一、白血病患者血清肿瘤特异性生长因子水平及其与治疗效果的关系（论文文献综述）
李小丰[1]（2021）在《PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究》文中进行了进一步梳理背景:目前,肺恶性肿瘤仍是威胁人类健康的最大敌人之一,中国癌症发病和死亡统计显示,2015年我国肺癌的新发病例数为78.7万,死亡人数为63.1万,均列癌症首位。根据临床和病理特点的不同,肺癌分为小细胞肺癌（占13%）和非小细胞肺癌（占87%）,其5年总生存率仅为18.2%。传统的治疗方法包括手术、化疗、放疗等,但对于晚期肺癌患者均疗效不佳。近年来,随着分子靶向治疗的兴起,非小细胞肺癌的无进展生存期和总生存期都得到了显着改善。具有敏感基因突变的肺癌患者,分子靶向治疗是最有效的治疗方式之一,而对于没有敏感突变或在靶向治疗过程中发生靶基因耐药突变的患者而言,发现新的肿瘤生物学标志物和新的治疗靶点显得尤为重要。鱼精蛋白-1（PRM1）是肿瘤-睾丸抗原（CTA）的一种,CTA在正常情况下只在睾丸组织中表达,而其它组织不表达或极低表达,但当机体出现肿瘤时则可以在某些肿瘤组织中高表达,肿瘤-睾丸抗原也因此得名。既往对于PRM1的研究主要集中在男性生殖领域。近年来,随着CTA在肿瘤领域研究的深入,关于PRM1在恶性肿瘤中的作用也逐渐被重视,研究发现PRM1是结肠癌相关的肿瘤-睾丸抗原基因,利用RT-PCR技术分析PRM1在结肠癌和癌旁组织的表达水平,发现肠癌组织中PRM1-m RNA水平明显高于癌旁和正常组织。也有研究发现PRM1在慢性淋巴细胞白血病患者中高表达,PRM1也被认为是慢性淋巴性白血病的CTA基因。另有研究表明,PRM1在恶性肿瘤中的异常表达,可能与肿瘤的生长侵袭相关。在动物实验中,给裸鼠皮下注射PRM1蛋白可明显提高小鼠肠道肿瘤的发生率。目前为止,尚无关于PRM1在非小细胞肺癌中表达情况的报道,课题组的前期工作已证实,与正常组织比较,PRM1在非小细胞肺癌组织中的表达明显升高。同时,PRM1对非小细胞肺癌细胞具有促进增殖作用。本研究中,我们检测了PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达情况,分析了PRM1蛋白水平与临床特征的相关性;并评估了PRM1在非小细胞肺癌中的诊断价值;通过过表达和敲低PRM1基因观察其对细胞增殖、凋亡及周期的影响;建立非小细胞肺癌裸鼠转移瘤模型,检测转移瘤裸鼠外周血PRM1蛋白的表达水平,观察外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。旨在评估PRM1作为新的生物学标志物对非小细胞肺癌的诊断价值,研究PRM1对非小细胞肺癌细胞的促增殖作用,并对其机制作初步探讨。方法:1、收集110例非小细胞肺癌肿瘤组织、配对正常组织、术前血清和健康者血清标本,应用RT-PCR法、免疫组织化学染色法和ELISA法检测其中PRM1基因和蛋白水平,应用卡方检验统计分析患者肿瘤组织和外周血中PRM1蛋白水平与临床特点的相关性。2、评估PRM1的诊断价值,应用SPSS软件统计分析外周血中PRM1蛋白水平对非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌的诊断价值,并与临床常用的肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1进行比较,评估PRM1诊断价值的优劣性。3、观察细胞内PRM1表达水平对细胞增殖的影响,通过质粒构建技术及si RNA转染技术,过表达和敲低A549、NCI-H460细胞的PRM1基因,应用RTPCR和ELISA法检测细胞PRM1基因和蛋白表达水平,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况,应用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。4、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对细胞增殖的影响,将人源重组PRM1蛋白和PRM1抗体加入到A549、NCI-H460细胞培养液中,应用CCK8法和Ed U法检测细胞增殖情况。5、观察细胞在不同营养状态下PRM1的表达情况,将A549、NCI-H460细胞培养于含不同浓度血清的培养液中,应用RT-PCR法和ELISA法检测细胞的PRM1基因及蛋白水平。6、观察外源性PRM1重组蛋白和抗体对动物转移瘤生长的影响,制备裸鼠转移瘤模型,将非小细胞肺癌细胞A549皮下注射到裸鼠背部偏右侧,肿瘤形成后,（1）应用ELISA法检测转移瘤裸鼠和健康裸鼠外周血PRM1蛋白水平,并分析其差异性;（2）分别经尾静脉注射人源重组PRM1蛋白、PRM1抗体及两者混合剂,每3日测量并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。（3）第33天于麻醉下处死裸鼠,取出肿瘤组织,测量重量并计算肿瘤体积,分析外源性PRM1重组蛋白和PRM1抗体对裸鼠转移瘤生长的影响。结果:1、非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1的m RNA和蛋白水平较配对正常组织明显升高。统计分析显示:随着肿瘤组织中PRM1蛋白水平的增加,肿瘤T分期越晚,淋巴结转移阳性率越高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润无相关性;2、非小细胞肺癌患者外周血中PRM1蛋白水平较健康者显着升高。统计分析显示,淋巴结转移阳性和临床分期较晚的患者外周血中的PRM1蛋白水平更高,而与病理类型、年龄、性别、脉管及神经浸润不相关。3、PPM1对于非小细胞具有较高的诊断价值。SPSS软件统计分析显示:（1）外周血中PRM1蛋白水平在非小细胞肺癌及其亚组肺腺癌、肺鳞癌中均具有较高的诊断价值。（2）在肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在肺鳞癌中,PRM1的诊断价值明显强于SCC且与CYFRA21-1相当;（3）含有PRM1的肿瘤标志物组合的诊断价值明显高于传统组合;（4）在早期的肺腺癌中,PRM1的诊断价值高于CEA;在早期肺鳞癌中,PRM1诊断价值高于SCC且不劣于CYFRA21-1。