一、应用复合PCR鉴定1和5型疱疹病毒（论文文献综述）
马云云,于志亚,刘家森,康洪涛,姜骞,杨鸣发,曲连东[1]（2021）在《大兴安岭全沟硬蜱携带哺乳动物腮腺炎病毒5型的分离鉴定》文中提出为了明确黑龙江省大兴安岭地区媒介生物蜱携带病原的本底情况,本研究采集黑龙江省大兴安岭呼玛县、漠河县、塔河县、白桦乡、三卡乡、塔列图河、五叉沟和加北乡各地区的全沟硬蜱作为研究对象,利用病毒宏基因组学分析方法,经Illumina HiSeq2000高通量测序,共得到78 091 166条读长,经生物信息学分析,结果显示,其中涵盖的序列主要包括布尼亚病毒、巴库病毒、哺乳动物腮腺炎病毒和汉坦病毒等,并进一步对哺乳动物腮腺炎病毒5型进行了分离鉴定,将通过PCR检测为哺乳动物腮腺炎病毒5型阳性的样品接种PK15细胞分离培养,结果显示出现明显的细胞病变,培养第5 d病毒滴度达1×105.7TCID50/mL。盲传4代后经PCR鉴定为哺乳动物腮腺炎病毒5型阳性。进一步进行电镜观察,可见病毒粒子直径为50 nm～60 nm,完整的病毒粒子呈球形,有囊膜,且间接免疫荧光试验检测为阳性。经PCR扩增哺乳动物腮腺炎病毒5型全基因组序列并测序分析,结果显示该病毒的全长基因组序列与哺乳动物腮腺炎病毒5型的序列相似度高达96%,进一步验证了病毒宏基因组学分析结果。本研究首次从黑龙江省大兴安岭地区全沟硬蜱中分离得到一株哺乳动物腮腺炎病毒5型,为该地区蜱携带哺乳动物腮腺炎病毒5型的流行病学调查奠定了基础。
柴本杰[2]（2021）在《干扰素刺激基因Ifit家族在狂犬病病毒感染中的作用研究》文中研究说明狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）感染引起的一种烈性人兽共患传染病,目前仍在全球150余个国家和地区流行,严重威胁人类健康。狂犬病一旦出现临床症状,其死亡率接近100%,目前尚无有效的临床治疗方法。因此,进一步阐明RABV诱导的免疫反应与致病机制将为狂犬病的临床治疗奠定基础。干扰素（Interferon,IFN）信号通路在RABV感染过程中的先天性免疫反应中发挥重要作用。干扰素信号通路被激活后可表达多种效应分子即干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes,ISGs）,从而抵抗和清除入侵病原。Ifit家族蛋白（IFN-induced protein with tetratricopeptide repeats,Ifit）是众多ISGs中的一种,在抗病毒感染免疫反应中发挥着重要作用,但其在RABV感染中的作用尚未被明确。因此,本研究针对Ifit家族蛋白在RABV感染中的作用及机制进行了系统研究,具体如下:通过RNA高通量测序（RNA-sequencing,RNA-seq）和同位素标记相对与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）蛋白质组学方法发现RABV感染小鼠脑内有大量ISGs表达上调,其中Ifit家族蛋白表达上调明显。在进一步的反转录定量PCR（quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）检测中确认RABV感染小鼠体内Ifit家族蛋白表达上调。此外,RABV感染N2a细胞和BV2细胞后也可上调Ifit家族蛋白的表达。本研究进一步阐明了Ifit家族蛋白对RABV体外复制和致病性的影响。通过构建和拯救过表达Ifit家族蛋白的重组狂犬病病毒rRABV-Ifit1、rRABV-Ifit2和rRABV-Ifit3,发现单独过表达Ifit家族蛋白成员对RABV的体外复制无显着影响。在致病性研究中,通过滴鼻（intranasal,i.n.）、耳皮下注射（subcutaneous,s.c.）和肌肉注射（intramuscular,i.m.）三种感染方式探索了Ifit家族蛋白对RABV致病性的影响。结果发现过表达Ifit1在3种感染方式中均对RABV在小鼠体内的致病性无显着影响,过表达Ifit2在i.n感染中能显着降低RABV在小鼠体内的致病性,过表达Ifit3在s.c.和i.m.两种感染方式中均能显着降低RABV在小鼠体内的致病性,这表明Ifit3对RABV致病性影响最大,因此本研究进一步研究了Ifit3在RABV感染中的作用。在i.m.感染后小鼠不同组织和脑区内的病毒含量检测结果显示,过表达的Ifit3能显着降低病毒感染后第4天小鼠肌肉中的病毒含量和第6天、第8天小鼠大脑中的病毒含量。Ifit3-/-小鼠的致病性实验发现Ifit3的缺失会增加RABV致病性,而且rRABV-Ifit3在复制过程中过表达的Ifit3能补偿Ifit3基因缺失对RABV致病性的影响。最后,本研究探索了Ifit家族成员之间的相关作用关系。通过将Ifit1、Ifit2、Ifit3采用单独、两两组合、或三者共同的组合方式进行过表达后研究不同的组合对RABV病毒增殖的影响,发现Ifit2和Ifit3同时过表达能协同抑制RABV复制。为阐明Ifit2和Ifit3协同抑制RABV复制的具体机制,本研究通过免疫共沉淀实验确定Ifit2和Ifit3间存在相互作用,且Ifit3的1-93 aa段和170-403 aa段均可单独与Ifit2互作。在识别病毒RNA方面,过表达Ifit2或Ifit3或同时过表达Ifit2和Ifit3均不影响甲基转移酶活性受损的RABV突变毒rRABV-K1685A和rRABV-K1829A在N2a细胞中的复制。在诱导细胞凋亡方面,rRABV-Ifit2感染N2a细胞后能显着增加N2a细胞凋亡水平,但rRABV-Ifit1、rRABV-Ifit3却不能。此外,本研究还发现Ifit2和Ifit3能协同抑制负链RNA病毒RABV、VSV以及DNA病毒HSV-1复制,表明Ifit2和Ifit3间的协同抗病毒作用具有一定的广谱性。总之,本研究揭示了Ifit家族蛋白,尤其Ifit3在RABV感染中的作用及可能机制,为进一步阐明RABV引起的免疫反应与致病机制奠定了基础。
张洪亮[3]（2021）在《伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析》文中研究表明伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）,是一种可感染猪、牛、羊等家畜,犬猫等宠物,家兔、狐、貉、水貂等毛皮动物和野生动物,以引起发热、奇痒（猪除外）及脑脊髓炎等主要临床症状的疱疹病毒。该病毒可感染各年龄段的猪群,主要造成种猪繁殖障碍、仔猪发生神经系统和呼吸道症状。自2011年PRV变异株出现以来,导致Bartha-K61等传统疫苗的保护力有所降低,我国多个地区已免疫PRV疫苗的猪场发生伪狂犬病疫情,严重威胁了我国生猪养殖业的健康可持续发展。因此,本研究开展了PRV变异株的病原学、快速鉴别诊断技术、新型基因工程疫苗、转录组和蛋白质组学的研究,为该病有效防控奠定技术和理论基础。取得的主要研究成果有:1.本研究对山东某Bartha-K61疫苗免疫猪场感染的PRV野毒株进行了分离鉴定,成功分离鉴定到PRV SD-2017株,并完成了生物学特性分析。基于g E、TK和g B等毒力基因的遗传进化分析,确定该毒株为我国当前流行的PRV变异毒株。透射电镜观察病毒粒子直径大约在140～180 nm,有厚囊膜,囊膜表面有放射状纤突,粒子核心致密,呈现出疱疹病毒典型的病毒粒子形态结构。该毒株在PK-15细胞上的病毒滴度可达到109.0TCID50/m L,对家兔的半数致死量(LD50)为3.2×102.0TCID50/m L。2.针对PRV疫苗株与野毒株的鉴别诊断,筛选到特异性引物和探针,成功建立了PRV g B和g E基因的酶促重组等温扩增（ERA）荧光检测方法。g B和g E基因的ERA检测方法的敏感性分别为10copies/μL、103copies/μL,与荧光定量PCR方法比对,g B和g E基因检测结果符合率分别为100%和92.31%。该方法在38℃恒温反应25 min,能够实现对PRV g B和g E基因的特异性鉴别检测,将反应体系进行预冻干后,可组装成检测试剂盒进行现场应用,可有效应用于PRV野毒和疫苗毒的临床快速诊断。3.以PRV变异毒株SD-2017株作为亲本毒株,利用同源重组技术对g E/g I/TK毒力基因进行了缺失,分别构建了PRV SD-2017Δg E/g I株和SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株,并分析了其一步生长曲线、致病性等生物学特性,基因缺失株的病毒含量在PK-15细胞上仍能达到108.0TCID50/m L,SD-2017Δg E/g I/TK-EGFP株对家兔的LD50>1.0×106.0TCID50/m L,为针对PRV变异株开发基因缺失灭活疫苗和减毒活疫苗提供了理想的候选疫苗种毒。4.将树突状细胞靶向诱导肽DCpep作为分子内佐剂,脑膜炎奈瑟氏球菌Por B蛋白作为疫苗佐剂,分别构建了含有蛋白分泌信号肽gp67的重组杆状病毒Ac-g B-DCpep和Ac-Por B,利用昆虫细胞真核表达系统进行了PRV g B-DCpep蛋白融合表达和Por B蛋白真核表达,基于前期研究构建的PRV毒力基因缺失株,分别制备了PRV SD2017株Δg E/g I/TK三基因缺失活疫苗和Δg E/g I双基因缺失灭活疫苗,与g B-DCpep基因工程亚单位疫苗、Bartha K61活疫苗一同在家兔上进行了对PRV变异株感染的免疫保护效果评价。构建的SD2017Δg E/g I/TK减毒活疫苗、PRV-g B+Por B亚单位疫苗和SD2017Δg E/g I+Por B灭活疫苗,在家兔上显示了对变异株SD-2017良好的免疫保护作用。结果说明DCpep可作为潜在的分子佐剂,Por B蛋白可以作为新型疫苗佐剂,对体液免疫和细胞免疫均具有显着的诱导刺激作用,后续可应用于新型基因工程疫苗的制备,为PRV新型疫苗开发提供了新的策略。5.基于Illumina转录组测序技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的转录组差异进行了全面分析,发现差异上调的基因多集中在细胞周期、m TOR信号通路、自噬-动物、PI3K-Akt信号通路、细胞衰老、癌症的途径、胞吞作用、HTLV-I感染、ap1信号通路、MAPK等信号通路。差异下调的基因多集中在有氧化磷酸化、RNA转运、碳代谢、HTLV-I感染、人乳头瘤病毒感染和MAPK等信号通路。差异表达下调的基因富集最多的通路是核糖体、氧化磷酸化RNA转运、m RNA监测途径、卵母细胞减数分裂、内质网中的蛋白质加工、丙酸酯代谢、基因复制、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、生热等信号通路。相关基因的其生物学意义需要进一步研究揭示。6.利用TMT标记定量蛋白质组学技术对PRV SD-2017株、SD-2017Δg E/g I/TK株、Bartha K61株感染PK-15细胞的蛋白质组学差异进行了全面分析,解析了差异蛋白参与不同毒力PRV感染细胞中的生物学过程、分子功能及细胞定位。差异蛋白涉及的主要信号通路有抗原处理和展示、初级胆汁酸合成、醚脂质代谢、矿物质吸收、过氧化物酶体、HTLV-I感染、催产素信号通路、单纯疱疹感染、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒感染、细胞衰老、趋化因子信号通路、Notch信号通路等。PRV病毒-宿主细胞相互作用的机制值得进一步研究,尤其是蛋白质组差异中涉及的关键基因如何调节PRV感染方面,将有助于更好地了解PRV的特定感染机制。另外,本研究通过PRV感染PK15细胞的转录组和蛋白质组GO功能富集关联性分析发现,两者在细胞部分、细胞、细胞器部分大分子复合物、催化活性、结合、细胞过程、代谢过程等方面的显着差异相关联,为后续深入研究不同PRV毒株的致病机理提供了有利条件。
