一、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的形态及其形态发生电镜观察（论文文献综述）
周悦南[1]（2021）在《菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究》文中研究指明寄生蜂是一类营寄生生活的膜翅目昆虫,其寄主大部分为鳞翅目害虫。菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis是世界性十字花科蔬菜害虫小菜蛾Plutella xylostella的一类优势寄生蜂。其成功寄生需要精准调控寄主的生长发育和免疫,这些功能的实现主要依赖于寄生蜂体内携带的多种寄生因子,包括多分DNA病毒（Polydnavirus,PDV）、毒液、畸形细胞等。其中PDV是稳定整合在寄生蜂基因组上的一类共生病毒,仅能特异地在雌性寄生蜂卵巢的卵萼细胞（calyx cell）内发生复制和组装。PDV前病毒包括两部分,一是能够形成环状的双链DNA分子,此为成熟病毒粒子的基因组成分,另一部分功能为辅助病毒复制、组装并成熟,本研究统称这类基因为内源病毒元件（endogenous virus elements,EVEs）。一直以来,对PDV的研究主要围绕PDV环状基因组中的毒性基因对寄主昆虫的生理调控,而对PDV在寄生蜂体内的复制和组装的研究则相对较少。因此,本研究以菜蛾盘绒茧蜂及其携带的PDV（Cotesia vestalis Bracovirus,CvBV）为对象,通过基因组、转录组、蛋白组、绝对定量、RNA干扰、透射电镜等多组学和多种分子生物学技术,围绕CvBV在寄生蜂卵巢内的复制和组装机制展开研究。获得主要研究成果如下:1)明确CvBV复制和组装的动态过程。利用透射电镜及绝对定量的方法,阐明了CvBV复制和组装与寄生蜂卵巢发育的关系,明确了CvBV复制开始节点为寄生蜂蛹期第2.5天。详细展示了CvBV病毒组装的动态过程,发现CvBV于3日龄雌蛹的卵巢内出现少量组装,到蛹期第4天达到组装高峰期,羽化1天后病毒粒子成熟,卵萼内腔中CvBV丰度达到最高。2)明确CvBV复制和组装相关的EVEs的数量和表达动态。通过对菜蛾盘绒茧蜂基因组及转录组的数据分析,明确了菜蛾盘绒茧蜂基因组中共有73个保守的EVEs,获得了它们的全长序列,并进一步结合质谱分析对CvBV的结构蛋白和其它辅助组装的基因进行了鉴定,发现26个可能为其结构蛋白。表达谱分析表明EVEs在卵巢内的表达模式可分为两种:一类包含病毒DNA复制和病毒RNA转录调控相关基因,这部分基因在蛹早期开始表达,并在3日龄雌蛹的卵巢内达到最高峰,随后开始下降,此类基因称之为早期表达基因。另一类包括结构蛋白和组装相关基因,这部分基因的表达从2日龄雌蛹开始,并在在4日龄雌蛹的卵巢内达到峰值,到1日龄雌成虫体内出现缓慢下调,该类基因称为晚期表达基因。3)明确多个关键EVEs在CvBV复制和组装过程中的作用。通过RNA干扰等技术对24个EVEs在CvBV复制和组装过程的作用进行了探究,其中3个和病毒DNA复制相关（helicase、integrase-1和integrase-2）,3个和病毒RNA转录调控相关（p47、lef-9和lef-5）,8个为病毒衣壳组分（vp39、PMV、Hz NVorf9-1、Hz NVorf9-2、Hz NVorf106、38k、27b和K425＿459）,5个为病毒囊膜结构蛋白（11k、17a-1、35a-1、35a-2和K425＿461）,3个与衣壳组装相关（vlf-1、Hz NV140-1和Hz NVorf140-2）,1个负责病毒结构成分（衣壳与囊膜）运输（Hz NVorf64）,1个为辅助侵染因子（vp91）。4)明确蜕皮激素（20E）在CvBV复制和组装过程的调控作用,并鉴定了下游调控因子。发现20E在寄生蜂雌蛹卵巢内的丰度变化为早期（1-2日龄蛹）较高,蛹期第3天开始下调,此变化趋势正好和CvBV组装相关的晚期基因表达模式相反。通过体外添加20E活体培养卵巢的方式,明确了较高浓度的20E能够显着抑制EVEs相关基因的表达,进一步通过卵萼区转录组测序及RNA干扰方法明确了20E通路下游转录因子E93能够抑制vp39、38k和vlf-1基因的表达。综上,本研究表明,CvBV的复制和组装过程需要多个基因在寄生蜂蛹期协同作用,包括调控病毒基因表达的相关基因以及病毒结构蛋白等。本研究系统地对这些基因进行全基因组的鉴定,并利用RNA干扰等方法对其功能进行系统地探究,初步揭示了CvBV复制和组装的复杂过程。此外,本研究首次发现了20E通路对CvBV组装相关基因的调控作用。这些新的发现不仅提升了对PDV复制和组装机制的认知,也对深入探究PDV的起源和进化具有重要的参考意义。
王承锐[2]（2020）在《春尺蠖新病毒株的鉴定及其生物活性的研究》文中研究指明为了开发新型的生物杀虫剂,我们从自然死亡的春尺蠖幼虫分离到新病毒株。通过电镜观察,初步确认该新病毒株是一种质型多角体病毒,通过食料给毒法测定其对春尺蠖3龄幼虫和思茅松毛虫3龄幼虫的致死作用,并研究新病毒株与NPV（Nuclear polyhedrosis virus）之间的增效作用。结果如下:（1）新毒株病毒的包涵体为多角体,一个多角体内包埋多个粒病毒粒子。在形态上与其他CPV无明显差别,确定其为质型多角体病毒。命名为春尺蠖质型多角体病毒（Apocheima cinerarius cypovirus,ApciCPV）。（2）ApciCPV对春尺蠖3龄幼虫有很强的毒力,半致死浓度（LC50）为1.42×104 OBs/mL。当ApciNPV+ApciCPV复配剂感染春尺蠖3龄幼虫时,相比ApciNPV单剂,半致死时间（LT50）缩短0.5～10.9 d、最终致死率提高6.7%～43.3%。一定浓度的ApciCPV对ApciNPV有增强作用,并且这种增强作用与复配剂中ApciCPV的浓度成正比。（3）ApciCPV对思茅松毛虫3龄幼虫有很强的毒力,半致死浓度（LC50）为6.62×105 OBs/mL。当DekiNPV+ApciCPV复配剂感染思茅松毛虫3龄幼虫时,相比DekiNPV单剂,半致死时间（LT50）缩短0.5～20 d、最终致死率提高2.8%～66.2%。一定浓度的ApciCPV对DekiNPV有增强作用,并且这种增强作用与复配剂中ApciCPV的浓度成正比。（4）高浓度的ApciCPV与NPV之间存在增效作用,且与复配剂中ApciCPV的浓度成正比,当复配剂中NPV浓度的增加时,增效作用会逐渐减弱最后表现为相加作用;低浓度的ApciCPV与NPV之间则更多表现为相加作用和拮抗作用。
欧阳依依[3]（2019）在《20种重组AcMNPV的构建及生物活性分析》文中认为随着人们环保意识的增强,发展绿色生态农业已成为我国目前推进农业产业的重要政策之一,因此开发和利用生物杀虫剂是害虫生物防控领域的重要途径之一。为了构建具有更高杀虫活性的杆状病毒生物杀虫剂,本论文将囊泡病毒基因与杆状病毒结合,利用Bac-to-Bac表达系统成功构建了20种具有口服感染活性的重组AcMNPV,并对这20种重组病毒进行了详细的生物学活性测定、分析。取得的主要结果如下:1、双向表达供体载体的构建:通过全基因合成技术和经典的酶切连接技术,将合成的polyhedrin及其启动子、终止子以及与其表达方向相反的p10启动子及HSV-tk终止子片段插入pFastBac HTb载体上,成功构建了一个能够同时表达两个外源基因的双向表达供体载体（pFB-ph）。2、重组AcMNPV病毒的获取:分别将20个囊泡病毒的功能基因插入双向表达载体（pFB-ph）上,利用转座分别将20个目的基因导入AcMNPV基因组中,成功构建了20个含有囊泡病毒基因的重组bacmid;Bacmid转染Sf9细胞后,通过细胞形态观察和病毒粒子扫描电镜检测,证实了这20种重组病毒以及野生型对照病毒（wt-Ac）已构建成功并能正常包装病毒粒子。3、重组AcMNPV病毒的生物活性测定:分别以5 PIBs、10 PIBs、50 PIBs、100 PIBs、500 PIBs、1000 PIBs、5000 PIBs的病毒剂量饲喂三龄甜菜夜蛾幼虫并每日检测试虫死亡率,结果表明:病毒浓度越高,感毒幼虫的死亡率越高。LD50和LD90结果表明:在重组的20个病毒中,orf73、orf111、orf165的插入能够显着提高重组病毒的杀虫毒力;LT50和LT90结果表明:Ac-151能显着缩短病毒的杀虫时间。分别以LD20、LD50、LD90三个剂量的病毒饲喂甜菜夜蛾幼虫并分别统计试虫的日均体重及日均取食量,结果表明:随着处理病毒浓度的增高,幼虫的日均体重和取食量明显降低;每种重组病毒均能不同程度的抑制幼虫的取食,其中以Ac-73最为显着。本研究利用囊泡病毒基因对杆状病毒进行改造,获得了几株作用效果相对突出的重组杆状病毒,为高效昆虫病毒杀虫剂的构建和筛选提供了新思路。
彭跃有[4]（2019）在《AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac132的功能研究》文中研究表明杆状病毒是一类双链、环状、超螺旋的DNA病毒,拥有80 kb到180 kb的基因组,编码大约100-180种蛋白。杆状病毒被人类广泛研究,以苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）最为突出,具有安全杀虫剂的称号,但因其杀虫时间慢等局限性而不被大范围使用。因此,加强杆状病毒活性以及全面了解其基因组中重要基因的功能尤为关键,特别是结构基因,ac132是其中之一。AcMNPV中的ac132位于基因组中的第132个开放阅读框,ac132基因全长660bp,编码关键的结构蛋白。有研究表明ac132的敲除对病毒DNA的复制和晚期基因没有明显的影响,但对病毒的形态发生有影响,ac132敲除以后,病毒发生基质（VS区）中出现包含单个核衣壳的卷毛状结构,基本不出现正常的棒状核衣壳,病毒发生基质出现的时间延迟。但是Ac132蛋白对子代病毒增殖的影响尚不明确,因此我们针对Ac132蛋白在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能展开研究。本研究主要分为三部分内容:第一部分:重组杆状病毒AcMNPVac132ko-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP的构建与Ac132-EGFP的表达分析首先,用λ-Red同源重组和Bac-to-Bac系统构建敲除ac132基因的病毒AcMNPVac132ko-EGFP,侵染Sf9细胞后观察到极少量的绿色荧光,表明敲除ac132基因大幅降低了AcMNPV子代病毒的增殖。为了确定这种现象确实是由ac132基因的敲除所引起的,我们又在P10启动子下构建了回补ac132基因的重组病毒AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP,观察到一、二、三代病毒侵染Sf9（Spodoptera frugiperda）细胞产生了大量的绿色荧光蛋白,表明了ac132基因是产生子代病毒不可缺失的。