提示PRM1具有较高的非小细胞肺癌诊断价值。4、非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的PRM1 m RNA水平较人正常肺上皮细胞株BEAS-2B明显升高;同样,A549、NCI-H460细胞内和培养液中的PRM1蛋白水平较BEAS-2B细胞均显着升高。5、成功构建PRM1过表达和敲低的A549、NCI-H460细胞株模型,与对照组比较,过表达PRM1促进A549和NCI-H460细胞的增殖,而敲低PRM1则抑制细胞的增殖。6、外源性PRM1重组蛋白能够促进非小细胞肺癌A549和NCI-H460细胞的增殖,而PRM1抗体则抑制细胞增殖。7、不同营养状态下PRM1的表达存在差异。实验结果显示,随着细胞培养液中血清浓度的降低,A549和NCI-H460细胞PRM1表达水平显着增加。8、细胞周期检测结果提示,过表达PRM1使细胞周期中G0/G1期比例降低,S期细胞比例增加,肿瘤细胞增殖活跃;而敲低PRM1则使细胞周期发生G0-G1期阻滞,S期细胞比例降低,肿瘤细胞增殖受抑;细胞凋亡结果显示,敲低PRM1对A549和NCI-H460细胞的凋亡水平无显着影响。9、动物实验结果:（1）与健康对照组比较,转移瘤裸鼠外周血中PRM1蛋白水平明显升高,也证实了动物实验和体外细胞实验结果与人体组织实验结果一致。（2）外源性PRM1重组蛋白具有促进裸鼠转移瘤生长的作用,而PRM1抗体则抑制转移瘤生长。实验结果提示,与对照组比较,经尾静脉给予外源性PRM1重组蛋白的裸鼠肿瘤生长速度快,肿瘤体积大,而给予PRM1抗体的裸鼠肿瘤生长速度较慢,且肿瘤体积较小。结论:1、PRM1在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的特异性高表达,及其对非小细胞肺癌特别是早期患者的诊断价值,使其具备了成为非小细胞肺癌血清学肿瘤标志物的潜质。2、过表达和敲低PRM1基因双向验证了其对非小细胞肺癌细胞株A549和NCI-H460的促增殖作用,这种作用与增加细胞周期中S期细胞比例相关,而非抑制细胞的凋亡。3、细胞内外PRM1蛋白水平的增加均可促进细胞的增殖,提示PRM1促增殖作用可能存在多条途径,为进一步研究PRM1的作用机制提供线索。4、营养供应差时细胞PRM1的表达水平反而增加,这种负反馈调节作用在一定程度上解释非小细胞肺癌在血供不良的情况下仍快速生长的原因。5、外源性PRM1重组蛋白和抗体对裸鼠转移瘤生长的影响,进一步在生物体内验证了PRM1促进肿瘤生长的作用,同时,PRM1抗体的抑瘤作用也为其成为肿瘤治疗靶点提供直接的理论支持。
彭颖[2]（2021）在《Thomsen-Friedenreich单克隆抗体（A78-G/A7）在甲状腺乳头状癌中的作用靶点研究》文中提出[目的]在课题组前期研究发现Thomsen-Friedenreich抗原（TF-Ag）在甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Carcinoma,PTC）中呈现高表达的基础上,探索Thomsen-Friedenreich抗体（TF-Ab）对PTC的作用靶点,为进一步探索TF-Ab在PTC治疗效应中的机制和研发PTC靶向治疗药物提供理论依据和实验基础。[方法]（1）Thomsen-Friedenreich单克隆抗体（mAb A78-G/A7）在甲状腺癌细胞株中的潜在作用探索:利用免疫荧光法检测筛选出TF-Ag阳性表达率较高的甲状腺癌细胞株,以500μg/μl原浓度的mAb A78-G/A7按照梯度浓度（1/10,1/20,1/40,1/60,1/80）干预BCPAP、8305C细胞后进行黏附实验筛选出mAb A78-G/A7治疗BCPAP、8305C细胞的最低有效使用浓度,以mAb A78-G/A7最低有效使用浓度干预BCPAP、8305C细胞后使用CCK8试剂盒检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡、Transwell实验检测细胞侵袭及细胞迁移,观察mAb A78-G/A7干预对BCPAP、8305C细胞株是否存在抑癌效应。（2）Thomsen-Friedenreich单克隆抗体（mAb A78-G/A7）在裸鼠PTC异种移植瘤中的治疗作用研究:收集PTC患者新鲜肿瘤组织样本,构建裸鼠PTC异种移植瘤模型。将来源于同一患者的肿瘤组织移植到不同的裸鼠上,对比分析移植瘤的生长特性、血液供应情况、苏木素-伊红染色（Hematoxylin-Eosin Staining,HE染色）及TF-Ag表达情况,评价来源于同一患者肿瘤组织构建成的不同移植瘤之间进行对照研究的可靠性;进一步将来源于同一患者肿瘤组织构建形成的不同裸鼠PTC异种移植瘤随机纳入Ctrl组（每周两次瘤体多点原位注射0.9%生理盐水）、0.5μg/μl治疗组（每周两次瘤体多点原位注射0.5μg/μl mAb A78-G/A7）及2.5μg/μl治疗组（每周两次瘤体多点原位注射2.5μg/μl mAb A78-G/A7）,各组组内又进一步划分为治疗1周组及治疗2周组,每次注射前均对瘤体进行拍照、测量及记录,观察mAb A78-G/A7干预对裸鼠PTC异种移植瘤的治疗效应。（3）抗TF-Ag单克隆抗体（mAb A78-G/A7）治疗对PTC差异表达基因影响的研究:通过RT2 Profiler PCR Arrays检测手段筛选出PTC肿瘤组织较癌旁组织的差异表达基因（N=2）,采集更多组织样本QRT-PCR验证及筛选得出PTC肿瘤组织较癌旁组织稳定差异表达的基因（N=6）,生物信息学技术挖掘TCGA数据库分析PTC肿瘤组织较癌旁组织的差异表达基因,取QRT-PCR验证筛选出的稳定差异表达基因和生物信息学技术筛选出的稳定差异表达基因之间的交集,视为PTC的差异表达基因;基于Illumina测序平台分析mAb A78-G/A7干预对PTC细胞真核转录组的影响,将测序结果与PTC差异表达基因进行比较,筛选出mAb A78-G/A7治疗PTC可能的基因靶点;进一步通过QRT-PCR、Western-Blotting和免疫组化技术验证mAb A78-G/A7治疗PTC可能的基因靶点。