邵婷[4]（2021）在《猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究》文中研究说明猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是一种自主复制型单股负链DNA病毒,其复制完全依赖于宿主细胞的复制酶系统。PPV基因组主要包含两个开放性阅读框（Open reading frame,ORFs）ORF1和ORF2,ORF1编码非结构蛋白NS1、NS2和NS3,ORF2编码结构蛋白VP1和VP2。其中,VP2是病毒最重要的结构蛋白,占病毒衣壳组分的90%以上,是PPV最主要的免疫原性蛋白,能够刺激机体产生免疫反应,并且在病毒复制过程中发挥重要作用。微小染色体维持蛋白3（Minichromosome maintenance protein 3,MCM3）是MCM2～7复合物的组成亚基之一,参与了调控MCM复合物的组装,并与细胞DNA复制起始位点结合,从而影响细胞DNA的复制。还有研究报道,MCM复合物参与调控腺联病毒、疱疹病毒以及人细小病毒等多种病毒的复制过程。本实验室前期研究发现,在PPV感染过程中,PPV VP2通过与MCM3互作招募MCM3至病毒复制起始位点,促进病毒的复制。然而,PPV VP2是如何劫持MCM3促进自身复制的机制迄今尚不清楚。本研究拟首先制备VP2和NS1的多克隆抗体。然后,通过real-time PCR检测PPV感染PK-15细胞后病毒和细胞DNA的复制水平,通过Co-IP和Ch IP试验检测PPV感染PK-15细胞后MCM3与组蛋白H3的结合能力以及MCM3与细胞DNA复制起始位点的结合能力,研究PPV感染对宿主细胞DNA和自身复制的影响。最后,检测PPV感染对PK-15细胞MCM3表达及磷酸化水平的影响,确定MCM3磷酸化位点及调控MCM3磷酸化的关键病毒蛋白;检测MCM3磷酸化对VP2与MCM3的互作、MCM3与组蛋白H3的互作以及对PPV复制的影响。研究结果旨在阐明PPV VP2劫持MCM3促进自身复制的机制,为进一步探索PPV的致病机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.扩增并纯化得到PPV病毒粒子。构建NS1特异性片段（1395 nt～1986 nt）ns1s的原核表达载体p ET-32a-ns1s,经表达纯化得到NS1S重组蛋白。分别用纯化的PPV病毒粒子和NS1S重组蛋白免疫BALB/c小鼠,成功制备出鼠抗PPV VP2和NS1的多克隆抗体,间接ELISA和western blotting检测结果显示,鼠抗PPV VP2和NS1多克隆抗体效价均为1:256000,并且能够很好的识别原核/真核表达的PPV VP2、NS1重组蛋白以及PPV感染PK-15细胞内源性PPV VP2和NS1。2.以1 MOI PPV感染PK-15细胞,在感染0、12、24 h后real-time PCR检测PPV和细胞DNA复制水平的变化,结果显示,随着感染时间的延长,PPV病毒拷贝数显着升高（P<0.05）,宿主细胞DNA拷贝数显着降低（P<0.05）。Co-IP和Ch IP检测PPV感染后MCM3与组蛋白H3的结合情况以及MCM3与细胞DNA复制起始位点Lamin b2prom以及dhfr prom的结合情况,Co-IP结果显示,与Mock对照组相比,PPV感染组MCM3与组蛋白H3的结合能力显着降低（P<0.05）;Ch IP结果显示,与Mock对照组相比,PPV感染组MCM3和细胞DNA复制起始位点Lamin b2 prom以及dhfr prom的结合能力显着降低（P<0.05）。3.以1 MOI PPV感染PK-15细胞,在感染0、12、24、36 h后western blotting检测MCM3的表达及磷酸化水平的变化,结果显示,随着PPV感染时间的延长,MCM3总蛋白的表达无明显变化（p>0.05）,MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平显着降低（P<0.05）。重组质粒pCI-Flag-ns1、pCI-His-vp2分别转染PK-15细胞,在转染0、12、24、36 h后western blotting检测MCM3的表达及磷酸化水平的变化,结果显示,随着转染时间的延长,NS1重组质粒转染组中MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平显着降低（P<0.05）;而VP2重组质粒转染组中MCM3 160位苏氨酸的磷酸化水平无明显变化（P>0.05）。用重组质粒pCI-His-vp2与pCI-neo或与pCI-Flag-ns1共转染PK-15细胞,Co-IP结果显示,与pCI-His-vp2和pCI-neo共转染组相比,pCI-Flag-ns1和pCI-His-vp2共转染组中VP2与MCM3结合能力显着增加（P<0.05）。用重组质粒pCI-Flag-ns1转染PK-15细胞,Co-IP结果显示,与pCI-neo空载体转染组相比,pCI-Flag-ns1转染组中MCM3与组蛋白H3的结合能力显着降低（P<0.05）。最后构建过表达Flag-MCM3T 160A重组蛋白的PK-15细胞,1 MOI PPV感染野生型PK-15细胞、PK-15MCM3细胞和PK-15MCM3T160A细胞,在感染后24 h检测病毒粒子拷贝数、TCID50以及PPV VP2的表达,结果显示,与野生型PK-15细胞感染组相比,PK-15MCM3细胞感染组和PK-15MCM3T160A细胞感染组病毒粒子拷贝数和TCID50均显着升高（P<0.05）,同时,PPV VP2的表达也显着升高（P<0.05）;与PK-15MCM3细胞感染组相比,PK-15MCM3T160A细胞感染组病毒粒子拷贝数和TCID50均显着升高（P<0.05）,同时,PPV VP2的表达也显着升高（P<0.05）。本研究成功制备出鼠抗PPV VP2和NS1的多克隆抗体。发现PPV感染PK-15细胞后随着感染时间的延长,PPV复制水平显着升高,而细胞DNA复制水平却显着降低,MCM3与组蛋白H3及细胞DNA复制起始位点的结合能力显着降低。发现PPV NS1是PPV感染抑制MCM3 160位苏氨酸磷酸化的关键病毒蛋白,并且MCM3磷酸化降低促进了VP2与MCM3的互作、抑制了MCM3与组蛋白H3的互作。构建了MCM3T160A过表达细胞系,并命名为PK-15MCM3T160A细胞,发现了MCM3 160位苏氨酸磷酸化位点的突变显着促进了PPV的复制。上述研究结果阐明了PPV VP2劫持MCM3促进自身复制的分子机制,为进一步探索PPV的致病机制提供理论依据。
牛路[5]（2021）在《宏基因二代测序技术在感染性疾病中应用的临床资料分析》文中认为目的:分析宏基因二代测序（mNGS）技术与传统实验室方法在病原体检出方面的不同,探索mNGS技术在临床感染性疾病的诊治过程中的应用价值。方法:回顾性分析我院2019年12月至2020年12月于兰州大学第一医院住院的疑似感染的99例患者的mNGS以及传统病原体检测方法的相关资料,按照mNGS标本类型的不同将数据分为4组,分别为脑脊液、肺泡灌洗液、痰、血标本组。收集患者的常规病原学检测相关方法,包括脑脊液检查、血培养、痰培养、G+GM实验、血常规、CRP、PCT、胸部CT等临床数据,并结合患者临床诊治过程进行分析。结果:1.本研究共收集99例患者,其中男性患者56例,女性43例,总共获得100份行mNGS检测的样本,其中脑脊液标本最多为48（48%）份,其次为血标本26（26%）份,肺泡灌洗液标本21（21%）份,痰标本5（5%）份。总阳性标本81（81%）份,阴性19（19%）份。2.在48份脑脊液样本中,阳性34（70.8%）份,阴性14份（29.2%）,脑脊液培养阳性3（6.25%）份,mNGS阳性率高于培养法（70.8%vs6.25%）,3例培养结果与mNGS一致。其中22份（21例患者）阳性标本均有助于临床诊治,7份支持化脓性脑膜炎,15份支持病毒性脑炎。16例患者经验性治疗覆盖mNGS结果,且治疗有效,5例根据mNGS结果调整治疗,且治疗有效（100%）。7例临床诊断为病毒性脑炎的患者,mNGS结果均为阴性。3.在21份肺泡灌洗液标本中,阳性标本20（95.2%）份,阴性1（4.8%）份。20份阳性标本均有助于临床诊治,7例患者经验性治疗覆盖mNGS结果,且治疗有效,13例根据mNGS结果调整治疗方案,治疗均有效（100%）。4.在5份痰标本中,mNGS结果均为阳性,阳性率为100%。5份阳性标本均有助于临床诊治,1例患者经验性治疗覆盖mNGS结果,且治疗有效,3例根据mNGS结果调整治疗,治疗均有效（100%）。5.在26份血标本中,mNGS阳性标本22（84.6%）份,阴性4（15.4%）份,血培养标本阳性3（11.5%）份,mNGS阳性率明显高于血培养（84.6%vs11.5%）,3例血培养结果与mNGS一致。21份阳性标本均有助于临床诊治,3例患者经验性治疗覆盖mNGS结果,且治疗有效,17例患者根据mNGS结果调整治疗,14例患者治疗有效（82.4%）,3例（17.6%）治疗无效。6.利用mNGS技术观察病原体序列数的变化判断疾病进展与治疗效果。1例化脓性脑膜炎患者,于抗感染治疗前后对其脑脊液标本分别进行mNGS检测,结果为流感嗜血杆菌阳性,治疗后的病原体序列数较治疗前明显减少,且同时伴随患者感染指标的改善及临床症状的好转。7.利用mNGS技术检测血浆中病原体的游离DNA诊断肺部感染。3例血培养均为阴性的患者,利用mNGS技术检测血浆中病原体的游离DNA,检测结果分别为耶氏肺孢子菌、结核分枝杆菌、黄曲霉,最终明确诊断为卡氏肺孢子虫肺炎、肺结核、真菌性肺炎且均治疗好转。8.比较使用抗生素组和未使用抗生素组对mNGS检出结果的影响,结果显示两组之间的差异无明显统计学意义（P=0.201）。结论:1.mNGS在病原体检出方面较传统方法具有明显优势,不仅敏感性和时效性均优于培养方法,而且能够一次检出多种类型病原体,尤其对一些常规方法难以检测的病原体。2.mNGS可以结合传统方法、患者病史以及相关临床检查,明确感染性疾病的诊断,指导临床治疗。3.利用mNGS技术检测患者不同治疗阶段的样本,通过观察病原体序列数的变化来判断疾病病情进展和治疗效果。4.利用mNGS技术检测患者血浆中病原体的游离DNA,对于临床明确其他感染部位的致病菌具有一定的临床应用价值。5.抗生素对mNGS检出结果的影响小于传统病原体检测方法。
