珀酸脱氢酶基因的进化分析 |
3.1.10 啶酰菌胺抗性突变体琥珀酸脱氢酶(SDH)突变位点分析 |
3.1.10.1 指状青霉菌基因组DNA的提取 |
3.1.10.2 PCR引物的设计及合成 |
3.1.10.3 琥珀酸脱氢酶基因(SDH)PCR扩增 |
3.1.10.4 电泳检测及测序 |
3.1.11 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本琥珀酸脱氢酶基因的表达量分析 |
3.1.11.1 指状青霉菌总RNA的提取 |
3.1.11.2 反转录合成cDNA |
3.1.11.3 实时荧光定量PCR引物的设计 |
3.1.11.4 实时荧光定量PCR |
3.1.12 分生孢子形成过程相关基因的表达量分析 |
3.1.12.1 指状青霉菌总RNA的提取 |
3.1.12.2 反转录合成cDNA |
3.1.12.3 实时荧光定量PCR引物的设计与合成 |
3.1.12.4 实时荧光定量PCR |
3.1.13 数据处理与分析 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 啶酰菌胺抗性突变体的诱导及其抗性水平 |
3.2.2 啶酰菌胺抗性突变体的抗性稳定性 |
3.2.3 啶酰菌胺与其它杀菌剂的交互抗性 |
3.2.4 啶酰菌胺抗性突变体的适合度 |
3.2.4.1 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本的菌丝生长速率、孢子产量和孢子萌发速率 |
3.2.4.2 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本的致病力 |
3.2.4.3 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本对渗透压的敏感性 |
3.2.4.4 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本水杨羟肟酸(SHAM)的敏感性 |
3.2.4.5 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本对H2O2的敏感性 |
3.2.5 指状青霉菌琥珀酸脱氢酶基因进化分析 |
3.2.6 啶酰菌胺抗性突变体琥珀酸脱氢酶基因突变位点分析 |
3.2.7 啶酰菌胺抗性突变体及其亲本琥珀酸脱氢酶基因表达量分析 |
3.2.8 啶酰菌胺抗性突变体分生孢子形成过程相关基因表达量分析 |
3.3 讨论 |
第四章 全文总结 |
参考文献 |
附录 Sdh基因序列测序结果 |
攻读硕士期间发表和投稿论文 |
致谢 |
(7)磺酰胺类化合物SYAUP-CN-26对灰葡萄孢菌作用机理研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一章 杀菌剂的作用机理及作用机理研究方法的研究进展 |
1.1 灰葡萄孢菌及其危害 |
1.2 杀菌剂的作用机理 |
1.2.1 抑制真菌细胞壁的形成 |
1.2.2 抑制真菌细胞膜的形成 |
1.2.3 抑制真菌细胞氨基酸和蛋白质合成 |
1.2.4 抑制真菌细胞核酸合成 |
1.2.5 抑制真菌细胞分裂 |
1.2.6 抑制真菌能量合成和呼吸代谢 |
1.2.7 抑制真菌细胞信号传导 |
1.2.8 诱导寄主产生抗病性 |
1.3 杀菌剂作用机理的研究方法 |
1.3.1 显微镜观察法 |
1.3.2 同位素技术 |
1.3.3 波谱色谱分析法 |
1.3.4 转录组学 |
1.3.5 蛋白组学 |
1.3.6 代谢组学 |
1.3.7 对化合物、菌体靶点以及两者相互作用的结构研究 |
1.3.8 其他方法 |
1.4 研究背景及意义 |
第二章 磺酰胺类化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌生物合成的影响 |
2.1 材料 |
2.1.1 试验材料 |
2.1.2 供试菌株 |
2.1.3 供试培养基 |
2.1.4 供试仪器 |
2.1.5 供试试剂 |
2.2 试验方法 |
2.2.1 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌几丁质酶活性的影响 |
2.2.2 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌细胞内外还原糖含量的影响 |
2.2.3 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌可溶性蛋白含量的影响 |
2.2.4 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌电导率的影响 |
2.2.5 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌丙二醛(MDA)含量的影响 |