（4）临床样本探讨分析PTC患者TF-Ag及天然TF-Ab表达特征,探索TF-Ab中和TF-Ag、发挥潜在抑癌作用的证据:采用免疫荧光检测分析临床PTC患者肿瘤组织样本中TF-Ag表达情况,并对TF-Ag表达情况和患者病例样本特征（多灶、淋巴结转移、病理长径、TSH及Tg表达水平）进行相关性分析;采用ELISA检测对应血清样本中天然TF-Ab表达特征,并将TF-Ag与TF-Ab进行相关性分析,探索TF-Ab可中和TF-Ag的证据;将天然TF-Ab表达特征与部分预后相关临床指标及PTC差异表达基因作相关性分析,挖掘天然TF-Ab表达特征在PTC早期无创筛查及判断预后方面存在的潜在价值并为TF-Ab在PTC中的抑癌作用提供证据。[结果]（1）Thomsen-Friedenreich单克隆抗体（mAb A78-G/A7）在甲状腺癌细胞株中的潜在作用探索:BCPAP作为TF-Ag表达阳性率相对较高（79.460+2.033）的PTC细胞株被选做实验细胞株,8305C作为TF-Ag表达阳性率相对较高（30.880±0.699）的ATC细胞株被作为辅助对照细胞株以观察TF-Ab在不同病理亚型TC细胞株上的治疗效应。经mAb A78-G/A7处理后,TC细胞株黏附指数较Control组显着下降,且细胞株黏附指数随抗体浓度增加而降低,以1/10（BCPAP:0.411± 0.008;8305C:0.635± 0.065）及1/20（BCPAP:0.407±0.022;8305C:0.735±0.007）抗体浓度的抑制效果最为显着,我们选用了1/20的抗体浓度;免疫荧光验证1/20的mAb A78-G/A7浓度中和TF-Ag的效率显示,经1/20 mAb A78-G/A7处理后,BCPAP及8305C的TF-Ag表达较Control组显着下降（BCPAP:8.444± 0.175 vs.13.860± 0.292,8305C:3.156± 0.319 vs.11.290 ±,P<0.05）,提示1/20的mAb A78-G/A7浓度可有效中和TF-Ag的表达;CCK8试剂盒检测结果显示,经mAb A78-G/A7处理后,8305C的细胞增殖指数较Control组显着下降（0.569±0.018 vs.0.7987±0.029,P<0.05）,而 mAb A78-G/A7 处理的BCPAP细胞增殖指数则较Control组无显着改变（0.357±0.009 vs.0.382± 0.019）;细胞周期检测结果显示,经mAb A78-G/A7处理后,BCPAP及8305C的G1静止期细胞均较Control组显着增加（BCPAP:48.300±1.193 vs.42.056±1.156,8305C:22.377±1.159 vs.10.473±0.866,P<0.05）;细胞凋亡检测结果显示,经 mAb A78-G/A7处理后,8305C的细胞凋亡率较Control组显着增加（62.910± 2.311 vs.42.270±2.284,P<0.05）,而 mAb A78-G/A7 处理的 BCPAP 细胞凋亡率则较 Control组无显着改变（27.090±0.584 vs.24.650±0.879）;Transwell 检测结果显示,经 mAb A78-G/A7 处理后,BCPAP 及 8305C 的侵袭细胞数（90.000±1.528,23.670±3.712）及迁移细胞数（73.670 ± 4.667,16.670±2.404）均较 Control 组（侵袭:147.700±4.910,85.670±3.528;迁移:176.300±5.812,47.330±1.764）显着下降（P<0.05）。（2）Thomsen-Friedenreich单克隆抗体（mAb A78-G/A7）在裸鼠PTC异种移植瘤中的治疗作用研究:对比分析来源于同一患者的肿瘤组织所构建成得不同移植瘤的生长特性、血液供应情况、HE染色及TF-Ag表达情况并无显着差异,可进一步进行对照研究;进一步进行mAb A78-G/A7干预的结果表明mAb A78-G/A7治疗组移植瘤瘤体均较Ctrl组瘤体消退迅速,治疗2周组较治疗1周组消退更明显,随着时间的推移2.5μg/μl治疗组较0.5μg/μl治疗组消退呈现更显着趋势,但暂无统计学意义。免疫荧光检测发现2.5μg/μl治疗组和0.5μg/μl治疗组肿瘤组织TF-Ag表达均较Ctrl组显着下降（P<0.05）,治疗2周组较治疗1周组而言下降更明显（0.5μg/μl 治疗组:0.013±0.004 vs.0.055±0.005,2.5 μg/μl治疗组:0.001±0.000 vs.0.040±0.004,P<0.05）,而治疗组内比较发现2.5μg/μl治疗组与0.5μg/μl治疗组之间也存在显着差异（P<0.05）。（3）抗TF-Ag单克隆抗体（mAb A78-G/A7）治疗对PTC差异表达基因影响的研究:采用RT2 Profiler PCR Arrays手段结合生物信息学技术挖掘TCGA数据库筛选出9个可能性较大的PTC差异基因;基于测序结果显示,与未做特殊处理的PTC细胞相比,mAb A78-G/A7处理后的PTC细胞呈现了较多差异表达的mRNA,但与上述9个可能性较大的PTC差异基因比对发现mAb A78-G/A7干预后仅有DDIT3、DDB2、E2F4三个基因呈现存在统计学意义的改变;QRT-PCR、Western blotting及免疫组化检测进一步检测体内外实验样本证实mAb A78-G/A7干预确实可以有效影响PTC差异表达基因DDIT3、DDB2、E2F4的表达。（4）临床样本探讨分析PTC患者TF-Ag及天然TF-Ab表达特征,探索TF-Ab中和TF-Ag、发挥潜在抑癌作用的证据:采集PTC患者临床肿瘤组织免疫荧光检测分析发现PTC肿瘤组织中均表达TF-Ag且发生淋巴结转移患者的TF-Ag表达量较无淋巴结转移患者的更高;采集患者对应临床血清样本ELISA检测分析发现,相较于健康人群而言,PTC患者天然TF-Ab表达特征较健康人群存在显着差异且IgG亚型血清浓度与对应肿瘤组织中的TF-Ag表达量呈显着负相关,为TF-Ab可中和TF-Ag提供了一定证据;此外,天然TF-Ab表达特征与患者部分临床病例特征存在显着相关性,在PTC的早期无创筛查及判断预后方面存在一定的潜在价值;更重要的是,PTC患者血清天然TF-Ab IgG亚型血清浓度与PTC差异表达基因DDIT3、DDB2、E2F4呈显着正相关,进一步证实了 TF-Ab治疗在PTC中可能存在的分子作用机制。[结论]mAb A78-G/A7对PTC细胞株及裸鼠移植瘤存在显着抑癌效应;mAb A78-G/A7干预可对PTC差异表达基因DDIT3、DDB2、E2F4产生显着影响;PTC患者的天然TF-Ab IgG血清浓度与TF-Ag呈显着负相关,为TF-Ab的中和TF-Ag作用提供了证据;天然TF-Ab亚型抗体表达特征分析在初发PTC患者的早期无创筛查及判断预后方面存在一定的潜在价值;天然TF-Ab IgG亚型血清浓度与PTC差异基因DDIT3、DDB2、E2F4存在显着正相关,进一步证实了TF-Ab治疗在PTC中可能存在的分子作用机制。