为进一步分析,我们构建了过表达Ac132的重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP。测定AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP的滴度,用5 MOI的AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP分别侵染Sf9细胞,Western blot结果表明,在AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP处理组中,Ac132-EGFP从24 h p.i.开始表达,并在36 h p.i.达到了表达的峰值;过表达AcMNPV-Ac132-EGFP处理组中,Ac132-EGFP从12 h p.i.开始表达,较AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP处理组提前了表达,在36 h p.i.同样达到表达高峰,并在随后的侵染时间段呈现较高的表达丰度。荧光显微镜观察结果与Western blot分析结果一致。第二部分:Ac132在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能首先,通过噬斑实验检测AcMNPVac132ko-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP子代病毒的增殖。结果表明,回补型AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP与野生型AcMNPV-EGFP子代病毒增殖的能力相当,而AcMNPV-Ac132-EGFP明显增加了子代病毒的产量,在36 h p.i.时,分别是AcMNPV-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP的5.55倍、2.28倍。那么过表达Ac132通过什么途径促进AcMNPV促进子代病毒增殖呢?之前的研究表明Ac132是结构蛋白并且随着侵染时间的推移定位于细胞核中,随后我们用Western blot定量检测了Ac132在细胞核的积累,用5 MOI的AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP和AcMNPV-Ac132-EGFP侵染Sf9细胞,提取核蛋白,结果表明两个重组病毒处理组中Ac132在细胞核中都高度积累,说明Ac132在细胞核中发挥功能。那么它是如何进入细胞核呢?利用在线预测网站cNLS Mapper预测到在Ac132蛋白序列的第25-28位氨基酸残基处存在典型的核定位信号序列PPKK（脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸）。为明确PPKK序列对Ac132进入细胞核是否发挥作用,将PPKK全部突变为丙氨酸,构建了突变型病毒AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP,同时构建了过表达突变核定位信号的重组病毒AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP。接下来通过噬斑实验测定这两种突变型病毒子代病毒的增殖,相比AcMNPV-EGFP,突变型AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP抑制了子代病毒的产生;相较于AcMNPV-EGFP,过表达突变型AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP在48h p.i.子代病毒的产量约是野生型病毒的4倍,但仍比AcMNPV-Ac132-EGFP低,各种重组病毒转染或侵染宿主Sf9细胞的荧光观察结果与它们各自产生子代病毒的能力相对应。以上结果说明Ac132可通过PPKK核定位信号进入细胞核发挥功能并促进病毒增殖。另一方面,有研究表明Ac132的103-134位氨基酸残基与结合Actin的NEBU结构域同源,肌动蛋白在AcMNPV侵染宿主产生子代病毒的整个过程中都发挥着重要的作用,那么Ac132的过表达、突变会如何影响宿主细胞纤维状肌动蛋白F-actin进出细胞核?我们用5 MOI的AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP和AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP侵染Sf9细胞,荧光显微镜观察用鬼笔环肽定位的纤维状肌动蛋白在细胞核和质的分布,结果表明12 h p.i.时,在AcMNPV-Ac132-EGFP处理组中,F-actin就明显出现在细胞核中,一直持续到72 h,比其它处理组明显提前了F-actin在细胞核中的聚集,同时F-actin在细胞膜内侧大量聚集。而在突变型病毒AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP处理组中,F-actin在12-48 h p.i.均集中在细胞膜内侧面,72 h p.i.时在细胞核中大量聚集。AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP处理组和野生型AcMNPV-EGFP处理组中F-actin在细胞核、质中的分布相同,均在12-48 h p.i.逐渐入核,在72 h p.i.时开始出核。AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP处理组中F-actin相比AcMNPV-EGFP处理组提前进核,延迟出核,但是比过表达重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP处理组提前和延迟的程度弱。随后Western blot定量分析了β-actin在细胞核中的聚集情况,结果与荧光定位的结果一致。以上结果说明了Ac132通过不完全依赖核定位信号进入细胞核,并且可以提前纤维状肌动蛋白在细胞核中的聚集,从而促进病毒的增殖。第三部分:重组病毒AcMNPVac132ko-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP和AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP对宿主细胞能量代谢的影响我们已经明确了Ac132蛋白对AcMNPV在Sf9细胞中增殖的重要性。AcMNPV的增殖可以激活PI3K-Akt-mTOR信号通路,从而进一步激活与细胞代谢有关的下游信号通路,提高糖酵解水平可以通过PI3K-Akt信号通路激活丙酮酸激酶来实现。那么过表达Ac132的重组病毒又会对Sf9细胞中的糖酵解过程产生怎样的影响?葡萄糖的消耗以及乳酸的积累可以反映糖酵解的水平,因此用5 MOI的AcMNPVac132ko-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP、AcMNPV-Ac132-EGFP、AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP和AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP侵染Sf9细胞,检测细胞葡萄糖的消耗和乳酸的积累。结果表明相较于野生型处理组,重组病毒处理组子代病毒增殖能力越强,Sf9细胞消耗葡萄糖的越多,积累的乳酸越多。过表达重组病毒AcMNPV-Ac132-EGFP处理组和AcMNPV-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP处理组中,宿主细胞在12 h p.i.显示出了较高的葡萄糖消耗,分别是野生型AcMNPV-EGFP处理组的1.82倍和1.18倍。同时,在6 h p.i.积累了大量的乳酸,分别是AcMNPV-EGFP处理组的2.66倍和1.42倍,但是之后葡萄糖消耗增加的幅度减缓。在AcMNPVac132ko-Ac132-EGFP处理组和野生型AcMNPV-EGFP处理组中,Sf9细胞对葡萄糖的消耗和乳酸的积累大体一致,并在24 h p.i.开始对葡萄糖的需求有较大幅度的增加,并且后续呈缓慢增加的趋势。AcMNPVac132ko-EGFP处理组和空白对照组的情况一致,Sf9细胞葡萄糖的消耗持续缓慢增加,几乎不积累乳酸。在AcMNPVac132ko-Ac132PPKK25-28AAAA-EGFP处理组中,由于前期子代病毒在缓慢积累,Sf9细胞在24h p.i.开始增加葡萄糖的消耗,乳酸的积累也在缓慢增加,直到72 h p.i.乳酸浓度突然增加,推测是在72 h p.i.子代病毒的积累达到了一定高浓度所致。总之,由于Ac132序列完整性导致的重组病毒对子代病毒增殖的影响可进而影响到Sf9细胞的糖酵解过程,这为进一步明确AcMNPV的关键结构基因对侵染宿主细胞能量代谢的影响提供了线索。本研究在细胞和分子水平上通过构建Ac132的敲除、过表达和突变型的重组病毒株,揭示了AcMNPV中关键结构蛋白Ac132的功能,它依赖自身核定位信号在细胞核中高度积累,通过促进F-actin在细胞核中聚集,提高子代病毒增殖效率,同时也激活了与细胞能量代谢相关的通路,加快糖酵解过程,为病毒的复制、装配和释放提供能量。以上结果为科学利用杆状病毒开展植物虫害生物防治提供了参考。
于爽[5]（2019）在《拟南芥钙调蛋白CBP60g在大肠杆菌和昆虫细胞内的表达与纯化》文中指出植物通过调节胞内钙离子浓度对外界不良环境因素进行防御。钙调素（CaM）是一类最主要的钙离子感受器,钙离子-钙调素（Ca2+-CaM）复合体与钙调素结合蛋白（CBPs）结合构象发生变化后参与植物对生物和非生物胁迫的响应。CBP60g蛋白作为CBPs蛋白家族中的重要一员,在抗病、抗旱、正向调节ABA和SA介导的信号途径以及负调控花青素的合成过程中起着非常重要的作用。本研究尝试了在大肠杆菌和昆虫细胞内进行可溶性表达和纯化拟南芥CBP60g蛋白,期望为今后解析其三维结构提供依据。具体结果如下:1.对CBP60g的氨基酸序列进行分析和预测表明,其含有11个糖基化位点、76个磷酸化位点、没有跨膜结构域。2.以野生拟南芥cDNA为模板,利用PCR扩增技术得到拟南芥CBP60g故基因,其cDNA 全长为 1689 bp。3.利用TEV-LIC技术分别构建大肠杆菌表达载体,并转化到表达菌株BL21（DE3）。经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE检测发现,目的蛋白CBP60g主要以包涵体的形式存在。4.成功构建杆状病毒转移载体,转化到E.coli DH1OBac后得到重组杆状病毒质粒,转染到昆虫细胞中进行表达蛋白。SDS-PAGE检测目的蛋白大小约为75 KDa,比预测蛋白大小（62 KDa）略大。经过阴离子交换纯化后,根据所建立的蛋白标准曲线计算蛋白浓度为996.5 ng/mL,经过Western Blotting验证,所纯化的蛋白质为CBP60g。