2.2.6 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌麦角甾醇含量的影响 |
2.2.7 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌细胞外DNA和 RNA含量的影响 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌几丁质酶活性的影响 |
2.3.2 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌细胞内外还原糖含量的影响 |
2.3.3 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌可溶性蛋白含量的影响 |
2.3.4 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌电导率的影响 |
2.3.5 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌丙二醛(MDA)含量的影响 |
2.3.6 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌麦角甾醇含量的影响 |
2.3.7 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌细胞外DNA和 RNA含量的影响 |
2.4 小结与讨论 |
第三章 磺酰胺类化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢呼吸代谢及ATP含量的影响 |
3.1 材料 |
3.1.1 试验材料 |
3.1.2 供试菌株 |
3.1.3 供试培养基 |
3.1.4 供试仪器 |
3.1.5 供试试剂 |
3.2 试验方法 |
3.2.1 不同浓度药剂处理不同时间对灰葡萄孢菌呼吸代谢的影响 |
3.2.2 不同浓度药剂处理对不同菌龄灰葡萄孢菌呼吸代谢的影响 |
3.2.3 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌耗氧叠加率的影响 |
3.2.4 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢ATP含量的影响 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 不同浓度药剂处理不同时间对灰葡萄孢菌呼吸代谢的影响 |
3.3.2 不同浓度药剂处理对不同菌龄灰葡萄孢菌呼吸代谢的影响 |
3.3.3 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌耗氧叠加率的影响 |
3.3.4 化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢ATP含量的影响 |
3.4 小结与讨论 |
第四章 磺酰胺类化合物SYAUP-CN-26 对灰葡萄孢菌线粒体功能的影响 |
4.1 材料 |
4.1.1 试验材料 |
4.1.2 供试菌株 |
4.1.3 供试培养基 |
4.1.4 供试仪器 |
4.1.5 供试试剂 |
4.2 试验方法 |
4.2.1 灰葡萄孢菌线粒体的提取 |
4.2.2 灰葡萄孢菌线粒体膜通透性转运孔(MPTP)开放度测定 |
4.2.3 灰葡萄孢菌线粒体呼吸链复合物活性测定 |
4.2.4 灰葡萄孢菌F1F0-ATP合酶(复合体Ⅴ)活性测定 |
4.3 结果与分析 |
4.3.1 灰葡萄孢菌线粒体膜通透性转运孔(MPTP)开放度测定 |
4.3.2 灰葡萄孢菌线粒体呼吸链复合物活性测定 |
4.3.3 灰葡萄孢菌F1F0-ATP合酶(复合体Ⅴ)活性 |
4.4 小结与讨论 |
第五章 结论与展望 |
5.1 结论 |
5.2 存在的问题及展望 |
参考文献 |
致谢 |
(8)人参灰霉病菌遗传多样性分析及抗药性研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
第一章 文献综述 |
1. 灰葡萄孢 |
1.1 灰葡萄孢菌 |
1.2 灰葡萄孢菌的致病机理 |
2. 人参灰霉病的研究进展 |
2.1 人参灰霉病的发生与危害 |
2.2 灰霉病的发病规律 |
2.3 灰霉病的防治 |
3. 灰葡萄孢遗传多样性及研究方法 |
3.1 遗传多样性 |
3.2 遗传多样性的研究方法 |
3.3 灰葡萄孢遗传多样性研究现状 |
4. 灰葡萄孢对杀菌剂抗性的研究现状 |
5. 研究目的与意义 |
第二章 人参灰葡萄孢的分离与鉴定 |
1. 材料与方法 |
1.1 试验材料 |
1.2 仪器与试剂 |
1.3 菌株分离与保存 |
1.4 灰葡萄孢形态特征观察及分类 |
1.5 灰葡萄孢分子鉴定 |
2. 结果与分析 |