张彦收[3]（2021）在《LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响》文中进行了进一步梳理乳腺癌是威胁女性健康最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年上升。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的2020年全球最新癌症数据显示,乳腺癌新发病例高达226万例,并已超过肺癌成为全球第一大癌症。在我国,女性恶性肿瘤发病首位同样为乳腺癌,每年发病人数约为30.4万。因此,对于乳腺癌预防、诊断和治疗的研究是目前医学领域工作的重点。当前,随着乳腺癌治疗模式的进步和新型药物的不断涌现,乳腺癌的治疗效果已取得了巨大突破。然而,乳腺癌耐药后出现的复发、转移仍然是困扰临床的难题之一。因此,研究乳腺癌的增殖、侵袭、转移机制,探寻新的治疗途径和靶点对提高乳腺癌的生存率至关重要。富亮氨酸α2糖蛋白1（leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1,LRG1）是富亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat,LRR）家族蛋白成员,也是最早被发现的含有LRR结构的蛋白。人LRG1基因定位于染色体19p13.3,含有2810个碱基对,包括2个外显子和1个内含子。第一个外显子含43个碱基对,第二个外显子含1737个碱基对,共编码347个氨基酸残基。前35个氨基酸残基为信号肽,312个氨基酸残基构成单个肽链。因其定位的染色体区域同时存在数个编码中性粒细胞颗粒酶的基因,并且LRG1在人类MPD和HL-60细胞嗜中性分化过程中上调,而在HL-60细胞单核细胞分化过程中下调,早期研究认为LRG1可能是中性粒细胞早期分化的一种标志物。随着分子生物学技术的不断发展,LRG1的其它功能逐渐被发现:LRG1不仅参与细胞蛋白间的相互作用,同时在细胞信号转导、细胞黏附及发育过程中也发挥着重要作用。近些年研究显示LRG1在人类多种恶性肿瘤组织、血液、脑脊液、外泌体中异常表达,并且可以作为部分肿瘤早期诊断和预后判断的生物标记物。当前研究发现,LRG1在肿瘤的发生、发展、侵袭转移、上皮间质转化和异常血管生成过程中扮演重要角色,因此,LRG1在抗肿瘤治疗领域发挥的作用逐渐被大家重视。然而,LRG1在不同肿瘤中的表达存在明显差异,提示LRG1在不同肿瘤的发生、发展中可能发挥不同作用。如外泌体中LRG1与非小细胞肺癌发生发展有关;肝癌组织中LRG1表达较正常组织下调,体外实验显示LRG1对肝癌细胞增殖没有影响;卵巢癌患者血清和肿瘤组织中LRG1表达升高程度与肿瘤分期相关。LRG1在不同肿瘤中所发挥的作用正在积极探索之中。越来越多研究提示LRG1是抗肿瘤治疗的潜在靶点。但是,LRG1在乳腺浸润性癌中的表达、临床意义及作用机制有待进一步研究。本研究分三部分对LRG1在乳腺浸润性癌中的表达及临床意义进行了研究:第一部分:通过生物信息学方法分析不同肿瘤中LRG1mRNA及蛋白的表达情况,探索其与临床病理指标及预后的关系。第二部分:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测了330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达,进一步分析LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床病理指标及预后的相关性。第三部分:应用逆转录-多聚酶链式反应（RT-PCR）技术、Western-blot技术检测不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况。采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达,通过CCK-8实验检测细胞增殖能力;划痕实验检测转染后细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。探讨LRG1对乳腺癌细胞生物学行为的影响。第一部分LRG1在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析目的:通过生物信息学方法分析LRG1在不同肿瘤中的表达及其临床意义。方法:基于人类癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库（http://www.tcga.org/）中肿瘤组织及正常组织中RNA-seq的测序结果,使用TIMER2.0在线工具（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）分析LRG1mRNA在肿瘤组织与正常组织中的表达情况。从人类蛋白质图谱图像（the human protein atlas）数据库中（https://www.proteinatlas.org）中获取LRG1蛋白在不同肿瘤组织和正常组织中表达的情况。基于Kaplan-Meier plotter数据库（http://kmplot.com/analysis）中患者的临床特征、生存资料,分析不同肿瘤中LRG1mRNA的表达与总生存期（overall survival,OS）和无复发生存期（recurrence free survival,RFS）之间的关系,并绘制Kaplan-Meier曲线。