康涛涛[6]（2019）在《BmNPV iap2基因对宿主细胞凋亡的调控机制研究》文中进行了进一步梳理家蚕既是重要的泌丝经济昆虫,也是蚕桑产业和历史文化的重要载体。而家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV）是养蚕生产上最常见的、危害最严重的一类家蚕病原微生物。Bm NPV是完全的胞内寄生生物,其自身基因组简单,不具细胞结构,通常利用宿主的营养物质和信号通路来完成自身的生命周期。病毒感染宿主细胞会引发宿主的一系列反应,如细胞凋亡、DNA损伤应答、热休克反应和能量代谢等。其中,细胞凋亡作为机体重要的生物学过程,受内外环境变化或凋亡信号触发,其是在基因调控下所发生的清除衰老、多余和受损细胞以维持自身稳定的一种自我调节方式。细胞凋亡几乎存在于所有的多细胞生物,在生物体生长发育、组织分化和细胞免疫维持内环境稳定过程中扮演重要角色。病毒本身随着宿主防御系统进化而协同进化,进而逃逸宿主细胞的抗病毒机制。昆虫缺乏哺乳动物的获得性免疫系统,而细胞凋亡作为其重要的免疫应答组成部分,这对研究病毒与宿主相互作用,及病毒如何利用宿主信号通路来实现自身增殖复制是一个很好的切入点。本研究对家蚕核型多角体病毒凋亡抑制因子Bm NPV iap2基因进行功能鉴定,探究Bm NPV IAP2及其相互作用蛋白在Bm NPV侵染过程中对宿主细胞凋亡调控的机制,初步解析Bm NPV iap2基因在Bm NPV增殖过程中的作用机制,为解析Bm NPV利用Bm NPV iap2基因调控宿主细胞凋亡利于自身增殖提供理论依据。主要研究结果和结论如下:1.Bm NPV iap2基因的功能鉴定通过序列分析发现Bm NPV iap2基因的ORF长750 bp,编码249个氨基酸（aa）,预测蛋白质分子量为28.72 k Da,等电点为9.51。蛋白结构域预测表明Bm NPV IAP2从80 aa到153 aa为BIR结构域,202 aa到236 aa为N端RING结构域。系统发生树分析结果显示杆状病毒IAP2主要以α-杆状病毒为主,具有相对较高的保守性,此外,杆状病毒的IAP2与昆虫IAP关系较近（尤以鞘翅目、膜翅目为主）,该结果与推测杆状病毒IAP是通过昆虫水平转移相一致。成功构建了BmNPV iap2基因的真核过表达载体和基于CRISPR/Cas9的敲除载体,Bm NPV iap2基因的过表达载体转染家蚕Bm E-SWU1细胞,免疫荧光结果表明Bm NPV IAP2主要定位于细胞质,Western Blotting检测到约30.71 k Da处存在特异性条带;基于CRISPR/Cas9在Bm NPV中成功敲除Bm NPV iap2基因,通过Hoechst染色、TUNEL检测、Caspase活性检测分析和流式细胞术等技术检测显示,在Bm NPV侵染Bm E-SWU1细胞中,敲除Bm NPV iap2基因后细胞核染色质固缩呈典型凋亡小体,与对照相比,敲除Bm NPV iap2基因凋亡小体比例达到20%。此外,与对照相比,TUNEL检测绿色荧光明显增强,Caspase-9和Caspase-3/7活性均显着上升,凋亡细胞比例增加11%,表明Bm NPV iap2经CRISPR/Cas9敲除后引发细胞凋亡;利用q RT-PCR技术和Western Blotting技术,过表达Bm NPV iap2上调病毒基因ie1和vp39表达,促进Bm NPV增殖,敲除Bm NPV iap2下调病毒基因ie1和vp39表达,抑制Bm NPV增殖。2.BmNPV IAP2相互作用蛋白的鉴定为了鉴定Bm NPV IAP2的调控网络,以Bm NPV IAP2为诱饵,进行免疫共沉淀-质谱分析,筛选到Bm NPV IAP2可能的相互作用蛋白Bm PP5和Bm HSP60,通过荧光共定位和免疫共沉淀等方法鉴定其与Bm NPV IAP2的确存在相互作用。Bm PP5从19 aa到120 aa为三个串联TPR结构域,195 aa到471 aa为PP2Ac结构域,可能参与了线粒体细胞周期;HSP60从359 aa到395 aa为Coiled coil结构域,556 aa到572 aa为Low complexity结构域,主要参与蛋白质到线粒体的正确靶向、蛋白质“从头”折叠和热激反应等。成功构建了Bmpp5和Bm Hsp60基因的真核过表达载体及基于CRISPR/Cas9的敲除载体,通过Hoechst染色和Caspase活性检测分析显示,敲除Bm Hsp60、Bmpp5细胞核染色质固缩,呈现典型的凋亡小体,与对照相比,敲除Bm Hsp60、Bmpp5凋亡小体比例分别达到12%和15%。此外,与对照相比,Caspase-9和Caspase-3/7活性均显着上升,说明Bmpp5和Bm Hsp60基因经CRISPR/Cas9敲除后引发细胞凋亡。此外,Bm HSP60在抗病毒方面的研究已经报道,本文着重研究关于Bm PP5的抗病毒功能。通过q RT-PCR技术和Western Blotting技术,过表达Bmpp5上调病毒基因ie1和vp39表达,促进Bm NPV增殖;敲除Bmpp5下调病毒基因ie1和vp39表达,抑制Bm NPV增殖。为进一步探索Bm NPV IAP2相互作用蛋白对Bm NPV IAP2的调控,Bm NPV侵染过程中,在转录水平及蛋白水平利用q RT-PCR和Caspase活性检测分析技术分析,结果表明,过表达Bmpp5上调表达Bm NPV iap2;敲除Bmpp5下调表达Bm NPV iap2。Caspase活性检测分析表明,敲除Bmpp5影响Bm NPV iap2抑制细胞凋亡功能。3.Bm NPV iap2、Bmiap和Bmpp5共同调控宿主细胞凋亡确定Bm NPV IAP2、Bm IAP和Bm PP5两两之间存在相互作用。利用q RTPCR分析Bm NPV侵染过程中Bmiap、Bmpp5与Bm NPV iap2基因的表达模式,结果表明Bm NPV侵染过程中,Bmiap表达下调,Bmpp5与Bm NPV iap2上调表达。为了探究Bm NPV利用Bm NPV iap2调控宿主细胞凋亡机制,通过q RT-PCR和Western Blotting技术在转录水平及蛋白水平研究Bm NPV iap2、Bmiap和Bmpp5共同调控宿主细胞凋亡和Bm NPV增殖复制,结果证明Bm NPV侵染过程中,Bm NPV iap2和Bmpp5上调表达Bmiap;过表达Bm NPV iap2和Bmpp5能增强Bmiap抗H2O2诱导的细胞凋亡。此外,过表达Bm NPV iap2和Bmpp5能增强Bmiap引起的促进病毒增殖作用。
苏霞[7]（2018）在《杆状病毒AcMNPV ac51、ac73、ac75基因的功能研究》文中指出杆状病毒是目前已知病毒种类中对人类最有益的病毒之一,已广泛应用于生物杀虫剂、真核表达载体系统、疫苗制备、蛋白表面展示系统和基因治疗等方面。苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（AcMNPV）是杆状病毒的模式种,是第一个被完全测序的,也是目前研究最多、最广泛的杆状病毒。为了更好地利用杆状病毒,就需要揭示病毒编码的各个基因在杆状病毒生活史中的功能。ac51、ac73、ac75基因是AcMNPV中功能未知的基因,ac51基因在Ⅰ和Ⅱ型鳞翅目NPV基因组都存在同源序列;aac73基因只在已测序的Ⅰ型鳞翅目NPV基因组有同源基因;ac75的同源基因存在于所有鳞翅目NPV、GV和膜翅目NPV基因组中,但不存在于双翅目基因组中。本论文分别对ac51、ac73、ac75基因进行实验分析,探究各基因在病毒增殖、病毒粒子组装和病毒感染虫体等方面的作用;并对ac51、ac73、ac75基因产物进行亚细胞定位分析,从而揭示ac51、ac73、ac75基因在AcMNPV的感染过程中的具体功能。论文开始对文献进行了综述,主要从杆状病毒的基因组和分类、杆状病毒的表型和感染周期、杆状病毒基因的表达、杆状病毒基因的分类、杆状病毒的应用等方面介绍了杆状病毒的研究背景,并阐述了ac51、ac73、ac75基因的背景知识和本论文的研究目的和意义。论文首先以ac73基因为研究对象,利用λ-Red同源重组技术和Bac-to-Bac系统构建了ac73基因缺失型和拯救型重组病毒,将这两种重组病毒质粒及野生型转染、感染Sf9细胞,通过普通光学显微镜、荧光显微镜观察,发现ac73基因缺失型的重组病毒可以产生多角体和感染性的病毒粒子;对三种重组病毒进行一步生长曲线分析,生长曲线总体走势相似,呈稳定增长的趋势,但缺失型重组病毒滴度明显低于野生型和拯救型,因此,缺失型病毒粒子的量低于拯救型和野生型病毒;电镜观察缺失型重组病毒发现有正常的核衣壳,也有异常的中空长管状结构;形成的多角体有些中间有大空腔,有些是未包裹核衣壳的空泡。生物学测定结果表明,缺失型重组病毒的半致死时间LT50比野生型重组病毒延长了 42 h;取食缺失型病毒多角体的甜菜夜蛾幼虫其血淋巴中含有病毒粒子,可以感染昆虫细胞。Ac73蛋白的亚细胞定位分析结果显示,在病毒感染的早期Ac73-EGFP蛋白定位于宿主细胞核中,感染后期细胞核和细胞质都有Ac73-EGFP蛋白。综上说明,ac73基因是病毒增殖的非必需基因,但基因缺失后会影响AcMNPV病毒粒子的产量和多角体的形态,病毒增殖能力减弱,杀虫速度减慢。Ac73蛋白可能感染初期仅在细胞核中行使功能,感染晚期在细胞质中也发挥功能。接着以ac51、ac75基因为研究对象,同样利用λ-Red同源重组技术和Bac-to-Bac系统,分别构建ac51、ac75基因的缺失型和拯救型重组病毒质粒,通过转染、感染Sf9细胞和绘制一步生长曲线等实验,分析发现缺失这两个基因的任何一个都会使病毒失去增殖能力,而拯救型重组病毒具有感染性。电镜观察结果发现,缺失这两个基因后病毒核衣壳无法组装,也无法形成多角体。因此,ac51、ac75基因都是AcMNPV的必需基因,缺失后病毒没有感染性。Ac51和Ac75蛋白的亚细胞定位分析结果显示,病毒感染后Ac51-EGFP蛋白主要定位在宿主细胞核中,后期在细胞核边缘聚集;Ac75-EGFP蛋白在感染早期主要定位在宿主细胞的核环带区中呈成聚集状分布,后期进入细胞质中执行其功能。说明病毒感染前期,Ac51蛋白和Ac75蛋白主要在细胞核中行使功能,后期Ac75蛋白还在细胞质中发挥一定的功能。预测Ac51和Ac75与病毒核衣壳的形成相关。综合研究表明,ac51、ac75基因都是AcMNPV的必需基因。ac73基因是非必需基因,其对病毒的增殖和经口感染昆虫并不是必需的,但基因缺失后会影响病毒粒子的产量和多角体的形态。病毒滴度下降,缺失病毒的杀虫速度减缓。