2.1 形态类型分析 |
2.2 分子鉴定结果 |
3. 讨论 |
第三章 人参灰葡萄孢遗传多样性分析 |
1. 材料与方法 |
1.1 实验材料与仪器 |
1.2 引物合成 |
1.3 引物初筛 |
1.4 ISSR-PCR反应 |
1.5 数据分析 |
2. 结果与分析 |
2.1 引物初筛结果 |
2.2 ISSR引物扩增结果 |
2.3 遗传多样性分析及聚类分析结果 |
3. 讨论 |
第四章 人参灰葡萄孢致病力分析 |
1. 材料与方法 |
1.1 试验材料 |
1.2 接种体制备 |
1.3 接种 |
2. 结果与分析 |
2.1 人参叶片发病症状 |
2.2 病斑直径 |
2.3 灰葡萄孢致病力等级划分 |
2.4 灰葡萄孢致病力分析 |
2.5 致病力与形态类型的关系 |
3. 讨论 |
第五章 人参灰葡萄孢对4种杀菌剂的抗性 |
1. 材料与方法 |
1.1 实验材料 |
1.2 活化菌株 |
1.3 接种 |
1.4 统计抗药性频率 |
2. 结果与分析 |
2.1 人参灰葡萄孢抗性频率 |
2.2 人参灰葡萄孢抗性类型 |
3. 讨论 |
总结与展望 |
参考文献 |
附录一 溶液及培养基配制 |
附录二 ITS序列测序结果 |
作者简介 |
在校期间论文发表情况 |
致谢 |
(9)灰葡萄孢细胞自噬的生物学功能及其调控咯菌腈敏感性的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号及缩略说明表 |
第一章 文献综述 |
1 灰霉病研究进展 |
1.1 灰霉病概述 |
1.2 灰霉病菌的生物学特征 |
1.3 灰霉病的症状 |
1.4 灰霉病的病害循环及发病规律 |
1.5 灰霉病的防治现状 |
1.5.1 化学防治 |
1.5.2 农业防治 |
1.5.3 生物防治 |
2 细胞自噬研究进展 |
2.1 细胞自噬的类型 |
2.1.1 巨自噬 |
2.1.2 微自噬 |
2.1.3 Cytoplasm to vesicle transport (Cvt)途径 |
2.1.4 内质网自噬 |
2.1.5 线粒体自噬 |
2.1.6 过氧化物酶体自噬 |
2.2 巨自噬的基本过程 |
2.2.1 自噬的诱导 |
2.2.2 自噬体的形成 |
2.2.3 自噬体的融合 |
2.2.4 自噬小体的降解和再循环 |
2.3 细胞自噬的检测方法 |
2.3.1 Western blot检测Atg8的降解 |
2.3.2 显微镜观察 |
2.3.3 MDC染色 |
2.4 细胞自噬的功能 |
2.4.1 自噬在酵母中的功能 |
2.4.2 自噬在丝状真菌中的功能 |
2.4.3 自噬在植物中的功能 |
2.4.4 自噬在哺乳动物中的功能 |
参考文献 |
第二章 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG1的生物学和药理学功能研究 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株和质粒 |
1.2 供试培养基 |
1.3 供试药剂 |
1.4 供试植物 |
1.5 灰葡萄孢DNA和RNA提取 |
1.6 PCR反应体系及程序 |
1.6.1 常规PCR |
1.6.2 反转录PCR(RT-PCR) |
1.6.3 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
1.7 DNA克隆技术 |
1.7.1 酶切反应体系: |
1.7.2 T4 DNA连接酶反应体系: |
1.7.3 大肠杆菌转化 |
1.8 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG1的鉴定及序列比对 |
1.9 灰葡萄孢BcATG1同源互补酵母突变体 |
1.9.1 载体构建 |
1.9.2 酵母转化 |
1.9.3 验证 |
1.10 灰葡萄孢BcATG1的表达响应碳源和氮源饥饿 |
1.11 灰葡萄孢BcATG1基因敲除和回复 |
1.11.1 基因敲除载体的构建 |
1.11.2 PEG介导的灰葡萄孢原生质体转化 |
1.11.3 基因敲除突变体的验证 |
1.11.4 基因回复载体的构建 |
1.12 灰葡萄孢BcATG1敲除突变体表型分析 |
1.12.1 灰葡萄孢细胞自噬过程发生的检测 |
1.12.2 灰葡萄孢菌丝生长测定 |
1.12.3 灰葡萄孢孢子产生测定 |
1.12.4 灰葡萄孢菌核形成测定 |
1.12.5 灰葡萄孢致病力分析 |
1.12.6 灰葡萄孢对杀菌剂敏感性测定 |
1.12.7 灰葡萄孢甘油含量测定 |
1.12.8 灰葡萄孢尼罗红(Nile red)染色 |
1.12.9 三酰基甘油(Triacylglycerol,TAG)含量测定 |
2 结果与分析 |
2.1 灰葡萄孢BcATG1的鉴定及序列分析 |
2.2 灰葡萄孢BcATG1同源互补酿酒酵母缺失突变体 |