朱冰[6]（2020）在《猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立及初步应用》文中提出伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的一种以侵害中枢神经系统为主要特征的高度接触性动物传染病,猪是其唯一的天然宿主。20世纪80年代我国从匈牙利引进了伪狂犬Bartha-K61减毒活疫苗,有效地控制了PRV在我国的流行;然而从2011年开始,暴发了PRV变异毒株并持续扩散,PRV再一次成为引起我国养猪业重大损失的主要病原之一。针对当前PRV的流行现状,建立更为高效、准确的检测方法对疫情的防控乃至该病的最终根除均有重要意义。本研究首先利用2013年采集于黑龙江省某猪场经鉴定为PRV阳性的组织样品进行病毒分离,经细胞病变观察、PCR检测、间接免疫荧光以及电镜检测证实成功分离出一株RPV,并命名为PRV HLJ-2013。随后,利用高通量测序技术对该病毒的全基因组序列进行了测定,并在基因组、编码蛋白基因以及氨基酸序列等水平上对病毒的进化特征做了分析。结果显示,PRV HLJ-2013的基因组全长为142.56 kbp;该毒株与国内参考毒株同属于基因II型,但在进化树上介于国内分离株和国外分离株之间的一个独立的分支上;该毒株各编码蛋白基因与其他参考毒株相应的编码蛋白基因表现出不同的进化关系,其中UL10（gM）、UL44（gC）、UL36（VP1/2）与国外毒株亲缘关系较近,而US6（gD）、UL19（VP5）与国内早期毒株（如SC、Fa和Ea毒株）处于同一进化分支。以上结果表明PRV HLJ-2013毒株可能为一株出现较早,且持续存在的毒株。PRV HLJ-2013及国内PRV经典株SC和变异株HeN1的细胞接种实验及小鼠致病性实验结果表明,PRV HLJ-2103在PK15细胞上的生长特性与SC及HeN1没有显着差异;HLJ-2013感染小鼠可引起明显的脑及肺组织的损伤,且致病力强于SC毒株,但弱于HeN1毒株。以上结果表明,本研究成功分离并鉴定了一株在遗传及部分生物学特性上与当前其他PRV毒株存在一定差异的新毒株,并且该毒株是我国早起流行毒株的分支。为制备PR化学发光抗体检测方法包被抗原,对PRV HLJ-2013进行了扩大培养,获得浓度为5.2 mg/mL的纯化病毒抗原,满足方法建立需求。利用磁微粒将浓缩PRV抗原包被至其表面,同时将碱性磷酸酶与兔抗猪IgG抗体进行偶联获取酶标二抗,并对封闭剂浓度、洗涤液浓度、酶促发光反应检测时间以及两步免疫反应时间等反应条件进行优化。实验最终确定磁珠最适抗原包被浓度为400μg/mL、酶标二抗的最佳稀释度为1:10000、封闭剂BSA的最佳浓度为2%、PBST洗涤液的最适浓度为0.2%、两步免疫反应的最佳时间是10 min+10 min、酶促发光反应后最佳检测时间为5 min。对猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法在灵敏度、重复性、特异性和稳定性等方面进行了初步评价,结果表明,本研究建立的诊断方法相对于PRV gB抗体ELISA试剂盒,其灵敏度更高;批内及批间变异系数均小于10%,方法的重复性较好;与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、非洲猪瘟等十种不同病原抗体阳性血清不存在交叉反应;检测方法的各试剂组分稳定性良好。使用本研究建立的方法与商品化ELISA试剂盒共同检测临床猪血清样品,两种检测方法的总体符合率为96.83%;并且两种方法在免疫猪血清检测实验中获得了一致的检测结果。本研究成功分离并鉴定了一株在遗传及部分生物学特性上与国内毒株存在一定差异的PRV HLJ-2013毒株,并以纯化浓缩的全病毒作为包被抗原,建立了基于全病毒的磁微粒化学发光检测方法。该方法灵敏度高、检测时间短、重复性和特异性良好,具有一定的应用前景,可以为免疫猪的PRV抗体监测提供另一种快速的新型检测手段。
万伟玮[7]（2020）在《抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究》文中指出沙粒病毒是一类有囊膜包裹的负链分节RNA病毒,其多个成员如瓜纳瑞托病毒（Guanarito virus,GTOV）、胡宁病毒（Junin virus,JUNV）、拉沙病毒（Lassa virus,LASV）、Lujo病毒（Lujo virus,LUJV）、马秋波病毒（Machupo virus,MACV）、萨比亚病毒（Sabia virus,SABV）、和白水河病毒（Whitewater Arroyo virus,WWAV）在西非和南美等地区流行,可以导致感染者出现出血热等症状,严重威胁人类健康。目前临床上除了广谱的抗病毒药物利巴韦林,没有FDA批准的特异性针对沙粒病毒的疫苗及药物,然而利巴韦林的治疗效果有限并且有较大的副作用。因此,迫切需要通过各种研究手段来寻找新的抗沙粒病毒药物。在本课题中,我们构建了低致病性沙粒病毒淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV）的反向遗传操作系统,并利用该系统拯救出带e GFP的重组LCMV病毒,随后我们利用含1018种小分子化合物的FDA成药库对重组LCMV进行了抗病毒活性筛选,发现霉酚酸、氯法齐明、贝尼地平、达拉菲尼和阿帕替尼具备较强的抗LCMV活性。其中贝尼地平的抗LCMV活性最强,在Vero细胞上IC50=0.548μM、CC50=113.8μM、SI=207.66,并且在动物水平也展现了一定的抗LCMV活性。贝尼地平是一种二氢吡啶类钙离子通道抑制剂,在临床上可以用于治疗高血压和缺血性心脏病,同时也有血管保护和肾脏保护作用。进一步的功能研究表明,贝尼地平主要靶向LCMV入侵宿主细胞的膜融合过程。将LCMV在含有贝尼地平的培养基中多次传代获得了适应性突变的病毒,对病毒基因组测序发现了位于GPC上的突变D414A,并通过反向遗传学操作系统拯救出了适应性突变病毒株LCMV GPC-D414A,其GP2上D414A突变导致突变病毒对贝尼地平的抑制作用产生抗性。同时,贝尼地平对D414A突变的LCMV GPC介导的膜融合过程也失去了抑制效果,暗示贝尼地平可能通过与GP2上的D414位点直接或间接的相互作用,影响了GPC在低p H条件下的构象改变,从而抑制了病毒的膜融合;这一位点发生突变之后,贝尼地平与GPC的相互作用受阻,GPC的膜融合可以正常进行。此外我们还发现其它二氢吡啶类钙离子通道抑制剂对LCMV也具有抑制效果,并且LCMV GPC-D414A同样对这些药物的抑制作用存在抗性,这一结果表明这些二氢吡啶类钙离子通道抑制剂的抗病毒机制与贝尼地平类似。与此同时,我们发现霉酚酸、氯法齐明、达拉菲尼和阿帕替尼对新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2）也具有抑制效果,其中霉酚酸的IC50=0.101μM、CC50>100μM、SI>1000。霉酚酸是细胞内IMPDH（Inosine monophosphate dehydrogenase）抑制剂,能够降低细胞内鸟嘌呤核苷水平从而影响GTP的合成并抑制病毒的复制。我们发现通过向细胞培养基中额外添加鸟嘌呤核苷,可以缓解霉酚酸对LCMV和SARS-Co V-2两种病毒的抑制。霉酚酸、氯法齐明、贝尼地平、达拉菲尼和阿帕替尼都是FDA批准的药物,其临床安全性较为可靠,有望快速应用于沙粒病毒和SARS-Co V-2的临床治疗。HSV-1是一种在人类宿主中广泛携带的双链DNA病毒,感染人群可以终身携带病毒并且周期性的发病,在免疫力低下的情况下可能出现严重的症状。为了研究该病毒与宿主细胞的相互作用机制,本课题使用基于质谱的定量蛋白质组学的方法分析了宿主细胞HEK 293T感染HSV-1后蛋白质组的变化。我们总共鉴定到了6607个宿主蛋白,其中498个蛋白的表达受到调控。使用RNAi敲降的方法,我们发现了三个宿主蛋白IFITM3（IFN-inducible transmembrane protein 3）、CHCHD2（Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2）和TRIM27（Tripartite motif-containing protein 27）可以抑制病毒复制。通过生物信息学分析,我们鉴定到了一批参与HSV-1感染的宿主细胞信号通路,从系统的角度探究了HSV-1感染对宿主细胞的影响。
沈阳坤[8]（2020）在《HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究》文中提出溶瘤病毒疗法（Oncolytic virus therapy,OVT）作为一种前景广阔的肿瘤治疗手段,具有安全、高效和副作用低的特点,已经成为肿瘤治疗研究中的热点。其中,I型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1,HSV-1）作为研究最为广泛的一类溶瘤病毒,已有几十种候选药物处于临床前或临床研究阶段。然而,多年的临床试验表明,单一的溶瘤病毒疗法只有有限的治疗效果,且具体机制尚不明确。宿主中的一些蛋白质对病毒的侵染、繁殖以及传染至关重要,被称为病毒的宿主依赖因子（Host Dependency Factor,HDF）。已有证据表明,细胞和动物水平HDF的缺陷,会导致病毒的感染失败。然而尽管目前已有针对HSV-1复制周期及HSV-1的免疫机制等方面的深入研究,但对病毒与宿主间的相互作用的理解,特别是涉及病毒感染和裂解复制的细胞质蛋白的作用仍然所知甚少。此外,肿瘤患者体内的HDF突变是否影响HSV-1类溶瘤病毒的治疗尚未见系统研究。本论文研究的目的是探讨HSV-1病毒HDF突变在溶瘤病毒精准治疗中的作用及肿瘤耐受的机制。方法:（1）利用CRISPR/Cas9技术制备ICP34.5基因缺失的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-ΔICP34.5、HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌MC38细胞MC38Nectin1-/-和表达NEO-2/15的HSV-1溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15。（2）制备小鼠B16黑色素瘤模型和小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（3）制备小鼠MC38结肠肿瘤模型,利用HSV-1-ΔICP34.5和HSV-1-NEO-2/15溶瘤病毒治疗并评估治疗效果。（4）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术筛选HSV-1病毒的HDF。（5）通过统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等方法确定HSV-1病毒HDF的候选基因。（6）利用CRISPR/Cas9技术制备Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6等基因的敲除细胞并通过病毒感染、台盼蓝法、细胞计数法、q PCR和Western Blotting检测HDF缺失对病毒感染的影响。（7）通过HSV-1病毒的膜结合实验评估HSV-1病毒的HDF缺失后病毒和宿主细胞的结合能力。（8）通过共聚焦显微镜追踪HSV-1病毒进入细胞的过程。（9）利用TCGA数据库分析临床肿瘤患者体内HSV-1病毒HDF的突变频率。结果:（1）HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗对小鼠MC38结肠癌治疗效果显着,然而对B16黑色素瘤未见明显效果。