沈运旺[8]（2018）在《家蚕核型多角体病毒ORF40、ORF133/134和ORF92a的功能研究》文中进行了进一步梳理杆状病毒科包含一大类专一性感染昆虫的有囊膜病毒,它们的基因组是环状、超螺旋的双链DNA分子。目前已经在600多种昆虫中分离到杆状病毒,主要是鳞翅目、膜翅目和双翅目的昆虫。杆状病毒在其生活周期中,产生两种遗传物质相同,但是形态和功能完全不同的病毒粒子,即出芽型病毒（budded virus,BV）和包埋型病毒（occlusion-derived virus,ODV）。家蚕核型多角体病毒（Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV）只感染家蚕（Bombyx mori）,是目前研究最广泛的杆状病毒之一。本研究以BmNPV四个功能未知的ODV相关蛋白ORF40、ORF133/134和ORF92a为研究对象,通过构建基因敲除突变体,发现它们在ODV的形成过程中发挥不同的功能。主要结果如下。1.BmNPV ORF40的功能研究BmNPV的ORF40（bm40）位于病毒基因组的38,254-39,213 nt,在己测序的a杆状病毒基因组中高度保守。bm40的开放阅读框（openreading frame,ORF）全长960 bp,编码319个氨基酸残基,预测分子量为37.8 kDa。生物信息学分析显示Bm40的N端和C端分别含有一个Dna J结构域和一段RNA识别基序（RNA recognition motif,RRM）。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm40是一个晚期表达基因。利用λ Red同源重组系统构建了敲除bm40的重组病毒。结果表明,敲除型病毒只能感染单个细胞,无法产生具有感染力的子代BV病毒粒子,但是病毒DNA的复制没有受到影响。电镜结果表明,敲除bm40影响了核衣壳从细胞核转运到细胞质、核衣壳包膜形成ODV病毒粒子,以及随后ODV包埋的过程。共聚焦显微镜分析发现,从感染后48小时,Bm40主要位于细胞核内,并在感染晚期聚集在核膜和多角体上。敲除Bm40的RRM不影响BV的产生和Bm40的细胞内定位。以上结果表明,在BmNPV感染周期中,Bm40在BV的产生和ODV的包膜过程中发挥重要作用。2.BmNPV ORF133/134 的功能研究BmNPV的ORF133(bm133 和ORF134(bm134 分别位于病毒基因组的126,858-127,313 nt和127,342-127,671 nt。这两个开放阅读框相邻,并且转录方向相反。这两个基因在所有已测序的group INPV中高度保守,分别编码两种小分子蛋白（Bm133,17.7kDa;Bm134,12.4kDa）。RT-PCR 结果表明bm13 和bm134均是晚期表达基因。利用λRed同源重组系统构建了bm13 和bm134同时缺失的重组病毒。结果表明,同时敲除两个基因不影响BV的产生和病毒DNA的复制。电镜结果表明,双敲除不影响核衣壳的组装、核内微泡的形成,以及ODV病毒粒子的产生,但是被包埋进多角体的ODV病毒粒子数量显着减少。进一步研究显示单独修复某个基因并不能恢复ODV包埋的能力,表明这两个基因在ODV包埋过程中缺一不可。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm133和Bm134同时位于细胞质和细胞核。在裂解的细胞中,Bm134主要聚集在多角体上。这些结果表明,Bm133和Bm134不是BV和ODV产生必需的,但是它们在ODV包埋与多角体形态发生过程中发挥重要作用。3.BmNPV ORF92a的功能研究BmNPV的ORF92a（bm2a）位于病毒基因组的88,983-89,162 nt,在己测序的杆状病毒基因组中高度保守。bm92a的开放阅读框全长180 bp,编码59个氨基酸残基,预测分子量为7.1 kDa。Bm92a是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）的经口 感染因子AC110的同源物,在其N端存在一段高度疏水的跨膜结构域（transmembrane,TM）。RT-PCR和免疫印迹结果表明bm92a是一个晚期表达基因。利用λRed同源重组系统构建了敲除bm92a的重组病毒。结果表明,bm92a敲除型病毒和修复型病毒具有类似的增长曲线。电镜结果表明,bm92a敲除不影响核衣壳的组装、ODV的包膜和多角体的形态。共聚焦显微镜分析发现,病毒感染期间Bm92a主要位于细胞核内的环形区域,并在感染晚期聚集在多角体上。并且,Bm92a的细胞内转运和定位模式与经口感染因子PIF1和PIF2的类似。酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现Bm92a与PIF1具有强烈的互作关系。这些结果表明,Bm92a不是BV和ODV产生必需的,它可能通过与PIF1的互作参与经口感染因子复合体的形成。
孙全[9]（2017）在《苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒GP41与两种宿主蛋白相互作用位点序列突变对病毒复制的影响》文中研究表明AcMNPVgp41是杆状病毒37个核心基因之一,其同源物存在于所有已完成测序的73种杆状病毒基因组中。苜宿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus）GP41是一种糖基化蛋白,定位于病毒衣壳与囊膜之间。本实验室筛查出与GP41相互作用的草地贪夜蛾蛋白:含“卷曲-卷曲-螺旋-卷曲-卷曲-螺旋”结构域蛋白 2（Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing protein 2,CHCHD2）和甘氨酰-tRNA 合成酶（Glycyl-tRNA Synthetase,GARS）;发现GP41与CHCHD2的相互作用位点在161-210AA之间,与GARS的相互作用位点在81-330AA之间。本文通过对AcMNPV GP41与这两种宿主蛋白的相互作用位点区段编码序列的点突变和对应的AcMNPV突变体的表型分析探讨这些病毒-宿主蛋白相互作用对病毒复制的影响。首先,选取位于AcMNPV GP41与CHCHD2和GARS互作位点区段的181 AA（亮氨酸,Leu/L）、182AA（脯氨酸,Pro/P）、187 AA（赖氨酸,Lys/K）、203 AA（谷氨酸,Glu/E）、206 AA（赖氨酸,Lys/K）、208 AA（亮氨酸,Leu/L）密码子进行点突变,将其分别突变成丙氨酸（Ala/A）密码子。将经过突变的GP41编码序列分别插入酵母双杂交诱饵载体质粒pGBKT7,将被各个诱饵重组质粒转化的Y187菌株分别再与包含CHCHD2和GARS编码序列的cDNA克隆的AH109酵母菌株进行杂交实验。实验结果显示gp41LPK/AAA、gp41EKL/AAA、gp41L181/A、gp41L208/A 这四种突变使得 GP41 与 CHCHD2、GARS互作丧失。gp41K187/A、gp41K206/A突变可能对GP41与CHCHD2的相互作用有一定影响,但对GP41与GARS的相互作用影响不大。gp41P182/A、gp41E203/A突变导致GP41与CHCHD2的相互作用显着减弱,但对GP41与GARS的相互作用影响较小。为了确定GP41与CHCHD2和GARS相互作用位点序列突变是否影响病毒的增殖,利用Bac-to-Bac系统将8个gp41突变子分别与同一拷贝的绿色荧光蛋白基因（egfp）或一拷贝的多角体蛋白基因（polh）一起插入gp41缺失突变体的polh位点,构建带有egfp标记的AcMNPV突变体vAcgp41LPK/AAA-egfp、vAcgp41EKL/AAA-egfp、vAcgp41L181/A-egfp、vAcgp4182/A-egfp、vAcgp41K187/A-egfp、vAcgp41E203/A-egfp、vAcgp41K206/A-egfp、vAcgp41L208/A-egfp和带有polh 标记的 AcMNPV 突变体 vAcgp41LPK/AAA-PH、vAcgp41EKL/AAA-PH、vAcgp41L181/A-PH、vAcgp41P182/A-PH、vAcgp41K187/A-PH、vAcgp41E203/A-PH、vAcgp41K206/A-PH、vAcgp41L208/A-PH。用这些AcMNPV bacmid突变体对Sf9细胞的转染-感染实验显示,包含 gp41P182/A、gp41EKL/AAA、gp41E203/A 或 gp41K206/A 的突变体在被转染细胞培养基中产生的感染性BV量接近甚至高于野生型和gp41敲除-回复型。而包含gp41LPK/AAA、gp41L181/A或gp41K187/A的突变体在被转染细胞培养基中只产生极少量有感染性的BV;包含gp41L208/A的突变体在被转染细胞培养基中产生有感染性BV多于gp41LPK/AAA、gp41L181/A和gp41K187/A突变体,但较野生型和gp41敲除-回复型少。这些突变体在被转染细胞中都能产生包涵体。对被vAcgp41L1811A-egfp、vAcgp41L208/A-egfp转染的细胞上清液中的BV基因组进行实时荧光定量PCR检测显示,这两种突变体在转染72小时后才释放少量BV。用gp41敲除突变体vAcgp41ko-PH、gp41缺失-异位回复突变体vAcgp41rep-PH、gp41L181/A突变体vAcgp41L181/A-PH转染Sf9细胞,在在48hpt、72hpt、96hpt收集细胞做超薄电镜切片观察。结果显示,用vAcgp41rep-PH转染的Sf9细胞核中,在不同时间点均可明显看到病毒形态发生过程中的各种典型特征,包括病毒发生基质、核衣壳有囊膜包被的病毒体和包含病毒体的包涵体以及大量正在出核的核衣壳;在vAcgp4lko-PH或vAcgp41L181/A-PH转染的细胞核内可以观察到病毒发生基质和核衣壳;在vAcgp41L181/A-PH转染细胞的核内,病毒发生基质和包涵体形成滞后,且有少量包涵体,但包涵体内没有囊膜包被的ODV,核内周边区域可见囊泡和少量疑似正在出核的核衣壳,但未见有囊膜包被的病毒体,能看到少量包涵体,但包涵体中没有病毒体。在vAcgp41ko-PH转染的细胞核内可见一些包裹许多核衣壳的囊泡,但同样未见有囊膜的病毒体;没有见到从细胞核释放的核衣壳,也没有看到包涵体。本文的实验结果显示,AcMNPV GP41 181AA突变阻断GP41与宿主蛋白CHCHD2和GARS的相互作用,同时也严重阻滞病毒核衣壳囊膜包被和BV释放,也阻断ODV形成;208AA突变也会阻断GP41与CHCHD2和GARS的相互作用,严重阻滞病毒BV的释放;187AA突变导致GP41与CHCHD2和GARS的相互作用明显减弱,同时也导致感染性BV产量显着下降。这些实验结果表明GP41与宿主蛋白CHCHD2和GARS的相互作用可能与病毒的形态发生有关。