2.3 灰葡萄孢BcATG1在饥饿胁迫条件下的表达 |
2.4 灰葡萄孢BcATG1基因敲除和回复 |
2.5 灰葡萄孢BcATG1基因敲除突变体和回复菌株的表型分析 |
2.5.1 BcATG1在灰葡萄孢细胞自噬发生过程中作用 |
2.5.2 BcATG1影响灰葡萄孢对咯菌腈的敏感性 |
2.5.3 BcATG1对灰葡萄孢菌丝生长的影响 |
2.5.4 BcATG1对灰葡萄孢产孢和菌核形成的影响 |
2.5.5 BcATG1对灰葡萄孢致病力的作用 |
2.5.6 BcATG1对灰葡萄孢侵染结构形成的影响 |
2.5.7 BcATG1对灰葡萄孢脂滴代谢的影响 |
2.5.8 BcATG1对灰葡萄孢菌体甘油含量的影响 |
3 讨论 |
参考文献 |
第三章 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG8的生物学和药理学功能研究 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株和质粒 |
1.2 供试培养基 |
1.3 供试药剂 |
1.4 供试植物 |
1.5 灰葡萄孢DNA和RNA提取 |
1.6 灰葡萄孢总蛋白提取 |
1.7 PCR反应体系及程序 |
1.7.1 常规PCR |
1.7.2 反转录PCR(RT-PCR) |
1.7.3 荧光定量PCR (qRT-PCR) |
1.8 一步克隆法载体构建反应 |
1.9 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG8的鉴定及系统进化分析 |
1.10 酵母同源回补分析 |
1.11 酵母双杂 |
1.11.1 载体构建 |
1.11.2 酵母转化 |
1.12 灰葡萄孢BcATG8的基因敲除与回复 |
1.12.1 基因敲除载体的构建 |
1.12.2 PEG介导的灰葡萄孢原生质体转化 |
1.12.3 基因敲除突变体的验证 |
1.12.4 GFP融合蛋白回复载体的构建 |
1.13 BcATG8敲除突变体的表型分析 |
1.13.1 细胞自噬过程的发生 |
1.13.2 灰葡萄孢菌丝生长测定 |
1.13.3 灰葡萄孢产孢量分析 |
1.13.4 灰葡萄孢菌核形成测定 |
1.13.5 灰葡萄孢致病力分析 |
1.13.6 灰葡萄孢杀菌剂敏感性测定 |
1.13.7 灰葡萄孢尼罗红(Nile red)染色 |
1.13.8 灰葡萄孢脂滴代谢相关基因的表达量测定 |
1.13.9 灰葡萄孢甘油含量测定 |
2 结果与分析 |
2.1 灰葡萄孢BcATG8的鉴定及系统进化分析 |
2.2 灰葡萄孢BcATG8同源互补酿酒酵母缺失突变体 |
2.3 灰葡萄孢BcAtg8和BcAtg4酵母双杂 |
2.4 灰葡萄孢BcAtg8亚细胞定位 |
2.5 细胞自噬的标记GFP-BcAtg8分析细胞自噬过程 |
2.6 灰葡萄孢BcATG8的基因敲除与回复 |
2.7 BcATG8的生物学功能分析 |
2.7.1 BcATG8在细胞自噬过程中的作用 |
2.7.2 BcATG8影响灰葡萄孢对咯菌腈的敏感性 |
2.7.3 BcATG8影响灰葡萄孢在不同营养条件的菌丝生长 |
2.7.4 BcATG8对灰葡萄孢产孢、孢子萌发和菌核形成的影响 |
2.7.5 BcATG8对灰葡萄孢致病力的作用 |
2.7.6 BcATG8对灰葡萄孢脂滴代谢的影响 |
2.7.7 BcATG8对灰葡萄孢甘油含量的影响 |
3 讨论 |
参考文献 |
第四章 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG4的生物学和药理学功能研究 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株和质粒 |
1.2 供试培养基 |
1.3 供试药剂 |
1.4 供试植物 |
1.5 灰葡萄孢DNA和RNA提取 |
1.6 灰葡萄孢总蛋白提取 |
1.7 PCR反应体系及程序 |
1.8 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG4的鉴定及系统进化分析 |
1.9 酵母同源互补分析 |
1.10 灰葡萄孢BcATG4的基因敲除与回复 |
1.10.1 基因敲除载体的构建 |
1.10.2 PEG介导的灰葡萄孢原生质体转化 |
1.10.3 基因敲除突变体的验证 |
1.10.4 GFP融合蛋白回复载体的构建 |
1.11 灰葡萄孢BcATG4敲除突变体的表型分析 |
1.11.1 细胞自噬过程的观察 |
1.11.2 灰葡萄孢菌丝生长测定 |
1.11.3 灰葡萄孢产分生孢子分析 |
1.11.4 灰葡萄孢菌核形成测定 |
1.11.5 灰葡萄孢致病力分析 |
1.11.6 灰葡萄孢对杀菌剂敏感性测定 |
1.11.7 灰葡萄孢甘油含量测定 |
2 结果与分析 |
2.1 灰葡萄孢BcATG4的鉴定及系统进化分析 |
2.2 灰葡萄孢BcATG4同源互补酿酒酵母缺失突变体 |