接着,我们利用HSV-1-ΔICP34.5溶瘤病毒治疗HSV-1病毒受体Nectin1基因缺失的小鼠结肠癌,结果显示,和对照组相比,Nectin1基因缺失的小鼠肿瘤体积未见明显缩小,证实溶瘤病毒对小鼠MC38-ΔNectin1结肠肿瘤的治疗无效。（2）本研究中,利用CRISPR基因编辑技术,我们成功制备HSV-1-NEO-2/15新型溶瘤病毒。通过对小鼠MC38结肠肿瘤的治疗,我们的研究结果表明,NEO-2/15不仅可以和HSV-1溶瘤病毒同时使用,并且NEO-2/15的整合能够显着增强溶瘤病毒的治疗效果。（3）利用人类CRISPR全基因组敲除文库结合高通量测序技术,结合统计学、基因富集分析、KEGG通路分析、PANTHER GO分析和基因重叠分析等分析方法,我们最终得到了31个HSV-1病毒的候选HDF基因。通个基因敲除验证,我们已经证实细胞水平敲除Nectin1、ENTPD1、HCFC1R1、EXT1、EXT2、EXTL3、Tm9sf3和B3GALT6可以显着增强细胞抵抗HSV-1病毒感染的能力。此外,KEGG分析结果表明EXT1、EXT2、EXTL3和B3GALT6等基因在硫酸乙酰肝素合成通路中扮演重要作用。基因敲除结果表明这些基因的突变不仅能够显着降低HSV-1病毒对宿主的感染水平,而且还能降低病毒与宿主细胞的结合能力。ENTPD1基因的缺失只影响HSV-1病毒进入宿主细胞,并不影响病毒与细胞膜的结合。（4）根据TCGA数据库提供的肿瘤患者基因信息,大部分基因在至少一种肿瘤中存在突变,且部分基因的突变频率高达5%以上,意味着HSV-1溶瘤病毒对这些肿瘤可能得不到很好的治疗效果,暗示HDF的精准检测在溶瘤病毒治疗前的必要性。结论:本研究中,基于HDF突变引起的溶瘤病毒感染失败的现象,我们首次提出溶瘤病毒抵抗（Oncolytic virus resistance）的概念,即当患者体内发生溶瘤病毒HDF的突变,溶瘤病毒的治疗效果就会消失;或者治疗前期溶瘤病毒对肿瘤的效果显着,但是随着肿瘤细胞增殖过程中异质性分化的更加明显,部分肿瘤细胞的HSV-1宿主依赖因子的表达水平降低或者发生基因突变,导致HSV-1病毒的感染减少或者失败,最终影响溶瘤病毒的治疗效果。基于此概念,寻找新的肿瘤治疗药物并用于溶瘤病毒的联合治疗是该治疗领域的一个重要研究方向。因此,我们构建了一种新型HSV-1类溶瘤病毒HSV-1-NEO-2/15,能显着增强肿瘤的治疗效果。此外,利用CRISPR全基因组敲除文库筛选出多个HSV-1的HDF,并深入探讨了部分基因的功能。近年来国内溶瘤病毒治疗的临床研究越来越多,而专门针对溶瘤病毒的精准医疗检测尚未见报道。本研究证实了根据HSV-1病毒HDF的突变与否可以判断患者能否获益于溶瘤病毒的治疗,以减少不当治疗带来的病情延误和资源浪费。未来,通过对这些蛋白的深入研究,将为开发HSV-1类溶瘤病毒耐药检测试剂盒以及为肿瘤患者制定个性化治疗方案提供研究依据。同时依据这些靶点,可以开发出新的抗HSV-1病毒药物,为溶瘤病毒治疗后因病毒残留带来的潜在感染风险提供新的解决方案,把溶瘤病毒治疗的副作用降到最低。
李思云[9]（2020）在《宏基因二代测序技术在诊断不明原因肺部感染中应用价值的研究》文中认为研究背景:肺部感染（Pulmonary infection）是临床中最常见的感染性疾病之一,为各种病原微生物所引起的肺部炎症,具有较高的发病率和致死率。由于现代医学的迅速发展,随着广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂等的广泛应用,各种非典型病原体感染、广谱耐药病原体感染以及多重病原体的混合感染机率越来越大,对病原学的快速及精确检测提出了更高的要求。临床传统检测方法多为痰液、支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）病原菌的分离、培养、鉴定,但检测时间较长、阳性率低。分子诊断学方法可以迅速检出病原体,但容易产生假阳性结果,且无法检测新发病原体感染、多重耐药病原体感染及混合感染。宏基因组二代测序（Metagenomic next generation sequencing,mNGS）技术作为一种新型的病原学检测方法,因其通量高、成本较低、敏感性高、无偏倚等优势,在感染性疾病病原学检测方面的价值日益显现。目的:（1）比较mNGS技术与传统实验室检测方法在病因不明的肺部感染病原学诊断上的效能;（2）探讨mNGS在肺部感染病原学诊断中的潜在应用价值。方法:回顾性分析2018年1月至2019年12月于南昌大学第一附属医院呼吸内科病房及呼吸重症监护室诊断为肺部感染及行mNGS检测的住院患者共56例。收集全部患者的基本资料、病史、体征、实验室及其他辅助检查结果。在常规诊治中留取患者痰液、BALF、血液、胸腔积液或者肺组织等标本,同时送检普通实验室病原学检测（如:痰涂片、痰培养、BALF培养、血培养、核酸检测、抗原抗体检测等）和mNGS检测,根据患者临床特征及其相关辅助检查结果,形成最终病原学诊断。用McNemar检验比较mNGS与传统实验室检测方法诊断肺部感染的差异,并分别比较两者在细菌、真菌、病毒、非典型病原体及结核性肺部感染中的效能。结果:共纳入44例患者（男性27例,女性17例,平均年龄57.30岁）的43份肺泡灌洗液mNGS标本及10份静脉血mNGS标本。mNGS检测出病原体51株,阳性率为84.09%;传统实验室检测出病原体30株,阳性率为59.09%。用McNemar检验对44例不明原因肺部感染患者mNGS与传统实验室检测结果比较,两者差异有统计学意义（p=0.007<0.05）,可认为NGS检测较传统实验室检测阳性率高;但是Kappa=0.22<0.4,认为两种检测方法一致性较差。mNGS在诊断病毒感染和不典型病原体感染的阳性率明显高于传统方法,p值分别为0.041（84.62%vs 38.46%）和<0.01（100.0%vs 14.29%）;在细菌和真菌感染患者中,mNGS的阳性率均较高于传统方法,但差异不明显;结核分枝杆菌感染患者3例,因样本量太少无法比较两者差异。mNGS诊断出全部11例混合感染,其中传统方法仅检出2例,还有2例传统方法未检出病原体。本项研究中,细菌感染以革兰阴性菌为主,其中以铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌多见;病毒感染以人疱疹病毒为主,主要为人疱疹病毒-1型（单纯疱疹病毒-1型）、人疱疹病毒-4型（EB病毒）、人疱疹病毒-5型（巨细胞病毒）,病毒多与细菌、真菌混合存在;真菌感染以耶氏肺孢子虫多见;非典型病原体以鹦鹉热衣原体多见。结论:mNGS诊断肺部感染的效能总体优于传统方法,在病毒、非典型病原体及混合感染的诊断中更显着。虽然mNGS尚不能替代传统方法成为诊断肺部感染的金标准,但可作为临床病原学检测的有效补充方法,两者联合使用可提高肺部感染病原体的检出率。
靳卫平[10]（2020）在《CV-A5小鼠主动免疫保护模型建立及候选疫苗体内效力评估》文中进行了进一步梳理手足口病（hand,foot,mouth diseases,HFMD）已成为我国发病率较高的丙类传染病。人肠道病毒71型（EV-71）、柯萨奇病毒A组、B组、埃可病毒均引起HFMD。2008年HFMD在我国爆发流行,同年被纳入传染病防治法进行管理和检测。随着EV-71疫苗的上市,重症HFMD病例明显减少。但是自2012年以来我国由非EV-71、非柯萨奇病毒A16型（CV-A16）引起的HFMD爆发逐渐增多。在北京、山东、广州、湖南、福州和深圳等省市已超过50%,并且在部分地区达到了80%以上。根据2018年中国疾病控制中心（CDC）发布的HFMD病例数据显示排除EV-71和CV-A16,柯萨奇病毒A6型（CV-A6）和柯萨奇病毒A10型（CV-A10）占比升高,柯萨奇病毒A2型（CV-A2）、柯萨奇病毒A5型（CV-A5）的病例开始增加。而本研究样品的来源湖北襄阳地区,基于EV-71疫苗干预的背景下,2016-2017年期间HFMD患儿的3216份临床样本中分析得知CV-A5的发病率增高至4.57%。为了降低HFMD的发病率,在EV-71疫苗基础上研发多价HFMD疫苗势在必行。但CV-A5相关基础研究薄弱,相关的研究进展缓慢。CV-A5致病机理、免疫原性及评价疫苗效力的各种动物模型研究和建立亟待解决。本研究首先通过原核表达系统构建和表达CV-A5结构蛋白VP1、VP2、VP3以及病毒实心颗粒（FP,细胞工厂纯化）,并将其免疫日本大耳白兔。细胞工厂制备和纯化FP,用于制备中和活性的多克隆抗体。最终获得Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP为病毒鉴定及抗原的定性定量分析提供工具。本研究将临床分离株CVA5-3487在昆明鼠和RD细胞交替适应性传代,经过15次鼠脑和16代细胞传代适应获得小鼠适应准种库CVA5-M14。该病毒株通过腹腔,颅内,口服途径感染昆明鼠。病毒株通过三次空斑纯化后获得20个克隆株,随后选取两株病毒滴度相同的克隆株,以相同的感染剂量进行体内毒力比较试验,筛选出一对强弱毒株,分别是CVA5-M14-611,CVA5-M14-111。两个病毒株全基因组序列分析得知共有8个位点核苷酸存在差异,其中有4个核酸位点与氨基酸的变化有关,与病毒毒力有关,分别为VP2-T1239C/V165A;VP3-T1749C/Y335H;VP1-A2540G/S599G;3D-A6104C/I1787L。强弱毒株及动物模型研究内容已获专利受理号（202010097588.2）。本研究通过高感染复数传代将CV-A5适应至Vero细胞,并筛选适合疫苗研发的克隆候选株。人工合成两株CV-A5克隆株基因全序列,构建至pBR322质粒形成重组载体。制备感染性cDNA进行病毒拯救,成功拯救出两株经RD细胞分离,但无RD细胞传代背景,符合人用疫苗Vero细胞基质生长的疫苗候选株。两个疫苗候选株的从生长能力、全基因组序列、抗原产量研究以选择高滴度、高产量的疫苗候选株。两株病毒对生长能力存在差异,全基因组序列分析发现共有15个位点核苷酸存在差异,其中有6个核酸位点改变引起氨基酸的改变,分别为VP4-C941T/F66S;VP4-A1107G/R121K;VP2-T1404C/A220V;VP3-G2204A/V487I;VP3-T2586C/V614A;3D-G6854A/T2037A。本研究在10层细胞工厂中培养,接种病毒,制备候选疫苗。将病毒收获液通过蔗糖垫底离心,氯化铯（CsCl）密度梯度离心纯化收获液,获得CV-A5三种病毒颗粒,即空心颗粒（EP）,FP和致密病毒颗粒（DP）。利用TEM,SDS-PAGE,WB对病毒颗粒的完整性,纯度和特异性进行鉴定,分别以EP、FP、EP+FP（自然比例2:8）、VLP为抗原,加入终浓度为1.05mg/ml铝佐剂,免疫剂量分别为每剂0.5μg、1.5μg、4.5μg纯化病毒颗粒,两次免疫小鼠并检测血清中和抗体滴度以确定每个剂量组的血清抗体阳转率和体液免疫应答。结果显示4种抗原均可诱导高水平中和抗体,血清抗体至少维持至初免后第10周。FP、EP+FP的体液免疫原性强于EP、VLP组。在抗原剂量为1.5μg时FP、EP+FP可诱导最高水平中和抗体的产生。EP在1.5μg剂量时才能诱导小鼠产生较高效价的中和抗体,并高于13.5μg的VLP组。此外,本研究建立14日龄主动免疫-攻毒保护模型并评估CV-A5单价灭活疫苗保护效率。即昆明鼠分别于第3、10日龄时进行初免和加强免疫CV-A5 EP、FP、EP+FP、VLP抗原,免疫剂量为1.5μg,对14日龄昆明鼠攻毒（加强免疫后第4天）。结果EP、FP、EP+FP疫苗保护率为100%,VLP疫苗保护效果为90%,加强免疫攻毒当天后昆明鼠血清中和效价最高可达32,免疫攻毒后观察期结束第14天仍可检测到中和抗体效价为1024。结果表明小鼠免疫-病毒攻击时,体液免疫记忆细胞快速应答。此动物模型成功用于CV-A5疫苗主动保护实验,为CV-A5单价灭活疫苗体内保护效力提供了动物试验数据,并为多价手足口疫苗研制提供了疫苗体内效力评价方法。