结果:1.LRG1mRNA在乳腺浸润癌（breast invasive carcinoma,BRCA）（1097例）、肾透明细胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）（533例）、肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）（515例）、子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC）（545例）、甲状腺癌（thyroid carcinoma,THCA）（501例）中的表达量显着高于相对应的癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.分析The Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org）数据库中LRG1蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC、THCA组织中的表达情况,结果显示LRG1蛋白在此五种癌组织中表达水平显着高于癌旁正常组织。3.分析LRG1mRNA在BRCA不同亚型中表达情况。566例Luminal型乳腺癌中LRG1表达量为37.462（9.930-74.197）,高于HER-2阳性型和三阴性乳腺癌（P<0.01）。根据淋巴结转移情况进一步分析显示,1646例淋巴结阳性患者组LRG1mRNA表达量高于2415例淋巴结阴性组,差异具有统计学意义（P<0.0001）。17例粘液腺癌中LRG1mRNA的表达量明显低于其它浸润性癌（浸润性导管癌、浸润性小叶癌及混合型癌）,差异具有统计学意义（P<0.0001）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中生存数据,LRG1mRNA的表达与Luminal A型、Luminal B型、HER-2阳性型乳腺癌的OS无明显关系（均P>0.05）,但在Basal-like亚型中,LRG1的表达与OS显着相关,LRG1表达低的乳腺癌患者OS较好（HR=3.12,95%CI=1.54-6.29,P<0.001）。4.在KIRC中,随着临床分期的升高,LRG1mRNA的表达呈上升趋势。Ⅳ期患者LRG1的表达量显着高于Ⅰ、Ⅱ期患者,差异具有显着性（P<0.01）。在不同组织学分级中,呈现同样趋势,组织学分化3级患者组LRG1表达量显着高于1、2级（P<0.01）。利用Kaplan-Meier plotter在线工具,分析TCGA数据库中530例KIRC患者的OS及RFS数据并绘制生存曲线,结果显示367例LRG1高表达组患者OS低于163例低表达组,LRG1mRNA的表达与OS显着相关（HR=1.71,95%CI=1.18-2.47,P=0.0042）。LRG1mRNA的表达与RFS关系与OS一致,LRG1高表达组患者RFS低于低表达组（HR=3.57,95%CI=1.26-9.87,P=0.0089）。在肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP）数据中,同样发现LRG1mRNA表达水平可以预测患者OS及RFS,高表达组患者OS及RFS均差于低表达组,差异具有显着性（OS:HR=2.19,95%CI=1.2-4.01,P=0.0091;RFS:HR=5.32,95%CI=1.2-22.54,P=0.011）。5.LUAD组织中LRG1mRNA的表达量显着高于正常组织。在正常肺组织中,LRG1mRNA中位表达量为25.277（20.394-30.683）,在LUAD组织中表达量为35.431（20.538-53.567）,差异具有统计学意义（P<0.001）。分析503例肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma,LUSC）和52例正常组织的数据,发现LRG1mRNA在正常组织中表达水平显着高于LUSC（26.701 vs 11.612,P<0.001）。LRG1mRNA在LUAD和LUSC中的表达存在明显差异。在LUAD组,222例LRG1高表达组患者OS低于282例低表达组,LRG1mRNA表达与OS显着相关（HR=1.34,95%CI=1-1.8,P=0.045）。6.LRG1mRNA在UCEC组织中表达量为24.37（10.368-48.392）,高于正常子宫内膜组织表达（10.072,2.357-14.296）,差异具有显着性（P<0.001）,LRG1mRNA在UCEC中呈现高表达,但与年龄、临床分期、月经状态及预后无显着相关性。7.LRG1mRNA在THCA中的表达量随着淋巴结转移个数的增多而升高,具有统计学意义（P=0.027）,在预后方面,261例LRG1高表达组患者OS优于241例低表达组,且具有显着性差异（HR=0.11,95%CI=0.02-0.48,P=0.00035）。结论:1.LRG1mRNA及蛋白在BRCA、KIRC、LUAD、UCEC及THCA中表达显着上调,LRG1可能在肿瘤发生发展过程中发挥重要促进作用。2.Luminal型乳腺癌中LRG1mRNA表达量高于HER-2阳性型和三阴性,LRG1与Basal-like亚型乳腺癌的OS呈负相关。3.KIRC中LRG1mRNA的表达可以预测OS及RFS,LRG1表达与OS、RFS呈负相关。4.LRG1mRNA在LUAD中表达上调,LRG1高表达提示患者OS较差。5.LRG1mRNA在UCEC中表达上调,但与临床特征及预后无显着相关性。6.LRG1mRNA在THCA中表达与淋巴结转移个数呈正相关,与OS呈显着正相关。第二部分乳腺癌组织中LRG1蛋白表达与临床特征及生存预后的关系目的:探讨乳腺癌组织LRG1蛋白的表达与乳腺癌临床特征及生存预后的关系。方法:通过免疫组化Max Vision TM一步法检测330例原发性乳腺癌组织中LRG1蛋白的表达情况,探讨LRG1与乳腺癌患者年龄、月经、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移状况、组织学分级、分子亚型及生存预后的相关性。结果:1.LRG1蛋白在原发性乳腺癌中表达情况。在330例原发性乳腺癌患者中,58.48%（193例）患者LRG1呈阳性表达。