郭亚君[10]（2016）在《苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ac75功能研究》文中研究表明苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa california multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）属于杆状病毒科 a-杆状病毒属。ac75 是 AcMNPV的第75个开放阅读框（open reading frame,ORF）,其同源基因存在于所有感染鳞翅目和膜翅目昆虫的杆状病毒病毒基因组中,功能未知。本文构建了ac75基因缺失突变体,通过对ac75缺失突变体的系列实验分析,对ac75在AcMNPV复制中的作用进行了初步探究。ac75位于AcMNPV基因组上一个包含10个同向排列的ORF的基因簇（ORF73-82）中,全长 402 bp（63126-63527 nt）,与相邻的 ac74 和 ac76 互不重叠,编码133个氨基酸残基（amino acid,aa）。通过序列分析发现在ac75 ORF上游-15 nt,-94 nt,-139 nt和-142 nt四处存在典型的晚期启动子核心序列TAAG。Blast检索分析结果显示,aac75的预期编码产物与其它杆状病毒同源物的序列相似度高达90%～99%。通过SignalIP软件分析,在AC75的氨基酸序列中没有发现信号肽序列。利用NCBI保守结构域检索程序发现AC75序列中存在一个功能未知的DUF1160超家族结构域。用野生型AcMNPV感染性细胞培养上清液接种新鲜Sf9细胞培养,定时收集和裂解细胞,将细胞裂解物做SDS-PAGE,用AC75特异性抗体通过western-blot检测AC75,结果显示,在感染后12 h收集的细胞裂解物中开始检测到AC75条带,在感染后36 h的样品中AC75的检出量达到最大,体现晚期基因表达特征。利用λ-Red重组系统将一拷贝细菌氯霉素乙酰转移酶基因（chloraamphenicol,cat）插入AcMNPV bacmid替代ac75 ORF 5’-端229nt序列,再利用Bac-to-Bac系统将一拷贝与AcMNPV g16启动子相连的egfp或一拷贝多角体蛋白基因（polh）插入ac75缺失突变体构建带荧光标记或polh的aac75缺失突变体vAcac75ko-gfp和vAcac75ko-PH；利用Bac-to-Bac系统将一拷贝aac75连同egfp或polh插入ac75缺失突变体的polh位点构建ac75缺失异位回复突变体vAcac75ko-rep-gfp和vAcac75ko-rep-PH。将野生型、缺失突变体和缺失回复突变体分别对Sf9细胞做转染-感染实验,发现被ac75缺失突变体转染的细胞培养没有产生感染性芽殖型病毒体（BV）但被转染细胞中有包涵体产生。对被转染细胞培养上清液的实时荧光定量PCR分析结果显示,ac75缺失突变体转染的细胞培养没有BV释放。细胞超薄切片电镜分析结果显示,在ac75缺失回复突变体转染的Sf9细胞核中可见病毒形态发生不同阶段的典型特征;在ac75缺失体转染的细胞核中也可以看到明显的病毒发生基质,其中含有核衣壳,在病毒发生基质外围环状区域可见大量核衣壳,但没有观察到获得包膜的核衣壳,也未见有微泡结构,在多角体中也没有观察到病毒粒子。对被转染细胞内DNA的荧光定量PCR分析结果显示,在转染后24 h之内,ac75缺失突变体转染细胞与野生型转染细胞中病毒DNA增量大致相同;表明ac75缺失对病毒DNA复制无明显影响。将一拷贝绿色荧光蛋白编码序列（enhance green fuorescent protein,egfp）与ac75的3’端连接后插入AcMNPV基因组构建表达AC75-EGFP融合蛋白的荧光报告病毒vAcac75ko-ac75:gfp-PH。vAcac75ko-ac75:gfp-PH感染的Sf9细胞的激光共聚焦显微镜分析结果显示,在感染后12h绿色荧光主要见于细胞质中,在感染后18h开始进入细胞核中,在感染后24h主要存在于细胞核中,在感染后72h荧光几乎全部进入细胞核中。为了确定ac75是否涉及病毒晚期基因表达调节,用荧光素酶ORF（lucifearse,luc）作为报告基因分别与AcMNPV晚期基因vp39、p6.9、e18、gp64、an、pk1和polh启动子连接后插入ac75缺失突变体和gp64缺失突变体构建报告bacmids。用这些bacmids分别感染Sf9细胞,在感染后不同时间点取样测定荧光素酶活性。结果显示,所有包含报告基因的ac75缺失突变体转染细胞的荧光素酶活性值与对应的包含报告基因的gp64缺失突变体转染细胞相近;表明ac75的缺失对这些晚期基因的表达没有明显影响。上述实验结果表明,ac75是一个病毒复制必需基因,其功能可能与核内囊膜发生和核衣壳被囊膜包被的过程有关。
二、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的形态及其形态发生电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的形态及其形态发生电镜观察（论文提纲范文）
（1）菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PDV的发现与形态 |
| 1.1 PDV的命名及分类 |
| 1.2 PDV的形态特征 |
| 2 PDV的生活史 |
| 2.1 复制与组装过程 |
| 2.2 成熟及侵染传播 |
| 3 PDV的起源 |
| 3.1 PDV环状基因组部分的起源 |
| 3.2 PDV前病毒中非基因组部分的起源 |
| 3.3 BV和IV是独立起源的 |
| 4 PDV及杆状病毒复制和组装基因功能的研究 |
| 4.1 杆状病毒复制及组装的核心基因 |
| 4.2 BV和IV复制及组装相关的基因 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基本材料与方法 |
| 1 基本实验材料 |
| 1.1 养虫设备 |
| 1.2 供试材料 |
| 2 实验仪器和软件系统 |
| 2.1 常用仪器 |
| 2.2 软件系统 |
| 3 常用实验试剂和配制方法 |
| 3.1 LB培养基 |
| 3.2 抗生素 |
| 3.3 PBS |
| 3.4 琼脂糖凝胶电泳相关试剂 |
| 3.5 感受态大肠杆菌的制备 |
| 3.6 电镜固定液的配置 |
| 3.7 常用试剂盒 |
| 3.8 其它试剂 |
| 4 常用实验方法 |
| 4.1 全基因组DNA提取 |
| 4.2 TRIzol法提取总RNA |
| 4.3 cDNA第一链的合成 |
| 4.4 普通PCR |
| 4.5 荧光定量PCR(qPCR) |
| 4.6 TA连接 |
| 4.7 转化 |
| 4.8 琼脂糖凝胶电泳和切胶回收 |
| 4.9 质粒提取 |
| 第三章 CvBV在卵巢内的复制及组装动态 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 寄生蜂不同发育时期卵巢的解剖 |
| 2.3 卵萼细胞核的染色 |
| 2.4 图片采集和处理 |
| 2.5 不同发育时期卵巢基因组DNA的提取 |
| 2.6 透射电子显微镜(TEM)样品制备 |
| 2.7 qPCR检测成环的粒子的丰度 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CvBV形成与卵巢发育的关系 |
| 3.2 卵巢内CvBV丰度动态 |
| 3.3 CvBV组装过程 |
| 4 讨论 |
| 第四章 CvBV复制与组装相关基因的鉴定及表达分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 全长转录组的c DNA文库构建和测序 |
| 2.3 Illumina cDNA文库构建和卵巢转录组测序 |
| 2.4 全长转录组数据处理 |
| 2.5 卵巢转录组数据处理 |
| 2.6 基因表达差异和富集分析 |
| 2.7 CvBV组装相关基因的鉴定 |
| 2.8 CvBV病毒粒子的质谱样品准备 |
| 2.9 CvBV组装相关基因的质谱分析 |
| 2.10 CvBV组装相关基因的进化分析 |
| 2.11 CvBV组装相关基因的表达谱分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菜蛾盘绒茧蜂基因组注释的更新 |
| 3.2 卵巢转录组测序及差异表达基因鉴定 |
| 3.3 差异基因GO和KEGG富集分析 |
| 3.4 CvBV复制及组装基因的序列鉴定与表达分析 |
| 3.5 CvBV复制与组装基因的表达谱 |
| 3.6 萼液及CvBV病毒粒子蛋白质谱分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 CvBV复制及组装相关基因的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 显微注射样品收集 |
| 2.2 dsRNA合成 |
| 2.3 显微注射 |
| 2.4 检测寄生时间的行为学实验 |
| 2.5 干扰效率检测 |
| 2.6 透射电子显微镜 |
| 2.7 qPCR检测成环的病毒粒子丰度 |
| 2.8 统计方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RNAi体系的建立 |
| 3.2 整合酶和解旋酶基因的功能鉴定 |
| 3.3 病毒转录相关基因的功能鉴定 |
| 3.4 CvBV衣壳蛋白功能鉴定 |
| 3.5 CvBV囊膜蛋白功能鉴定 |
| 3.6 CvBV组装相关基因功能鉴定 |
| 3.7 CvBV组装过程的其它基因功能探究 |
| 4 讨论 |
| 第六章 20E抑制CvBV组装过程晚期基因的表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 Illumina cDNA文库构建和卵萼转录组测序 |
| 2.3 卵萼转录组数据生物信息分析 |
| 2.4 差异基因鉴定和GO、KEGG富集分析 |
| 2.5 卵巢体外培养 |
| 2.6 基因克隆和表达分析 |
| 2.7 dsRNA合成 |
| 2.8 显微注射 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 卵萼转录组测序 |