2.3 灰葡萄孢BcAtg4的亚细胞定位 |
2.4 灰葡萄孢BcATG4的基因敲除与回复 |
2.5 灰葡萄孢BcATG4的生物学功能分析 |
2.5.1 BcATG4在灰葡萄孢细胞自噬过程中的作用 |
2.5.2 BcATG4影响灰葡萄孢对咯菌腈的敏感性 |
2.5.3 BcATG4对灰葡萄孢菌体甘油含量的影响 |
2.5.4 BcATG4在灰葡萄孢菌丝生长中的作用 |
2.5.5 BcATG4对灰葡萄孢产孢、形态和萌发的影响 |
2.5.6 BcATG4对灰葡萄孢菌核形成的影响 |
2.5.7 BcATG4在灰葡萄孢致病力中的作用 |
2.5.8 BcATG4对灰葡萄孢侵染结构形成的影响 |
3 讨论 |
参考文献 |
第五章 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG3和BcATG7的生物学功能研究 |
1 材料与方法 |
1.1 菌株和质粒 |
1.2 供试培养基 |
1.3 供试植物 |
1.4 灰葡萄孢DNA和RNA提取 |
1.5 灰葡萄孢总蛋白提取 |
1.6 PCR反应 |
1.7 灰葡萄孢细胞自噬基因BcATG3和BcATG7的鉴定及序列分析 |
1.8 酵母双杂 |
1.8.1 载体构建 |
1.8.2 酵母转化 |
1.9 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7的基因敲除与回复 |
1.9.1 基因敲除载体的构建 |
1.9.2 PEG介导的灰葡萄孢原生质体转化 |
1.9.3 基因敲除突变体的验证 |
1.9.4 GFP融合蛋白回复载体的构建 |
1.10 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7敲除突变体的表型分析 |
1.10.1 灰葡萄孢细胞自噬过程的检测 |
1.10.2 灰葡萄孢菌丝生长测定 |
1.10.3 灰葡萄孢产孢量分析 |
1.10.4 灰葡萄孢菌核形成测定 |
1.10.5 灰葡萄孢致病力分析 |
2 结果与分析 |
2.1 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7的鉴定及序列分析 |
2.2 灰葡萄孢BcAtg3和BcAtg7酵母双杂分析 |
2.3 灰葡萄孢BcAtg3和BcAtg7亚细胞定位 |
2.4 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7的基因敲除与回复 |
2.5 灰葡萄孢BcATG3和BcATG7的生物学功能分析 |
2.5.1 BcATG3和BcATG7在灰葡萄孢细胞自噬过程中的作用 |
2.5.2 BcATG3和BcATG7对灰葡萄孢菌丝生长的影响 |
2.5.3 BcATG3和BcATG7对灰葡萄孢产孢量的影响 |
2.5.4 BcATG3和BcATG7对灰葡萄孢菌核形成的影响 |
2.5.5 BcATG3和BcATG7对灰葡萄孢致病力的影响 |
3 讨论 |
参考文献 |
结论 |
一、本文获得的主要结果: |
二、本文的主要创新点: |
三、本文尚待解决的问题: |
附录 |
攻读博士学位期间发表的学术论文 |
致谢 |
(10)多菌灵对灰葡萄孢菌致病力低剂量刺激作用的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 前言 |
1.1 多菌灵及灰葡萄孢菌简介 |
1.2 低剂量刺激作用 |
1.2.1 低剂量刺激作用的概念 |
1.2.2 低剂量刺激作用的机理 |
1.2.3 杀菌剂的低剂量刺激作用 |
1.3 本研究的目的与意义 |
第二章 多菌灵对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用 |
2.1 材料与方法 |
2.1.1 供试菌株与供试寄主植物 |
2.1.2 供试药剂及试剂 |
2.1.3 主要仪器及设备 |
2.1.4 培养基制备、药剂母液配制及菌株活化 |
2.1.5 试剂配制 |
2.1.6 喷施多菌灵对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用 |
2.1.7 含多菌灵PDA上生长对致病力的刺激作用 |
2.1.8 多菌灵预处理对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用 |
2.1.9 多菌灵对灰葡萄孢菌致病力低剂量刺激作用的时间进程 |
2.1.10 含低剂量多菌灵PDA对灰葡萄孢菌菌核形成的影响 |
2.1.11 含低剂量多菌灵PDA对灰葡萄孢菌产孢量和孢子萌发率的影响 |
2.1.12 低剂量多菌灵对灰葡萄孢菌耐过氧化氢能力的影响 |
2.1.13 低剂量多菌灵对灰葡萄孢菌产生草酸能力的影响 |
2.1.14 低剂量多菌灵对灰葡萄孢菌漆酶活性的影响 |
2.1.15 低剂量多菌灵对灰葡萄孢菌致病相关基因表达量的影响 |