二、应用复合PCR鉴定1和5型疱疹病毒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用复合PCR鉴定1和5型疱疹病毒（论文提纲范文）
（1）大兴安岭全沟硬蜱携带哺乳动物腮腺炎病毒5型的分离鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.2 蜱样本采集 |
| 1.3 病毒宏基因组学分析 |
| 1.4 PCR检测 |
| 1.5 病毒的分离 |
| 1.6 病毒的电镜观察 |
| 1.7 分离病毒的间接免疫荧光（IFA）鉴定 |
| 1.8 分离病毒的基因组序列测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 蜱样本的采集 |
| 2.2 病毒宏基因组学分析 |
| 2.3 哺乳动物腮腺炎病毒的PCR检测及分离 |
| 2.4 分离病毒的鉴定 |
| 3 讨论 |
（2）干扰素刺激基因Ifit家族在狂犬病病毒感染中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 1 前言 |
| 1.1 文献综述 |
| 1.1.1 狂犬病流行现状 |
| 1.1.2 狂犬病病毒特性 |
| 1.1.3 干扰素(IFN)通路 |
| 1.1.4 RABV感染与ISGs表达 |
| 1.1.5 IFIT研究进展 |
| 1.1.5.1 IFIT的发现 |
| 1.1.5.2 IFIT在细胞增殖中的作用 |
| 1.1.5.3 IFIT在蛋白质合成中的作用 |
| 1.1.5.4 IFIT在抗病毒感染中的作用 |
| 1.1.5.5 IFIT识别外源RNA |
| 1.1.5.6 IFIT结合病毒蛋白 |
| 1.1.5.7 IFIT调节信号通路 |
| 1.1.5.8 其它种属动物IFIT |
| 1.2 目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、细胞和病毒 |
| 2.1.2 抗体和实验动物 |
| 2.1.3 主要药品与试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA-seq建库、测序 |
| 2.2.2 iTRAQ蛋白质组学分析 |
| 2.2.3 小鼠组织或细胞总RNA的提取 |
| 2.2.4 cDNA的获取与Ifit基因克隆 |
| 2.2.5 鼠源 Ifit和人源 IFIT真核表达质粒的构建 |
| 2.2.6 过表达Ifit的重组RABV感染性克隆全长质粒构建 |
| 2.2.7 细胞转染 |
| 2.2.8 重组RABVs的拯救 |
| 2.2.9 重组RABVs的免疫荧光检测 |
| 2.2.10 蛋白浓度测定(BCA法) |
| 2.2.11 免疫印迹实验(Western blot,WB) |
| 2.2.12 间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA) |
| 2.2.13 重组RABVs的扩大培养 |
| 2.2.14 重组RABVs在乳鼠脑内的扩增和传代 |
| 2.2.15 重组RABVs的滴度测定 |
| 2.2.16 重组RABVs在 BSR细胞和N2a细胞中的荧光灶大小测定 |
| 2.2.17 重组RABVs的多步生长曲线和一步生长曲线测定 |
| 2.2.18 重组RABVs对细胞凋亡的影响 |
| 2.2.19 RT-qPCR |
| 2.2.20 免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测 |
| 2.2.21 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP) |
| 2.2.22 Ifit3~(-/-)小鼠构建 |
| 2.2.23 重组RABVs的致病性研究 |
| 2.2.24 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RABV感染后Ifit表达水平 |
| 3.1.1 RNA-seq探索RABV感染后小鼠脑内Ifit转录水平 |
| 3.1.2 iTRAQ探索RABV感染后小鼠脑内Ifit蛋白表达水平 |
| 3.1.3 RABV感染小鼠体内Ifit家族表达水平检测 |
| 3.1.4 鼠源细胞系感染RABV后 Ifit家族表达水平 |
| 3.2 过表达Ifit1、Ifit2或Ifit3 的重组狂犬病病毒构建及其特性 |
| 3.2.1 过表达Ifit1、Ifit2或Ifit3 的重组狂犬病病毒构建 |
| 3.2.2 过表达Ifit1、Ifit2或Ifit3 重组狂犬病病毒的拯救与扩增 |
| 3.2.3 rRABVs的 WB和 IFA鉴定 |
| 3.2.4 rRABVs的病毒荧光斑特性 |
| 3.2.5 rRABVs的一步和多步生长曲线 |
| 3.3 rRABVs在小鼠体内的致病性研究 |
| 3.3.1 不同感染方式下rRABVs在小鼠体内的致病性 |
| 3.3.2 肌肉注射感染方式下重组病毒在小鼠组织的病毒载量分析 |
| 3.3.3 Ifit3 基因缺失对RABV在小鼠体内致病性影响 |
| 3.4 组合表达Ifit对 RABV增殖的影响 |
| 3.5 Ifit1、Ifit2和Ifit3 间相互作用 |
| 3.6 Ifit2和Ifit3对RABV RNA的识别探索 |
| 3.7 Ifit家族蛋白对细胞凋亡作用的探索 |
| 3.8 Ifit2和Ifit3 对其他病毒的抑制作用 |
| 4.讨论 |
| 4.1 RABV感染后Ifit家族蛋白表达水平 |
| 4.2 过表达Ifit家族蛋白不同成员对RABV的影响 |
| 4.2.1 过表达Ifit家族蛋白不同成员对RABV体外增殖的影响 |
| 4.2.2 过表达Ifit家族蛋白不同成员对RABV致病性的影响 |
| 4.3 关于鼠源Ifit2和Ifit3 协同抑制RABV的机制 |
| 4.3.1 鼠源Ifit2和Ifit3 间的相互作用与协同抑制RABV的关系 |
| 4.3.2 鼠源Ifit2和Ifit3与RABV蛋白的关系 |
| 4.3.3 鼠源Ifit2和Ifit3 与病毒RNA识别的关系 |
| 4.3.4 鼠源Ifit2和Ifit3 与细胞凋亡的关系 |
| 4.3.5 鼠源Ifit2和Ifit3在IFN信号转导中的作用 |
| 4.4 鼠源Ifit3b在 RABV感染中的作用 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 伪狂犬病病毒概述 |
| 1.2 病原学研究 |
| 1.2.1 分子结构 |
| 1.2.2 基因组特征 |
| 1.2.3 主要蛋白功能 |
| 1.2.4 遗传变异分析 |
| 1.3 诊断技术研究 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.4 新型疫苗研究 |
| 1.4.1 基因缺失疫苗 |
| 1.4.2 重组载体疫苗 |
| 1.4.3 亚单位疫苗 |
| 1.4.4 核酸疫苗 |
| 1.5 生物信息学研究 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 猪源PRV SD-2017 株的分离鉴定及其遗传变异分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.3.1 细胞培养 |
| 2.1.3.2 引物设计与合成 |
| 2.1.3.3 基因组DNA提取及目的基因扩增 |
| 2.1.3.4 病毒分离培养 |
| 2.1.3.5 病毒传代纯化 |
| 2.1.3.6 病毒形态观察 |
| 2.1.3.7 病毒滴度测定 |
| 2.1.3.8 动物感染试验(LD50 测定) |
| 2.1.3.9 主要毒力基因遗传变异分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 目的基因的扩增和克隆 |
| 2.2.2 病毒的分离培养及纯化 |
| 2.2.3 病毒的形态观察 |
| 2.2.4 PRV SD-2017 株病毒滴度的测定 |
| 2.2.5 PRV SD-2017 株家兔感染试验 |
| 2.2.6 PRV SD-2017 株遗传变异分析 |
| 2.2.6.1 gE基因的序列分析 |
| 2.2.6.2 gB基因的序列分析 |
| 2.2.6.3 gC基因的序列分析 |
| 2.2.6.4 gD基因的序列分析 |
| 2.2.6.5 TK基因的序列分析 |
| 2.2.6.6 gI基因的序列分析 |
| 2.2.6.7 gM基因的序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 PRV gB和 gE基因酶促重组等温扩增(ERA)检测方法的建立及应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试验方法 |
| 3.1.3.1 核酸提取 |
| 3.1.3.2 引物和探针设计 |
| 3.1.3.3 PRV gB和 gE基因标准质粒的构建及其鉴定 |
| 3.1.3.4 ERA反应体系的优化 |
| 3.1.3.5 特异性试验 |
| 3.1.3.6 敏感性试验 |
| 3.1.3.7 重复性试验 |
| 3.1.3.8 临床样本检测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PRV gB和 gE基因重组质粒的构建 |
| 3.2.2 ERA反应体系的建立 |
| 3.2.3 特异性试验 |
| 3.2.4 敏感性试验 |
| 3.2.5 重复性试验 |
| 3.2.6 临床样品的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 PRV SD-2017 基因缺失株的构建及其生物学特性分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.1.3.1 引物和质粒 |
| 4.1.3.2 gE/gI和 TK转移载体的构建 |
| 4.1.3.3 PRV2017 基因缺失株的构建和纯化 |
| 4.1.3.4 PRV一步生长曲线和噬斑大小测定 |
| 4.1.3.5 动物接种试验(LD50 测定) |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP的构建与纯化 |
| 4.2.2 rPRV SD-2017ΔgE/gI-EGFP报告基因的敲除 |
| 4.2.3 rPRV SD-2017ΔgE/gI/TK-EGFP的构建和纯化 |
| 4.2.4 rPRV一步生长曲线和噬斑大小测定 |