| 3.2 差异基因鉴定及GO、KEGG富集 |
| 3.3 20E参与CvBV组装过程基因的调控 |
| 3.4 E93抑制衣壳蛋白及组装基因的表达 |
| 4 讨论 |
| 第七章 总结 |
| 1 全文总结 |
| 2 本研究的创新之处 |
| 3 本研究的不足之处 |
| 4 今后的研究方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）春尺蠖新病毒株的鉴定及其生物活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 质型多角体病毒 |
| 1.1.1 质型多角体病毒的分类 |
| 1.1.2 质型多角体病毒的结构及生化特性 |
| 1.1.3 质型多角体的寄主域/交叉感染 |
| 1.1.4 质型多角体的侵染与发生 |
| 1.1.5 质型多角体病毒对昆虫的影响 |
| 1.1.6 质型多角体病毒与病原体的相互作用 |
| 1.1.7 质型多角体病毒的应用 |
| 1.2 春尺蠖及春尺蠖核型多角体病毒 |
| 1.3 思茅松毛虫及思茅松毛虫核型多角体病毒 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 1.5 研究内容 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试病毒 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.1.4 试剂及溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 春尺蠖质型多角体病毒(ApciCPV)新病毒株鉴定 |
| 2.2.2 ApciCPV对春尺蠖的毒力测定 |
| 2.2.3 复配剂(ApciNPV+ApciCPV)的毒力测定 |
| 2.2.4 ApciCPV对思茅松毛虫的毒力测定 |
| 2.2.5 复配剂(DekiNPV+ApciCPV)的毒力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 春尺蠖新病毒株的鉴定 |
| 3.1.1 春尺蠖新病毒株的光学显微镜观察 |
| 3.1.2 春尺蠖新病毒株的鉴定 |
| 3.2 ApciCPV对春尺蠖的生物活性 |
| 3.2.1 ApciCPV对春尺蠖3龄幼虫的致死作用 |
| 3.2.2 ApciCPV感染春尺蠖3龄幼虫的死亡率与时间的关系 |
| 3.3 ApciCPV与ApciNPV的复配后的增效作用 |
| 3.3.1 复配剂(ApciNPV+ApciCPV)对春尺蠖3龄幼虫的毒力 |
| 3.3.2 复配剂(ApciNPV+ApciCPV)感染春尺蠖3龄幼虫的死亡率与时间的关系 |
| 3.3.3 复配剂(ApciNPV+ApciCPV)对春尺蠖3龄幼虫的致死中时间 |
| 3.3.4 ApciCPV与ApciNPV对春尺蠖3龄幼虫的互作分析 |
| 3.4 ApciCPV对思茅松毛虫的生物活性 |
| 3.4.1 ApciCPV对思茅松毛虫3龄幼虫的致死作用 |
| 3.4.2 ApciCPV感染思茅松毛虫3龄幼虫的死亡率与时间的关系 |
| 3.5 ApciCPV与DekiNPV的复配后的增效作用 |
| 3.5.1 复配剂(DekiNPV+ApciCPV)对思茅松毛虫3龄幼虫的毒力 |
| 3.5.2 复配剂(DekiNPV+ApciCPV)感染思茅松毛虫3龄幼虫的死亡率与时间的关系 |
| 3.5.3 复配剂(DekiNPV+ApciCPV)对春尺蠖3龄幼虫的致死中时间 |
| 3.5.4 ApciCPV与DekiNPV对思茅松毛虫3龄幼虫的互作分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 ApciCPV的寄主域 |
| 4.2.2 ApciCPV对核型多角体病毒的增效作用 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）20种重组AcMNPV的构建及生物活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概括 |
| 1.1.1 杆状病毒简介 |
| 1.2 杆状病毒研究进展 |
| 1.2.1 杆状病毒基因研究进展 |
| 1.2.2 杆状病毒载体研究概括 |
| 1.2.3 杆状病毒杀虫剂研究概括 |
| 1.3 囊泡病毒概括 |
| 1.3.1 囊泡病毒研究概括 |
| 1.3.2 烟芽夜蛾囊泡病毒3h株的研究进展 |
| 1.4 研究设想 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、载体、菌株和细胞系 |
| 2.1.2 昆虫及实验器材 |
| 2.1.3 生化试剂及细胞培养基 |
| 2.1.4 引物及合成的全基因序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 感受态的制备 |
| 2.2.2 PCR扩增 |
| 2.2.3 限制性内切酶酶切反应 |
| 2.2.4 目的片段分离回收 |
| 2.2.5 连接反应 |
| 2.2.6 质粒DNA的转化 |
| 2.2.7 质粒DNA的提取 |
| 2.2.8 目的基因转座 |
| 2.2.9 Bacmid DNA的提取 |
| 2.2.10 转染昆虫细胞 |
| 2.2.11 BV的大量制备与重组病毒获取 |
| 2.2.12 供体载体pFB-ph-EGF的构建 |
| 2.2.13 重组bacmid的构建 |
| 2.2.14 甜菜夜蛾人工饲料的配制 |
| 2.2.15 多角体的扩繁 |
| 2.2.16 多角体的分离与纯化 |
| 2.2.17 重组病毒多角体形态观察 |
| 2.2.18 LD50和LD90的测定 |
| 2.2.19 LT50和LT90的测定 |
| 2.2.20 幼虫日均体重的测定 |
| 2.2.21 幼虫日均取食量的测定 |
| 2.2.22 常规实验试剂配制 |
| 2.2.23 技术路线 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 供体载体pFB-ph-EGF的构建 |
| 3.2 目的基因的克隆鉴定 |
| 3.3 重组载体的鉴定 |
| 3.4 重组bacmid的构建 |
| 3.5 重组bacmid转染Sf9 细胞 |
| 3.6 重组病毒多角体形态观察 |
| 3.7 重组病毒LD50和LD90的测定 |
| 3.8 重组病毒LT50和LT90的测定 |
| 3.9 感染重组病毒后幼虫存活曲线测定 |
| 3.10 幼虫日均体重的测定 |
| 3.11 幼虫日均取食量的测定 |
| 3.12 小结 |
| 第四章 总结与讨论 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 讨论 |
| 4.3 本文主要创新点 |
| 4.4 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1、培养基 |
| 2、质粒提取试剂 |
| 3、bacmid提取试剂 |
| 4、琼脂糖凝胶电泳 |
| 5、抗生素 |
| 6、其他试剂 |
| 附图 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac132的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒概述 |
| 1.1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.2 杆状病毒的分类 |
| 1.1.3 杆状病毒的侵染周期 |
| 1.1.4 杆状病毒的结构蛋白 |
| 1.1.5 λ-Red同源重组及其在杆状病毒中的应用 |
| 1.1.6 杆状病毒载体表达系统 |
| 1.1.7 病毒侵染宿主的研究进展 |
| 1.2 杆状病毒Ac MNPV的基因:ac132 |
| 1.2.1 ac132概述 |
| 1.2.2 Ac132的相关研究 |
| 1.3 杆状病毒与宿主肌动蛋白 |
| 1.3.1 杆状病毒侵染与宿主肌动蛋白 |
| 1.3.2 杆状病毒运输与宿主肌动蛋白 |
| 1.4 杆状病毒侵染与宿主细胞能量代谢 |
| 1.5 杆状病毒的发展前景 |
| 1.6 论文的设计思路 |
| 1.6.1 研究内容与意义 |
| 1.6.2 研究方法及流程 |
| 1.6.3 实验流程 |
| 1.6.4 研究创新点 |
| 第二章 重组杆状病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP、AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的构建及Ac132-EGFP的表达分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂及其配置 |
| 2.2.3 细胞、病毒、菌株及载体 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP和AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP的构建 |
| 2.3.2 重组病毒Ac MNPV-Ac132-EGFP的构建 |
| 2.3.3 Sf9细胞的培养、复苏、传代及冻存 |
| 2.3.4 重组杆粒转染Sf9细胞 |
| 2.3.5 噬斑法测定重组病毒的滴度 |
| 2.3.6 Western blot及荧光显微镜观察分析Ac132-EGFP的表达量 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP的构建 |
| 2.4.2 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP的构建 |
| 2.4.3 重组病毒Ac MNPV-Ac132-EGFP的构建 |
| 2.4.4 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP、AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的获得 |
| 2.4.5 重组病毒AcMNPV~(ac132ko)-EGFP、AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP的滴度 |