2.1.16 数据处理与分析 |
2.2 结果与分析 |
2.2.1 喷施多菌灵对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用 |
2.2.2 含多菌灵PDA上生长对致病力的刺激作用 |
2.2.3 多菌灵预处理对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用 |
2.2.4 多菌灵对灰葡萄孢菌致病力低剂量刺激作用的时间进程 |
2.2.5 含低剂量多菌灵PDA对灰葡萄孢菌菌核形成的影响 |
2.2.6 含低剂量多菌灵PDA对灰葡萄孢菌产孢量和孢子萌发率的影响 |
2.2.7 低剂量多菌灵对灰葡萄孢菌耐过氧化氢能力的影响 |
2.2.8 低剂量多菌灵对灰葡萄孢菌产生草酸能力的影响 |
2.2.9 低剂量多菌灵对灰葡萄孢菌漆酶活性的影响 |
2.2.10 低剂量多菌灵对灰葡萄孢菌致病相关基因表达量的影响 |
2.3 讨论 |
第三章 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用 |
3.1 材料与方法 |
3.1.1 供试菌株与寄主植物 |
3.1.2 供试药剂及试剂 |
3.1.3 主要仪器及设备 |
3.1.4 培养基制备、药剂母液配制及菌株活化 |
3.1.5 同时喷施多菌灵和异菌脲对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用 |
3.1.6 在含多菌灵和异菌脲的PDA上生长对致病力的刺激作用 |
3.1.7 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌细胞膜通透性的影响 |
3.1.8 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌渗透压敏感性的影响 |
3.1.9 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌耐过氧化氢能力的影响 |
3.1.10 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌胞外多糖含量的影响 |
3.1.11 数据处理与分析 |
3.2 结果与分析 |
3.2.1 同时喷施多菌灵和异菌脲对灰葡萄孢菌致病力的低剂量刺激作用 |
3.2.2 在含多菌灵和异菌脲的PDA上生长对致病力的刺激作用 |
3.2.3 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌细胞膜通透性的影响 |
3.2.4 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌渗透压敏感性的影响 |
3.2.5 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌耐过氧化氢能力的影响 |
3.2.6 多菌灵和异菌脲混用对灰葡萄孢菌胞外多糖含量的影响 |
3.3 讨论 |
第四章 总结与展望 |
4.1 总结 |
4.2 展望 |
参考文献 |
攻读硕士期间发表论文 |
致谢 |
四、不同抗性型灰葡萄孢菌Botrytis cinerea对不同作用机制杀菌剂的敏感性研究(论文参考文献)
- [1]灰葡萄孢自然群体交配型鉴定及有性生殖引起的遗传变异分析[D]. 杨蕊. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]番茄中灰霉菌小种Taian致病力的探究[D]. 李晓宇. 山东农业大学, 2021(01)
- [3]琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂对炭疽病菌的毒力差异机制[D]. 高杨杨. 山东农业大学, 2021
- [4]茉莉酸甲酯对蓝莓果实采后品质及抗病性调控机制研究[D]. 王瀚博. 南京林业大学, 2021(02)
- [5]我国葡萄灰霉菌对主要杀菌剂的抗药突变型分布与多药抗性机制研究[D]. 贾爽爽. 中国农业科学院, 2020
- [6]指状青霉菌对啶酰菌胺的抗性风险和抗性机制的研究[D]. 徐倩茹. 华中农业大学, 2020(02)
- [7]磺酰胺类化合物SYAUP-CN-26对灰葡萄孢菌作用机理研究[D]. 冯庭跃. 沈阳农业大学, 2020(08)
- [8]人参灰霉病菌遗传多样性分析及抗药性研究[D]. 刘琨. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]灰葡萄孢细胞自噬的生物学功能及其调控咯菌腈敏感性的机制研究[D]. 任维超. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]多菌灵对灰葡萄孢菌致病力低剂量刺激作用的研究[D]. 丛梦龙. 华中农业大学, 2018(02)