LRG1着色部位主要位于细胞质,阳性信号表现为褐色颗粒状外观。2.LRG1蛋白的表达与临床病理指标的关系。0-3个淋巴结转移组LRG1阳性表达128例,阴性表达121例,阳性表达率51.41%;3个以上淋巴结转移组LRG1阳性表达65例,阴性表达16例,阳性表达率80.25%,两组间LRG1阳性表达率存在显着性差异（χ2=20.939,P<0.001）。LRG1的表达与淋巴结转移负荷呈正相关,随着淋巴结转移数量的增多,LRG1的阳性表达率升高。Ⅰ-Ⅱ期患者组LRG1阳性表达124例,阴性表达125例,阳性表达率62.96%;Ⅲ期组LRG1阳性表达69例,阴性表达12例,阳性表达率85.19%。两组间LRG1阳性表达率的差异有统计学意义（χ2=31.520,P<0.001）。LRG1的表达与肿瘤负荷呈正相关,随着疾病的进展,LRG1的阳性表达率升高。3.LRG1蛋白的表达与乳腺癌DFS（disease-free survival,DFS）、OS的关系。330例患者中位随访时间72个月,92例患者出现局部复发或远处转移,80例患者死亡。LRG1阳性表达组72个月的DFS为61.14%（118/193）,阴性表达组DFS为87.59%（120/137）,两组间DFS存在显着差异（χ2=27.123,P<0.001）。72个月OS与DFS结果相似,共出现80例死亡事件,总体人群72个月OS为75.76%。LRG1阳性表达组72个月的OS为66.32%（128/193）;LRG1阴性组为89.05%（122/137）,两组间差异有显着性（χ2=22.864,P<0.001）。4.影响DFS及OS的COX回归模型多因素分析COX多因素分析显示LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌患者DFS和OS的独立危险因素（P<0.05）。肿瘤大小、组织学分级、年龄、月经状态与DFS、OS无显着相关性（P>0.05）。LRG1表达、TNM病理分期和分子亚型对DFS的风险比分别为2.090、3.214和1.796;对于OS的风险比分别是2.112、2.628和1.755。结论:1.乳腺癌LRG1蛋白的表达与年龄、月经状态、肿瘤大小、组织学分级、分子亚型无关。2.乳腺癌LRG1蛋白的表达与淋巴结转移个数呈正相关,随着淋巴结转移个数的增多,LRG1的阳性表达显着升高。3.乳腺癌LRG1蛋白的表达与病理TNM分期相关,分期越晚,LRG1的阳性表达越高。4.LRG1蛋白的表达、TNM病理分期和分子亚型是影响乳腺癌DFS、OS的独立危险因素。LRG1表达水平与DFS、OS呈负相关。第三部分LRG1在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响目的:验证乳腺癌细胞系中LRG1的表达是否与乳腺癌组织中表达一致,为LRG1在乳腺癌发生、发展及侵袭转移中的作用提供理论支持。方法:主要应用了RNA干扰技术、RT-PCR、Western-blot技术和细胞划痕实验等方法,观察不同乳腺癌细胞系中LRG1的表达情况,抑制LRG1表达后细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化。结果:1.RT-PCR方法检测乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1mRNA的表达。在三种不同乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3）中,LRG1mRNA表达水平差别显着,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量（0.1260±0.0070）,较MDA-MB-231细胞（0.1103±0.0081）、SK-BR-3细胞（0.0703±0.0027）相对表达量显着增高。2.MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3细胞中LRG1蛋白的表达。在三种不同乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7及SK-BR-3中,LRG1蛋白的表达存在显着差别,具有统计学意义（P<0.05）。MCF-7细胞中LRG1蛋白相对表达水平最高（10.9510±0.6721）,显着高于MDA-MB-231（7.8492±0.1327）、SK-BR-3细胞（4.3906±0.1914）。3.采用RNA干扰技术抑制乳腺癌MD-MB-231细胞LRG1基因表达。Western-blot技术检测检测转染成功后MDA-MB-231细胞中LRG1蛋白的表达,结果显示,转染组（MDA-MB-231-Si）中LRG1蛋白表达量（0.4105±0.1906）较对照组细胞（MDA-MB-231）中的表达量（0.8295±0.1295）明显降低,差异具有显着性（P<0.05）。4.CCK-8实验检测细胞增殖能力。转染成功后,CCK-8实验检测各组细胞在24h、48h、72h和96h后450 nm处OD值。结果显示:随着时间的延长,转染组（MDA-MB-231-Si）增殖率明显低于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞增殖能力下降。5.细胞划痕实验检测细胞迁移能力。划痕实验分别检测处于对数生长期的对照组、转染阴性对照组、转染组细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231-Si）细胞的迁移能力。划痕0小时测得的划痕区面积:对照组细胞（MDA-MB-231）、转染组细胞（MDA-MB-231-Si）、转染阴性对照组细胞（MDA-MB-231-NC）分别为:15.054±0.122,14.679±0.142,13.407±0.112。划痕24小时后测得的划痕区面积分别为:6.714±0.131,9.559±0.122,5.217±0.132。面积缩小的比值依次为:55.40%,34.88%,61.08%。乳腺癌MDA-MB-231-Si细胞在划痕24小时后的迁移率均明显低于对照组（MDA-MB-231）、转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）,差异有显着性（P<0.05）。