| 4.2.5 动物接种试验(LD50 测定) |
| 4.2.6 病理组织学观察 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 基于PRV SD-2017 株三种基因工程新型疫苗的构建及其免疫原性研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验仪器 |
| 5.1.3 试验方法 |
| 5.1.3.1 重组蛋白序列的优化与合成 |
| 5.1.3.2 重组杆状病毒穿梭质粒的构建与鉴定 |
| 5.1.3.3 重组杆状病毒的转染和蛋白表达纯化 |
| 5.1.3.4 家兔的疫苗接种和攻毒保护试验 |
| 5.1.3.5 血清PRV特异性抗体测定 |
| 5.1.3.6 血清PRV中和抗体测定 |
| 5.1.3.7 外周血淋巴细胞增殖测定 |
| 5.1.3.8 外周血细胞因子检测 |
| 5.1.3.9 剖检和病理病变观察 |
| 5.1.3.10 统计分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组杆状病毒穿梭质粒的构建与鉴定 |
| 5.2.2 重组蛋白PRV gB-DCpep和 PorB的表达和纯化 |
| 5.2.3 PRV疫苗体液免疫反应的测定 |
| 5.2.4 PRV疫苗细胞免疫反应的测定 |
| 5.2.5 PRV疫苗血清中和抗体滴度的测定 |
| 5.2.6 PRV疫苗的攻毒保护试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 PRV变异株基因缺失疫苗的构建 |
| 5.3.2 PRV变异株基因工程亚单位疫苗的构建 |
| 5.4 小结 |
| 6 PRV感染引起PK-15 细胞的转录组变化及差异表达基因分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 细胞及毒株 |
| 6.1.2 试剂与耗材 |
| 6.1.3 仪器设备 |
| 6.1.4 主要数据库、网站和软件 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 PRV感染PK-15 细胞 |
| 6.2.2 细胞总RNA的提取 |
| 6.2.3 RNA样本测序 |
| 6.2.3.1 样本检测 |
| 6.2.3.2 文库构建与质检 |
| 6.2.3.3 上机测序 |
| 6.2.4 RNA-Seq数据处理及分析 |
| 6.2.4.1 数据输出与质控 |
| 6.2.4.2 序列比对到参考基因组 |
| 6.2.4.3 新转录本预测 |
| 6.2.4.4 基因表达水平定量 |
| 6.2.4.5 基因表达差异分析 |
| 6.2.4.6 差异基因的GO功能富集及KEGG信号通路分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 PRV毒株感染PK-15 细胞的时间与剂量效应 |
| 6.3.2 RNA-seq测序样本检测结果 |
| 6.3.3 RNA-seq测序数据评估及质控 |
| 6.3.4 PRV感染PK-15 细胞差异表达基因分析 |
| 6.3.4.1 差异基因统计 |
| 6.3.4.2 差异表达基因可视化分析 |
| 6.3.4.3 差异表达基因叠加关系分析 |
| 6.3.4.4 差异表达基因聚类分析 |
| 6.3.5 PRV毒株感染PK-15 细胞差异表达基因富集分析 |
| 6.3.5.1 GO功能富集分析 |
| 6.3.5.2 KEGG通路富集分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 伪狂犬病病毒感染引起PK-15 细胞的蛋白质组学变化分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试剂与耗材 |
| 7.1.2 仪器设备 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 PRV感染PK-15 细胞 |
| 7.2.2 蛋白质组学分析的细胞样品制备 |
| 7.2.3 细胞总蛋白的提取 |
| 7.2.4 蛋白质检 |
| 7.2.5 TMT标记 |
| 7.2.6 馏分分离 |
| 7.2.7 液质检测 |
| 7.2.8 生物信息学分析 |
| 7.2.9 蛋白质组与转录组的关联性分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 提取蛋白质检结果 |
| 7.3.2 数据质控与蛋白鉴定结果 |
| 7.3.2.1 鉴定到的蛋白总体情况 |
| 7.3.2.2 肽段长度分布 |
| 7.3.2.3 母离子质量容差分布 |
| 7.3.2.4 Unique肽段数分布 |
| 7.3.2.5 蛋白覆盖度分布 |
| 7.3.2.6 蛋白分子量分布 |
| 7.3.2.7 蛋白重复性分析 |
| 7.3.3 蛋白差异分析结果 |
| 7.3.3.1 差异蛋白统计 |
| 7.3.3.2 差异蛋白可视化分析 |
| 7.3.4 差异蛋白GO功能注释分析 |
| 7.3.5 差异蛋白KEGG分析 |
| 7.3.6 差异蛋白亚细胞定位分析 |
| 7.3.7 转录组和蛋白组表达调控关联分析 |
| 7.3.8 转录组和蛋白质组表达量关联分析 |
| 7.3.9 转录组和蛋白质组GO功能富集关联分析 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 结论 |
| 9 创新点 |
| 10 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRAC T |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 细小病毒宿主互作蛋白研究进展 |
| 1.1 细小病毒概述 |
| 1.1.1 细小病毒分子生物学特征 |
| 1.1.2 细小病毒感染与复制机制 |
| 1.2 细小病毒宿主互作蛋白研究进展 |
| 1.2.1 STAT5 |
| 1.2.2 p53 |
| 1.2.3 细胞生长受体因子结合蛋白2 |
| 1.2.4 磷脂酰肌醇3-激酶样激酶家族蛋白 |
| 1.2.5 MCM家族蛋白 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪细小病毒VP2 和NS1 多克隆抗体的制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株、毒株和菌株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PPV增殖 |
| 2.2.2 PPV鉴定 |
| 2.2.3 PPV病毒粒子的纯化及鉴定 |
| 2.2.4 PPV滴度测定 |
| 2.2.5 重组质粒p ET-32a-ns1s的构建与鉴定 |
| 2.2.6 NS1S重组蛋白的原核表达及鉴定 |
| 2.2.7 NS1S重组蛋白的纯化效果鉴定 |
| 2.2.8 VP2 与NS1 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.9 VP2 与NS1 多克隆抗体效价检测 |
| 2.2.10 VP2 与NS1 多克隆抗体特异性检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PPV的增殖与鉴定 |
| 2.3.2 PPV病毒粒子纯化效果检测 |
| 2.3.3 PPV滴度测定 |
| 2.3.4 NS1 抗原表位预测 |
| 2.3.5 重组质粒p ET-32a-ns1s的构建与鉴定 |
| 2.3.6 NS1S重组蛋白的表达鉴定 |
| 2.3.7 NS1S重组蛋白最佳诱导表达条件的筛选 |
| 2.3.8 NS1S重组蛋白的纯化 |
| 2.3.9 VP2 与NS1 多克隆抗体的效价检测 |
| 2.3.10 VP2 与NS1 多克隆抗体的特异性检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪细小病毒感染对宿主细胞DNA和自身复制影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株和毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Real-time PCR检测PPV拷贝数 |
| 3.2.2 Real-time PCR检测PPV感染后细胞DN A复制水平的变化 |
| 3.2.3 Co-IP检测PPV感染后MCM3 与组蛋白H3 的互作 |
| 3.2.4 Ch IP检测PPV感染对MCM3 与细胞DNA复制起始位点结合的影响 |
| 3.2.5 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PPV感染PK-15 细胞后病毒拷贝数显着增加 |
| 3.3.2 PPV感染显着抑制PK-15 细胞DNA的复制 |
| 3.3.3 PPV感染显着降低MCM3 与组蛋白H3 的互作 |
| 3.3.4 PPV感染显着降低MCM3 与宿主细胞DNA复制起始位点的结合 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 猪细小病毒VP2 与宿主蛋白MCM3 对病毒复制的影响及机制研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞株、毒株和菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 westernblotting检测PPV感染对PK-15 细胞MCM3 表达及磷酸化的影响 |
| 4.2.2 筛选PPV感染过程中调控MCM3 磷酸化的病毒蛋白 |
| 4.2.3 Co-IP检测MCM3 磷酸化对VP2与MCM3 互作的影响 |
| 4.2.4 Co-IP检测MCM3 磷酸化对MCM3 与组蛋白H3 互作影响 |
| 4.2.5 MCM3 160 位点突变质粒pCI-Flag-mcm3~(T160A)的构建及鉴定 |
| 4.2.6 过表达MCM3及MCM3~(T160A)的PK-15 细胞系的构建和鉴定 |
| 4.2.7 过表达MCM3及MCM3~(T160A)的PK-15 细胞系的细胞活性检测 |
| 4.2.8 Real-time PCR检测病毒DNA拷贝数 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PPV感染显着降低PK-15 细胞MCM3 160 位苏氨酸的磷酸化 |
| 4.3.2 NS1 能够显着抑制MCM3 160 位苏氨酸的磷酸化 |
| 4.3.3 MCM3 磷酸化水平降低显着促进VP2与MCM3 的互作 |
| 4.3.4 MCM3 磷酸化水平降低显着抑制MCM3与组蛋白H3 的互作 |
| 4.3.5 MCM3 160 位苏氨酸位点突变质粒pCI-Flag-mcm3~(T160A)的构建及鉴定 |
| 4.3.6 过表达MCM3及MCM3T160A的 PK-15 细胞系的构建 |