| 2.4.6 荧光显微镜和Western blot检测Ac132-EGFP在Sf9细胞中的表达水平 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Ac132在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 主要试剂及其配制 |
| 3.2.3 载体、菌株、细胞、病毒 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Sf9细胞的培养 |
| 3.3.2 Western blot检测Ac132-EGFP在细胞核中的积累 |
| 3.3.3 Ac132蛋白的核定位信号序列预测分析 |
| 3.3.4 重组突变型病毒的构建 |
| 3.3.5 重组突变型杆粒转染Sf9细胞 |
| 3.3.6 噬斑法测定重组突变型病毒的滴度 |
| 3.3.7 噬斑法检测重组病毒子代病毒的增殖 |
| 3.3.8 荧光显微镜观察重组病毒对F-actin进和出细胞核的影响 |
| 3.3.9 Western blot检测重组病毒对 β-actin在细胞核内的聚集 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 AcMNPV~(ac132ko)-Ac132-EGFP和Ac MNPV-Ac132-EGFP侵染Sf9细胞中Ac132-EGFP在细胞核的积累 |
| 3.4.2 突变病毒AcMNPV~(ac132ko)-Ac132~(PPKK25-28AAAA)-EGFP的构建 |
| 3.4.3 突变病毒Ac MNPV-Ac132~(PPKK25-28AAAA)-EGFP的构建 |
| 3.4.4 重组突变病毒的获得 |
| 3.4.5 重组突变病毒的滴度 |
| 3.4.6 各种重组病毒子代病毒增殖的分析 |
| 3.4.7 荧光显微镜观察各种重组病毒对F-actin进和出细胞核的影响 |
| 3.4.8 Western blot分析各种重组病毒对 β-actin在细胞核中的聚集 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 重组杆状病毒对宿主细胞能量代谢的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验仪器 |
| 4.2.2 主要试剂及其配置 |
| 4.2.3 细胞、病毒 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Sf9细胞的培养 |
| 4.3.2 细胞种板 |
| 4.3.3 病毒侵染 |
| 4.3.4 葡萄糖浓度的测定 |
| 4.3.5 乳酸浓度的测定 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 各种重组病毒侵染Sf9细胞对宿主消耗葡萄糖的影响 |
| 4.4.2 各种重组病毒侵染Sf9细胞对宿主积累乳酸的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（5）拟南芥钙调蛋白CBP60g在大肠杆菌和昆虫细胞内的表达与纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 植物钙信号 |
| 1.1.1 钙离子 |
| 1.1.2 钙离子感受器 |
| 1.1.3 钙信号的转导 |
| 1.2 钙调素蛋白概述 |
| 1.2.1 钙调素 |
| 1.2.2 钙调素结合蛋白 |
| 1.2.3 CBP60g |
| 1.3 重组蛋白表达系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.2 昆虫细胞-杆状病毒表达体系 |
| 1.3.3 昆虫细胞杆状病毒表达系统与大肠杆菌表达系统的比较 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 1.5 实验技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 菌株、质粒与引物 |
| 2.1.2 试剂、工具酶及耗材 |
| 2.1.3 仪器及设备 |
| 2.1.4 溶液与配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 拟南芥总RNA以及cDNA的获取 |
| 2.2.2 目的基因的获得 |
| 2.2.3 构建大肠杆菌表达载体 |
| 2.2.4 大肠杆菌表达目的蛋白 |
| 2.2.5 Ni-NTA纯化目的蛋白 |
| 2.2.6 目的蛋白的鉴定 |
| 2.2.7 构建昆虫细胞表达载体 |
| 2.2.8 构建重组杆状病毒质粒 |
| 2.2.9 昆虫细胞表达重组病毒 |
| 2.2.10 昆虫细胞表达目的蛋白 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 拟南芥CBP60g蛋白的性质 |
| 3.1.1 目的蛋白CBP60g疏水性N端的预测 |
| 3.1.2 CBP60g蛋白的二级结构预测 |
| 3.1.3 CBP60g蛋白糖基化位点预测 |
| 3.1.4 CBP60g蛋白磷酸化位点预测 |
| 3.2 利用大肠杆菌表达系统表达拟南芥CBP60g |
| 3.2.1 拟南芥RNA的提取与cDNA的合成 |
| 3.2.2 目的基因CBP60g的获得 |
| 3.2.3 构建大肠杆菌表达载体 |
| 3.2.4 大肠杆菌重组质粒鉴定 |
| 3.2.5 目的蛋白CBP60g在大肠杆菌中的诱导表达、纯化 |
| 3.3 利用昆虫细胞表达系统表达拟南芥CBP60g |
| 3.3.1 构建杆状病毒转移载体 |
| 3.3.2 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组菌测序结果 |
| 3.3.4 构建重组杆状病毒质粒 |
| 3.3.5 重组杆状病毒质粒的鉴定 |
| 3.3.6 CBP60g蛋白在昆虫细胞中的表达、纯化与鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 拟南芥CBP60g蛋白在大肠杆菌中的表达分析 |
| 4.2 拟南芥CBP60g蛋白在昆虫细胞中的表达分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 附录 |
（6）BmNPV iap2基因对宿主细胞凋亡的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 细胞凋亡研究进展 |
| 1.1.1 细胞凋亡概述 |
| 1.1.2 细胞凋亡途径 |
| 1.1.3 细胞凋亡的检测方法 |
| 1.2 IAP基因研究进展 |
| 1.2.1 IAP基因概述 |
| 1.2.2 IAP基因结构域及功能分析 |
| 1.2.3 IAP介导Caspase细胞凋亡的机制 |
| 1.2.4 IAP介导其他信号通路 |
| 1.3 杆状病毒与宿主互作研究 |
| 1.3.1 杆状病毒概述 |
| 1.3.2 杆状病毒与宿主相互作用 |
| 1.3.3 杆状病毒IAP与病毒感染研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景和目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 BmNPV iap2 基因的功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 BmNPV iap2 基因的序列分析 |
| 3.2.2 BmNPV iap2 的功能鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 BmNPV IAP2 相互作用蛋白的鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 BmNPV IAP2 相互作用蛋白的筛选 |
| 4.2.2 BmNPV IAP2 相互作用蛋白特征分析及亚细胞定位 |
| 4.2.3 BmNPV IAP2 相互作用蛋白的鉴定 |
| 4.2.4 BmNPV IAP2 相互作用蛋白对宿主细胞凋亡的影响 |
| 4.2.5 BmNPV IAP2 相互作用蛋白对病毒增殖的影响 |
| 4.2.6 BmNPV IAP2 相互作用蛋白对BmNPV IAP2 的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 BmNPV iap2、Bmiap和 Bmpp5 共同调控宿主凋亡 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 主要实验方法及步骤 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 BmNPV IAP2、BmIAP和 BmPP5 相互作用鉴定 |
| 5.2.2 BmNPV侵染过程中BmNPV iap2、Bmiap和 Bmpp5 基因表达 |
| 5.2.3 BmNPV iap2和Bmpp5对Bmiap的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 总结与结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文及参研课题 |
| 致谢 |
（7）杆状病毒AcMNPV ac51、ac73、ac75基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 杆状病毒的基因组和分类 |
| 1.1.1 杆状病毒的基因组 |
| 1.1.2 杆状病毒分类 |
| 1.2 杆状病毒的表型和感染周期 |
| 1.3 杆状病毒基因的表达 |
| 1.4 杆状病毒基因的分类 |
| 1.5 杆状病毒的应用 |
| 1.5.1 杆状病毒作为生物杀虫剂 |
| 1.5.2 杆状病毒表达系统 |
| 1.5.3 杆状病毒表面展示系统 |
| 1.5.4 杆状病毒应用于基因治疗 |
| 1.6 ac51、ac73、ac75基因背景知识 |
| 1.7 研究的意义和目的 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种、质粒和载体 |
| 2.1.2 细胞和昆虫 |
| 2.1.3 培养基和昆虫人工饲料 |
| 2.1.4 酶、抗生素及试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒提取 |
| 2.2.2 聚合酶链式反应(PCR)体系及程序 |
| 2.2.3 酶切反应 |
| 2.2.4 使用试剂盒回收PCR产物和酶切产物 |
| 2.2.5 酶连反应 |