6.Transwell实验检测细胞侵袭能力。Transwell侵袭实验显示转染组（MDA-MB-231-Si）穿膜细胞数少于转染阴性对照组（MDA-MB-231-NC）及对照组（MDA-MB-231）,提示LRG1表达抑制后,细胞侵袭能力下降。结论:1.MCF-7细胞中LRG1mRNA的相对表达量,较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞相对表达量显着增高。2.MCF-7细胞中LRG1蛋白的相对表达水平较MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞显着增高。3.si-RNA干扰LRG1表达后可减弱MDA-MB-231细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
杨兆娜[4]（2021）在《TRIB3调控急性早幼粒细胞白血病脂代谢异常及促进MYC驱动淋巴瘤进展的作用及机制研究》文中提出肿瘤是威胁全人类健康的重大问题,尽管目前治疗已取得一定进展,但肿瘤复发、转移和耐药仍然是目前临床治疗面临的重大问题和待攻克的难关。压力应激蛋白TRIB3（Tribbles Homologue 3）包含Ser/Thr激酶结构域却无激酶的催化活性,其生物学功能通常主要依靠蛋白质-蛋白质相互作用实现。我们前期探索TRIB3在多种实体肿瘤和白血病中的作用和机制,发现在不同肿瘤中该蛋白通过与多种重要促癌蛋白相互作用,进而影响肿瘤细胞的代谢、增殖、干性等生物学功能。更为重要的是,这些蛋白相互作用参与或决定肿瘤细胞的恶性程度,促进包括白血病、结直肠癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、三阴性乳腺癌等多种肿瘤的发生发展。急性早幼粒细胞白血病（APL）属于急性髓系白血病（AML）的M3型,该疾病主要由融合蛋白PML-RARα诱发。我们前期研究发现,TRIB3在APL样本中表达升高,高表达的TRIB3通过与PML-RARα相互作用,抑制其泛素化及降解,维持PML-RARα的稳定性来介导APL的发生和疾病进展。尽管在APL治疗中,使用全反式维甲酸（ATRA）与三氧化二砷（As2O3）联合治疗能显着提高其治愈率,但是一线药物在治疗过程中也会引发耐药、复发以及脂质代谢异常等问题。虽然APL患者在一线治疗过程中常出现脂代谢紊乱,但其脂代谢异常机制及初诊病人的脂质水平并不清楚。本论文第一部分基于APL治疗存在的临床问题,探索APL患者治疗前后脂质代谢异常的具体生物学机制。通过回顾性临床数据分析,我们发现APL患者治疗前后脂质代谢异常。进一步我们发现APL患者在治疗前后均出现TRIB3的高表达,TRIB3通过与PML-RARα相互作用,妨碍脂代谢受体PPARγ与其配基RXR结合,促进PPARy降解,抑制PPARγ转录活性来介导APL原发和治疗过程后的脂质代谢异常。而联用降脂药PPAR的激动剂（非诺贝特）,ATRA/As2O3可增强抗白血病效果并缓解病人血脂异常。该研究为临床使用降脂药与ATRA/As2O3联用治疗APL提供了重要的理论依据和潜在治疗策略。淋巴瘤是由病毒、放射线等因素诱发的不同于白血病的血液系统恶性肿瘤。我国淋巴瘤患者大部分为非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）,随着年龄增加其发病率明显提升。NHL的复发是临床治疗的难点,而肿瘤干细胞的存在是导致淋巴瘤复发的重要原因之一。靶向肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞已经成为淋巴瘤治疗的首要目标,而降低关键原癌蛋白的表达则被认为是清除淋巴瘤干细胞的新型策略。本论文第二部分主要集中于假性激酶TRIB3在淋巴瘤发生发展中的作用及机制探究,我们发现TRIB3在淋巴瘤组织中高表达,高表达的TRIB3与淋巴瘤疾病进程密切相关。自发淋巴瘤转基因小鼠中敲除TRIB3能够明显抑制小鼠淋巴瘤的发生发展。机制上,我们发现TRIB3通过与致癌蛋白MYC相互作用,妨碍E3泛素连接酶UBE3B介导的MYC泛素化及降解,维持MYC蛋白的稳定性来维持淋巴瘤细胞的增殖活性和干性,从而促进淋巴瘤的发生发展。本研究首次发现假性激酶TRIB3促进淋巴瘤发生发展的作用,从分子、细胞、动物水平结合PDX模型验证TRIB3促进淋巴瘤发生发展的关键调控机制,同时发现干预措施并提供淋巴瘤的治疗新策略。本论文围绕假性激酶TRIB3参与APL脂质代谢异常和淋巴瘤发生发展的生物学机制开展了广泛深入的研究。论文第一部分详细阐述TRIB3介导初诊和治疗后APL脂代谢异常的机制,为临床使用降脂药与ATRA/As2O3联用治疗APL提供了重要的理论支持。论文第二部分基于TRIB3促进MYC驱动淋巴瘤进展的机制,鉴定出介导MYC泛素化降解的E3泛素连接酶UBE3B,并提出阻断TRIB3/MYC相互作用治疗淋巴瘤的新策略。上述研究为血液肿瘤的治疗提供新策略和新靶点,亦为抗肿瘤多肽药物研发奠定理论基础。
胡峰[5]（2020）在《非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究》文中研究表明在肿瘤微环境中肿瘤抗原的持续刺激下,CD8+T细胞会进入机能缺陷或衰竭状态,从而不能有效地阻止癌症的进展。肿瘤细胞表面上调的抑制性配体PD-L1与CD8+T细胞上PD-1的相互作用是介导T细胞衰竭的机制之一;阻断PD-1/PD-L1通路的药物在癌症患者中效果显着。然而,在大部分癌症类型中,只有小部分患者（20～30%）对anti-PD-1/PD-L1免疫治疗产生应答,非应答者一般经历体内T细胞功能短暂激活后疾病继续进展,这可能是因为阻断PD-1通路难以逆转表观遗传修饰上稳定的衰竭型T细胞的命运,提示还有其它机制与PD-1通路协同地调节T细胞衰竭。由于免疫检查点分子可以协同地介导免疫抑制和促进T细胞衰竭,所以需要找出与PD-1通路协同调节T细胞衰竭的免疫检查点分子并尝试通过联合用药（同时阻断不同的通路）来进一步增强效应细胞杀伤癌细胞的活性以改善肿瘤免疫治疗的疗效。