| 4.3.7 MCM3 160 位苏氨酸突变能够促进PPV的复制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）宏基因二代测序技术在感染性疾病中应用的临床资料分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 二代测序技术的产生与发展 |
| 1.2 mNGS在病原体检测方面的应用 |
| 1.3 mNGS在感染性疾病中的应用 |
| 1.3.1 mNGS技术在中枢神经系统感染中的应用 |
| 1.3.2 mNGS技术在呼吸系统统感染中的应用 |
| 1.3.3 mNGS在血液系统感染中的应用 |
| 1.3.4 mNGS在其他系统感染中的应用 |
| 1.3.5 mNGS在特殊感染人群中的应用 |
| 1.3.6 mNGS在耐药基因和医院感染预防、新发传染病方面的应用 |
| 第二章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 检测流程 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.2.3 报告结果的解读 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 数据分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 患者的一般资料 |
| 3.2 mNGS在脑脊液标本中应用 |
| 3.3 mNGS在肺泡灌洗液标本中的应用 |
| 3.4 mNGS在痰标本中的应用 |
| 3.5 mNGS在血标本中的应用 |
| 3.6 通过mNGS观察病原体序列数的变化判断疾病进展与治疗效果 |
| 3.7 利用mNGS检测血浆中病原体的游离DNA明确肺部感染的致病菌 |
| 3.8 抗生素的使用对mNGS检出结果的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 宏基因二代测序技术在感染性疾病中的应用价值 |
| 参考文献 |
| 研究生期间取得的成果 |
| 致谢 |
（6）猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 伪狂犬病 |
| 1.1.1 伪狂犬病及其流行病学概述 |
| 1.1.2 PRV简述 |
| 1.1.3 PR诊断方法研究进展 |
| 1.2 化学发光免疫分析技术 |
| 1.2.1 化学发光免疫分析技术原理概述 |
| 1.2.2 化学发光免疫分析技术的分类及其应用 |
| 1.2.3 磁性微粒及其在化学发光免疫分析中的应用 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 PRV HLJ-2013 毒株的分离及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 组织病料 |
| 2.1.2 细胞及实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织病料的处理 |
| 2.2.2 病毒的培养及PCR鉴定 |
| 2.2.3 电镜观察 |
| 2.2.4 病毒全基因组的提取及测序 |
| 2.2.5 病毒全基因组序列及编码蛋白基因序列分析 |
| 2.2.6 PRV HLJ-2013 毒株的IFA鉴定 |
| 2.2.7 PRV HLJ-2013 毒株一步生长曲线的测定 |
| 2.2.8 PRV HLJ-2013 毒株的致病性实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病毒PCR鉴定及电镜观察 |
| 2.3.2 病毒全基因组序列及编码蛋白基因序列分析 |
| 2.3.3 PRV HLJ-2013 毒株的IFA鉴定及生长特性测定 |
| 2.3.4 PRV HLJ-2013 毒株的致病性实验 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立及初步应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及血清 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器及设备 |
| 3.1.4 主要溶液的配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验原理 |
| 3.2.2 PRV HLJ-2013 分离株病毒的培养与纯化 |
| 3.2.3 AP酶标记的兔抗猪IgG抗体的制备 |
| 3.2.4 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法相关实验条件的确定 |
| 3.2.5 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的评估及初步应用 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PRV HLJ-2013 毒株的纯化浓缩 |
| 3.3.2 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立 |
| 3.3.3 猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的评估及初步应用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 沙粒病毒的发现及分类 |
| 1.2 沙粒病毒的结构和编码的蛋白 |
| 1.2.1 沙粒病毒颗粒的结构 |
| 1.2.2 沙粒病毒基因组的结构 |
| 1.2.3 沙粒病毒的核蛋白NP |
| 1.2.4 沙粒病毒RNA依赖的RNA聚合酶L |
| 1.2.5 沙粒病毒的基质蛋白Z |
| 1.2.6 沙粒病毒的膜蛋白GPC |
| 1.3 沙粒病毒的生命周期 |
| 1.4 沙粒病毒流行病学及临床特征 |
| 1.5 沙粒病毒的动物模型 |
| 1.5.1 旧世界沙粒病毒的动物模型 |
| 1.5.2 新世界沙粒病毒的动物模型 |
| 1.6 沙粒病毒的药物和抗体研究进展 |
| 1.6.1 抑制沙粒病毒复制的药物研究进展 |
| 1.6.2 沙粒病毒进入抑制剂研究进展 |
| 1.6.3 多肽类药物的研究进展 |
| 1.6.4 沙粒病毒疫苗的研究进展 |
| 1.7 Ⅰ型单纯疱疹病毒简介 |
| 第二章 FDA批准的小分子药物库的抗病毒药物筛选 |
| 2.1 实验材料,实验仪器与实验方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 质粒的构建 |
| 2.1.4 LCMV及其重组病毒的拯救与扩增 |
| 2.1.5 VSV假病毒的包装 |
| 2.1.6 SARS-Co V-2 病毒的获得 |
| 2.1.7 免疫噬斑印记法检测LCMV的滴度 |
| 2.1.8 LCMV NP蛋白小鼠和家兔抗血清的制备 |
| 2.1.9 MTT法检测细胞活力 |
| 2.1.10 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR) |
| 2.1.11 病毒与宿主细胞的结合与内化 |
| 2.1.12 细胞膜融合模型 |
| 2.1.13 迷你基因组复制系统 |
| 2.1.14 LCMV出芽能力检测 |
| 2.1.15 Western blot印记法检测目的蛋白 |
| 2.1.16 动物实验 |
| 2.1.17 筛选药物适应性突变病毒 |
| 2.1.18 免疫荧光染色法(Immunofluorescence assay,IFA) |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 利用重组e GFP的 LCMV筛选FDA批准的小分子药物库 |
| 2.2.2 筛选得到的抗病毒药物的IC50、CC50和SI值 |
| 2.2.3 五种抗病毒药物的作用阶段 |
| 2.2.4 贝尼地平的抗病毒机制 |
| 2.2.5 具有耐药性的突变位点的发现 |
| 2.2.6 贝尼地平能够抑制LCMV在小鼠体内的复制 |
| 2.2.7 贝尼地平在沙粒病毒中具有广谱的抗病毒效果 |
| 2.2.8 其它二氢吡啶类药物抑制LCMV的作用与贝尼地平相似 |
| 2.2.9 霉酚酸、阿帕替尼、达拉菲尼和氯法齐明对新冠病毒的抑制作用 |
| 2.2.10 额外添加鸟嘌呤核苷中和霉酚酸的抗病毒作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 总结与展望 |
| 第三章 HSV-1 感染的HEK293T细胞定量蛋白质组学分析 |
| 3.1 实验材料,实验仪器与实验方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 质谱样品的SILAC标记 |
| 3.1.4 细胞核蛋白与胞浆蛋白的提取 |
| 3.1.5 蛋白的提取和消化 |
| 3.1.6 液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)分析 |
| 3.1.7 蛋白的鉴定与定量 |
| 3.1.8 GO聚类分析 |
| 3.1.9 siRNA转染细胞 |
| 3.1.10 病毒基因组DNA和宿主细胞基因表达的检测 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 HSV-1 感染HEK293T细胞的定量蛋白质组学分析的样品准备 |
| 3.2.2 质谱获得的定量蛋白质组数据的处理 |
| 3.2.3 WB和 qRT-PCR法验证MS分析得到的差异蛋白 |
| 3.2.4 通过GO分析鉴定被HSV-1感染影响的生命过程 |
| 3.2.5 IFITM3、CHCHD2 和TRIM27 对病毒复制的作用 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 疱疹病毒概述 |
| 1.1 疱疹病毒的分类 |
| 1.2 单纯疱疹病毒 |
| 2 溶瘤病毒研究进展 |
| 2.1 溶瘤病毒的种类 |
| 3 CRISPR/Cas9 系统概述 |
| 3.1 CRISPR/Cas9 系统的分子机制 |
| 3.2 CRISPR/Cas9 系统在HSV-1 病毒基因改造中的应用 |
| 4 研究的目的和意义 |
| 第一章 HSV-1 溶瘤病毒治疗小鼠恶性肿瘤 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 仪器耗材 |
| 1.2.1 主要仪器 |
| 1.2.2 材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 细胞转染 |
| 1.3.3 HSV-1 病毒的扩增与保存 |
| 1.3.4 HSV-1 对细胞增殖影响的曲线制备 |
| 1.3.5 HSV-1 对细胞存活影响的曲线制备 |
| 1.3.6 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因改造溶瘤病毒 |
| 1.3.7 图像分析和数据统计 |
| 1.4 结果 |