| 2.2.6 用CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 |
| 2.2.7 连接产物或质粒转化感受态细胞 |
| 2.2.8 Bacmid转座 |
| 2.2.9 细胞传代、转染和感染 |
| 2.2.10 重组病毒的电镜切片制备 |
| 2.2.11 测定病毒滴度并绘制一步生长曲线 |
| 2.2.12 亚细胞定位的制片方法 |
| 2.2.13 纯化感染细胞中病毒多角体 |
| 2.2.14 粗提感染病毒幼虫中的多角体 |
| 2.2.15 配制甜菜夜蛾幼虫饲料 |
| 2.2.16 测定重组病毒半致死时间 |
| 2.2.17 收集取食多角体后虫体血淋巴 |
| 第三章 ac73基因功能的研究 |
| 3.1 缺失ac73基因ACBacmid(VAC~(ac73-ko-PH-PG))的构建 |
| 3.2 ac73基因拯救型ACBacmid(VAC~(ac73-rep-PH-PG))的构建 |
| 3.3 重组病毒Bacmid在Sf9细胞中的表达 |
| 3.4 电镜观察重组病毒粒子 |
| 3.5 重组病毒感染Sf9细胞的BV生长曲线 |
| 3.6 重组病毒的生物学测定 |
| 3.7 取食缺失ac73基因的多角体的甜菜夜蛾幼虫有BV生成 |
| 3.8 AC73蛋白的亚细胞定位 |
| 3.9 分析和讨论 |
| 第四章 ac51和ac75基因功能的研究 |
| 4.1 分别构建缺失ac51或ac75基因的ACBacmid (VAC~(ac51-ko-PH-PG)、VAC~(ac75-ko-PH-PG)) |
| 4.2 分别构建ac51和ac75基因拯救型ACBacmid(VAC~(ac51-rep-PH-PG)、VAC~(ac75-rep-PH-PG)) |
| 4.3 重组病毒Bacmid在Sf9细胞中的表达 |
| 4.4 电镜观察重组病毒粒子 |
| 4.5 重组病毒感染Sf9细胞的BV生长曲线 |
| 4.6 AC51蛋白和AC75蛋白的亚细胞定位 |
| 4.7 分析和讨论 |
| 第五章 总结与讨论 |
| 5.1 ac73基因功能分析 |
| 5.2 ac51和ac75基因功能分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间学术论文发表情况 |
（8）家蚕核型多角体病毒ORF40、ORF133/134和ORF92a的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.2 ODV病毒粒子的形成过程 |
| 1.1.3 杆状病毒编码蛋白的核质转运 |
| 1.1.4 影响ODV病毒粒子产生的基因 |
| 1.2 本研究的目的与科学意义 |
| 第二章 家蚕核型多角体病毒ORF40的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 家蚕核型多角体病毒ORF133/134的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 家蚕核型多角体病毒ORF92a的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 发表论文 |
| 专着 |
| 博士期间获得荣誉 |
| 致谢 |
（9）苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒GP41与两种宿主蛋白相互作用位点序列突变对病毒复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.1 杆状病毒的分类 |
| 1.1.2 杆状病毒的生活周期 |
| 1.1.3 杆状病毒的基因组成及表达调控 |
| 1.2 杆状病毒糖蛋白 |
| 1.3 杆状病毒与宿主间的相互影响 |
| 1.4 蛋白质相互作用研究方法 |
| 1.5 本课题研究的目的及意义 |
| 2. 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用菌株 |
| 2.1.2 实验所用病毒,细胞系及血清 |
| 2.1.3 载体质粒 |
| 2.1.4 抗生素,诱导剂及显色底物 |
| 2.1.5 PCR和测序引物 |
| 2.1.6 培养基及配方 |
| 2.1.7 酶,化学试剂及试剂盒 |
| 2.1.8 常用溶液及配方 |
| 2.1.9 实验设备 |
| 2.1.10 质粒和病毒 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 重组质粒构建 |
| 2.2.2 酵母双杂交阳性克隆回交实验 |
| 2.2.3 重组Bacmid构建 |
| 2.2.4 转染-感染实验 |
| 2.2.5 重组病毒滴度测定 |
| 2.2.6 qPCR实验 |
| 2.2.7 被转染细胞的透射电镜检测样品制备 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AcMNPV GP41 AA 81-330同源序列保守性分析 |
| 3.2 GP41AA 81-330区段几个保守氨基酸突变对其与宿主蛋白CHCHD2和GARS相互作用的影响 |
| 3.3 GP41与宿主蛋白CHCHD2和GARS相互作用位点编码序列突变对AcMNPV复制的影响 |
| 3.3.1 AcMNPV gp41突变体构建 |
| 3.3.2 AcMNPV gp41突变体转染-感染细胞的光镜观察表型 |
| 3.3.3 AcMNPV gp41突变体在被转染-感染Sf9细胞中产生BV的滴度 |
| 3.4 AcMNPV gp41敲除及L181/A突变体在被转染细胞中的形态发生 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ac75功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文中用到的缩写词 |
| 1. 研究背景与意义 |
| 1.1 杆状病毒简介 |
| 1.1.1 杆状病毒的分类 |
| 1.1.2 杆状病毒生活周期 |
| 1.2 杆状病毒分子生物学研究 |
| 1.2.1 杆状病毒基因组特征 |
| 1.2.2 杆状病毒表达时序性 |
| 1.2.3 杆状病毒结构蛋白基因 |
| 1.3 AcMNPV的特点和应用 |
| 1.3.1 Ac75基因背景简介 |
| 1.3.2 本论文的研究意义和目的 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细菌菌株和昆虫细胞 |
| 2.1.2 病毒及重组质粒 |
| 2.1.3 酶和分子量标准 |
| 2.1.4 抗生素 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.2 实验常用溶液 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 引物 |
| 2.5 本文构建的重组质粒和BACMD |
| 2.6 实验方法 |
| 2.6.1 制备化学感受态DH5A |
| 2.6.2 提取质粒 |
| 2.6.3 PCR获得目的片段或进行验证 |
| 2.6.4 使用琼脂糖凝胶回收DNA片段 |
| 2.6.5 载体和片段的双酶切及回收 |
| 2.6.6 酶连与转化 |
| 2.6.7 制备电转化感受态细胞: |
| 2.6.8 敲除目的基因 |
| 2.6.9 验证敲除是否成功 |
| 2.6.10 通过转座构建重组BACMID |
| 2.6.11 转染 |
| 2.6.12 感染 |
| 2.6.13 测定病毒滴度 |
| 2.6.14 QPCR |
| 2.6.15 制取透射电镜样品 |
| 2.6.16 BV和ODV的分离纯化 |
| 2.6.17 荧光素酶活性的测定 |
| 2.6.18 亚细胞定位实验重组质粒构建 |
| 3. 研究结果 |
| 3.1 AcMNPV Ac75序列分析 |
| 3.2 AC75在病毒结构上定位 |
| 3.3 AC75表达时相 |
| 3.4 Ac75突变体的构建 |
| 3.4.1 Ac75的敲除 |
| 3.4.2 含绿色荧光或多角体标记的Ac75突变体的构建 |
| 3.5 Ac75敲除对病毒增殖的影响 |
| 3.5.1 Ac75缺失突变体转染SF9细胞的光学显微镜观察结果 |
| 3.5.2 AC75缺失及其回复突变体感染SF9细胞的光学显微镜观察结果 |
| 3.5.3 Ac75缺失及其回复突变体感染SF9细胞的病毒滴度 |
| 3.5.4 Ac75缺失突变体转染SF9细胞BV释放情况 |
| 3.5.5 Ac75敲除不影响病毒基因组复制 |
| 3.5.6 Ac75敲除不影响晚期基因表达 |
| 3.6 Ac75缺失对病毒形态发生的影响 |
| 3.7 AC75亚细胞定位分析 |
| 4. 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文、科研成果等 |
| 致谢 |
四、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的形态及其形态发生电镜观察（论文参考文献）
- [1]菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究[D]. 周悦南. 浙江大学, 2021(01)
- [2]春尺蠖新病毒株的鉴定及其生物活性的研究[D]. 王承锐. 内蒙古农业大学, 2020(02)
- [3]20种重组AcMNPV的构建及生物活性分析[D]. 欧阳依依. 湖南农业大学, 2019(08)
- [4]AcMNPV侵染宿主细胞过程中Ac132的功能研究[D]. 彭跃有. 山西大学, 2019(01)
- [5]拟南芥钙调蛋白CBP60g在大肠杆菌和昆虫细胞内的表达与纯化[D]. 于爽. 内蒙古农业大学, 2019
- [6]BmNPV iap2基因对宿主细胞凋亡的调控机制研究[D]. 康涛涛. 西南大学, 2019(01)
- [7]杆状病毒AcMNPV ac51、ac73、ac75基因的功能研究[D]. 苏霞. 扬州大学, 2018(01)
- [8]家蚕核型多角体病毒ORF40、ORF133/134和ORF92a的功能研究[D]. 沈运旺. 浙江大学, 2018(12)
- [9]苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒GP41与两种宿主蛋白相互作用位点序列突变对病毒复制的影响[D]. 孙全. 华中师范大学, 2017(05)
- [10]苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ac75功能研究[D]. 郭亚君. 华中师范大学, 2016(01)