| 1.4.1 制备ICP34.5 缺失的HSV-1 溶瘤病毒 |
| 1.4.2 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠黑色素瘤的治疗效果 |
| 1.4.3 多种细胞系对HSV-1-ΔICP34.5 病毒的敏感性分析 |
| 1.4.4 HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.4.5 Nectin1 缺失抵抗HSV-1-ΔICP34.5 病毒对小鼠结肠癌的治疗 |
| 1.4.6 HSV-1-NEO2/15 溶瘤病毒制备 |
| 1.4.7 HSV-1-NEO-2/15 溶瘤病毒对小鼠结肠癌的治疗效果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 利用全基因组CRISPR-Cas9敲除文库进行HSV-1宿主依赖因子的筛选及富集 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 仪器耗材 |
| 2.2.1 主要仪器 |
| 2.2.2 材料 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 2.3.3 Western Blot验证敲除细胞株 |
| 2.3.4 细胞免疫荧光 |
| 2.3.5 慢病毒包装 |
| 2.3.6 细胞总RNA提取 |
| 2.3.7 cDNA的合成 |
| 2.3.8 cDNA的普通PCR反应 |
| 2.3.9 病毒结合实验 |
| 2.3.10 图像分析和数据统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 制备L929 全基因组细胞敲除文库 |
| 2.4.2 利用全基因组敲除库筛选抗HSV-1 的细胞 |
| 2.4.3 筛选后抗病毒细胞对HSV-1 病毒的敏感性分析 |
| 2.4.4 筛选过程中sg RNA以及其靶向基因的动力学变化 |
| 2.4.5 PANTHER GO富集度分析 |
| 2.4.6 富集HSV-1 病毒的宿主依赖因子 |
| 2.4.7 临床肿瘤患者体内HSV-1 病毒HDF的突变频率分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 HSV-1 宿主依赖因子候选基因的验证与分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 仪器耗材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9 系统构建基因敲除细胞 |
| 3.3.2 利用PANTHER网站分析基因功能 |
| 3.3.3 利用KEGG网站分析目的基因通路关系 |
| 3.3.4 图像分析和数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Nectin1和ENTPD1 基因缺失对病毒的抵抗 |
| 3.4.2 ENTPD1 基因是一个HSV-1 病毒新的宿主依赖因子 |
| 3.4.3 敲除ENTPD1对HSV-1 感染后病毒增殖的影响 |
| 3.4.4 ENTPD1 缺失抵抗HSV-1 感染不依赖I型干扰素通路 |
| 3.4.5 ENTPD1 缺失阻止HSV-1 病毒进入细胞,但不影响病毒和细胞膜结合 |
| 3.4.6 BGC-823 细胞缺失ENTPD1 基因抵抗HSV-1 感染 |
| 3.4.7 其他HSV-1 病毒HDF候选基因验证与分析 |
| 3.4.8 硫酸乙酰肝素合成途径对HSV-1 进入细胞至关重要 |
| 3.4.9 KEGG通路分析 |
| 3.4.10 确定硫酸乙酰肝素合成途径候选基因 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录 Ⅰ |
| 附录 Ⅱ |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）宏基因二代测序技术在诊断不明原因肺部感染中应用价值的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 伦理声明和知情同意 |
| 2.2 纳入研究的对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 标本采集 |
| 2.3.2 检测方法及试验步骤 |
| 2.3.3 数据分析 |
| 2.4 mNGS结果的解读以及阳性标准 |
| 2.5 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 患者的一般资料 |
| 3.3 mNGS与传统病原学检测结果的比较 |
| 3.4 mNGS与传统病原学检测矛盾结果的原因分析 |
| 3.5 治疗及转归 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（10）CV-A5小鼠主动免疫保护模型建立及候选疫苗体内效力评估（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 实验材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病毒,细胞 |
| 1.2 质粒,克隆测序用引物,菌株 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 实验试剂 |
| 3 常规实验试剂的配置方法 |
| 3.1 细菌培养相关试剂 |
| 3.2 SDS-PAGE及 WB相关试剂 |
| 3.3 核酸电泳相关试剂 |
| 3.4 IFA实验试剂 |
| 3.5 细胞,病毒培养相关试剂 |
| 4 实验仪器设备 |
| 5 实验方法 |
| 5.1 GST-VP1-ΔN56,GST-VP2-ΔN25,GST-VP3-ΔN8 多克隆抗体的制备 |
| 5.2 细胞培养 |
| 5.3 病毒传代 |
| 5.4 基于RD/Vero细胞基质的相关病毒滴定 |
| 5.5 CV-A5在昆明鼠体内适应性传代 |
| 5.6 基于Vero细胞基质CV-A5 疫苗候选株的筛选,构建,拯救及免疫原性研究 |
| 5.7 CV-A5疫苗候选株生物学特性和免疫原性研究 |
| 5.8 CV-A5主动免疫保护模型的建立 |
| 第二章 CV-A5-VP1、VP2、VP3、FP兔多克隆抗体的制备及应用 |
| 1 结果 |
| 1.1 构建pGEX-6p-1-VP1-ΔN56、pGEX-6p-1-VP2-ΔN119、pGEX-6p-1-VP3-ΔN8重组质粒 |
| 1.2 GST-VP1-ΔN56、GST-VP2-ΔN119、GST-VP3-ΔN8 重组融合蛋白可溶性分析 |
| 1.3 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗体效价测定 |
| 1.4 Rb-α-VP1、Rb-α-VP2、Rb-α-VP3、Rb-α-FP多克隆抗体的特异性分析 |
| 1.5 多克隆抗体免疫荧光鉴定 |
| 2 小结 |
| 第三章 CV-A5在小鼠体内进行适应性传代 |
| 1 结果 |
| 1.1 CV-A5-M14的筛选过程 |
| 1.2 CV-A5-M14感染14日龄昆明鼠最优的感染途径选择 |
| 1.3 CV-A5-M14 对昆明鼠和Balb/C鼠敏感性比较 |
| 1.4 CV-A5-M14 LD_(50) 测定 |
| 1.5 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 两克隆株毒力比较 |
| 1.6 CV-A5-M14-611,CV-A5-M14-111 全基因组序列分析 |
| 2 小结 |
| 第四章 CV-A5 疫苗候选株筛选,感染性c DNA的构建及病毒拯救 |
| 1 结果 |
| 1.1 PBR322-CV-A5-rN4,PBR322-CV-A5-rN20 重组质粒构建及线性化 |
| 1.2 体外转录vRNA |
| 1.3 病毒转染Vero细胞,及连续传代 |
| 1.4 CV-A5-N4-P3,CV-A5-N20-P3 病毒原毒株,拯救株病毒滴度比较 |
| 1.5 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 疫苗候选株生长曲线分析 |
| 1.6 CV-V5-vN4-P3,CV-A5-vN20-P3 全序列比较 |
| 2 小结 |
| 第五章 CV-A5 Vero细胞基质抗原纯化及免疫原性研究 |
| 1 实验结果 |
| 1.1 CsCl梯度离心纯化CV-A5 病毒颗粒 |
| 1.2 TEM,SDS-PAGE,WB鉴定病毒颗粒 |
| 1.3 CV-A5 抗原产量比较及EP、FP、DP比例计算 |
| 1.4 中和毒的滴度测定 |
| 1.5 中和毒的鉴定 |
| 1.6 CV-A5免疫原性实验 |
| 1.7 CV-A5-3487 株免疫血清与CV-A5 Swartz株,EV-71 的交叉中和反应 |
| 2 小结 |
| 第六章 主动免疫保护实验 |
| 1 结果 |
| 1.1 14日龄昆明鼠主动免疫保护实验存活率、临床评分和体重变化 |
| 1.2 RNA标准品制备 |
| 1.3 病毒载量的测定 |
| 1.4 主动免疫保护模型小鼠中和血清效价测定 |
| 1.5 组织病理切片分析 |
| 1.6 免疫组化切片分析 |
| 2 小结 |
| 第七章 总结,讨论与后续实验计划 |
| 1 总结和讨论 |
| 2 研究意义 |
| 3 下一步的工作计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
四、应用复合PCR鉴定1和5型疱疹病毒（论文参考文献）
- [1]大兴安岭全沟硬蜱携带哺乳动物腮腺炎病毒5型的分离鉴定[J]. 马云云,于志亚,刘家森,康洪涛,姜骞,杨鸣发,曲连东. 中国预防兽医学报, 2021
- [2]干扰素刺激基因Ifit家族在狂犬病病毒感染中的作用研究[D]. 柴本杰. 华中农业大学, 2021(02)
- [3]伪狂犬病病毒的基因工程疫苗构建及其感染PK-15细胞的转录组和蛋白质组学分析[D]. 张洪亮. 内蒙古农业大学, 2021
- [4]猪细小病毒VP2劫持宿主蛋白MCM3促进自身复制机制研究[D]. 邵婷. 西北农林科技大学, 2021
- [5]宏基因二代测序技术在感染性疾病中应用的临床资料分析[D]. 牛路. 兰州大学, 2021(12)
- [6]猪伪狂犬病抗体磁微粒化学发光检测方法的建立及初步应用[D]. 朱冰. 中国农业科学院, 2020(01)
- [7]抗沙粒病毒小分子药物的高通量筛选及Ⅰ型疱疹病毒感染细胞的蛋白质组学研究[D]. 万伟玮. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [8]HSV-1溶瘤病毒用于肿瘤精准治疗及肿瘤耐受机制的研究[D]. 沈阳坤. 福建师范大学, 2020(12)
- [9]宏基因二代测序技术在诊断不明原因肺部感染中应用价值的研究[D]. 李思云. 南昌大学, 2020(08)
- [10]CV-A5小鼠主动免疫保护模型建立及候选疫苗体内效力评估[D]. 靳卫平. 武汉生物制品研究所, 2020(01)