TIGIT（具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体）,是对T细胞功能起负调控作用的免疫检查点分子之一,它过表达于多种癌症中,因此我们认为它可能是一个肿瘤免疫治疗的潜在靶点。在本课题研究中,我们研究了TIGIT在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者循环血和肿瘤微环境中CD8+T细胞的表达,及其对抗肿瘤免疫应答的调控。并进一步探究了anti-TIGIT+anti-PD-1联合用药对于肿瘤治疗的改善作用,以期为非小细胞肺癌的临床治疗提供一些借鉴性的理论依据。我们发现,NSCLC患者外周血中CD8+T细胞上的TIGIT以及TIGIT和PD-1的共表达水平均高于健康对照。在NSCLC患者的肿瘤中,TIGIT和PD-1均高表达于CD8+T细胞表面。这些结果表明,在NSCLC患者的肿瘤微环境中,TIGIT和PD-1信号通路可能共同通过调节CD8+T细胞来调控T细胞介导的抗肿瘤免疫。进一步研究证实,TIGIT缺陷（基因敲除或anti-TIGIT抗体治疗）可抑制小鼠肺肿瘤的进展。然后,我们利用LLC小鼠模型来研究TIGIT分子产生免疫抑制的机制:TIGIT随着CD8+T细胞向肿瘤浸润或扩增而上调,在第12天达到最高点后下降,并与PD-1共表达;通过对比野生型小鼠和TIGIT基因敲除小鼠的表型,我们发现TIGIT缺陷可显着提高肿瘤浸润的CD8+T细胞的数量和效应功能,并抑制T细胞衰竭的进程。在LLC小鼠肿瘤模型中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗相比于单药治疗可更显着地抑制肿瘤生长。我们对比分析发现,anti-TIGIT+anti-PD-1治疗的小鼠中肿瘤抗原特异性CD8+TIL浸润水平增加且具有更强的细胞因子分泌水平,同时显着下调肿瘤微环境中Treg细胞的功能表型。第一部分TIGIT在非小细胞肺癌患者中的表达目的:探究TIGIT在非小细胞肺癌患者外周血和肿瘤微环境中的表达情况,为后续研究奠定基础。方法:采用流式细胞分析术检测NSCLC患者外周血和肿瘤微环境中CD8+T细胞表面免疫检查点分子TIGIT的表达,并进一步明确PD-1在TIGIT+CD8+T细胞上的水平。利用免疫荧光染色确定TIGIT在NSCLC患者中表达的细胞类型。结果:NSCLC患者外周血中CD8+T细胞上的TIGIT以及TIGIT和PD-1的共表达水平均高于健康对照。患者肿瘤组织中,TIGIT高表达于CD8+T细胞表面,并且PD-1高表达于TIGIT+CD8+T细胞。结论:在NSCLC患者体内TIGIT和PD-1在CD8+T细胞上共同高表达,预示着TIGIT和PD-1信号通路可能共同调节CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。第二部分TIGIT抑制肺肿瘤免疫反应的机制研究目的:旨在探究TIGIT对肺肿瘤进展的影响,以及TIGIT通过调控CD8+T细胞功能进而影响肿瘤免疫的机制。方法:在TIGIT敲除小鼠和野生型小鼠上分别建立LLC皮下移植肺肿瘤模型,确定TIGIT在小鼠抗肿瘤免疫中的作用。采用流式分析术和免疫荧光染色确定TIGIT分子在肿瘤微环境中表达的细胞类型。同时在LLC小鼠模型中确定PD-1+TIGITCD8+T细胞的作用,以及TIGIT对CD8+T细胞功能的影响。结果:TIGIT缺失或阻断TIGIT对小鼠肺肿瘤生长具有抑制作用。进一步的流式分析表明PD-1+TIGIT-CD8+T细胞是肿瘤微环境中主要的活化细胞毒性淋巴细胞群。阻断TIGIT信号通路可以增强CD8+T细胞的活性。结论:TIGIT可能促进活化的CD8+T细胞向衰竭型T细胞转变,从而抑制肿瘤内CD8+T细胞的增殖和效应功能,使它们不能有效地清除机体内的肿瘤细胞,造成肿瘤进展。第三部分anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗的抑癌效果目的:探讨anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗对肺肿瘤的治疗效果,为肿瘤的抗体药物治疗提供新的思路。方法:在小鼠上建立LLC皮下移植肿瘤模型,然后分别用对照抗体,anti-PD-1,anti-TIGIT和anti-PD-1+anti-TIGIT治疗小鼠,观察肿瘤生长情况。采用流式细胞分析术检测LLC肿瘤模型中肿瘤微环境中浸润的CD8+T和调节性T细胞比例,并进一步探讨不同治疗组CD8+T细胞的功能差异和调节性T细胞的表型改变。结果:anti-TIGIT或anti-PD-1的单一用药可以显着抑制小鼠肺肿瘤生长,而anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗的作用较单一治疗更加明显。并且,anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗可以有效促进肿瘤组织中CD8+T细胞浸润,并且增加CD8+T细胞IFN-γ的分泌。另外,anti-TIGIT与anti-PD-1联合治疗可以降低调节性T细胞表面TIGIT的表达。结论:在LLC小鼠肿瘤模型中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗相比于单药治疗可更显着地抑制肿瘤生长。anti-TIGIT和anti-PD-1联合治疗可进一步提高CD8+T细胞的肿瘤浸润和效应功能,并且潜在抑制调节性T细胞的功能。因此,在临床应用中,anti-TIGIT和anti-PD-1联合用药有望进一步改善目前anti-PD-1免疫治疗的疗效。
李美蓉[6]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中指出急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
张玺[7]（2020）在《苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究》文中研究指明背景:卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。由于早期无明显症状,缺乏有效的早期检测筛查手段,约70%患者在诊断时已是晚期。目前,手术联合化疗是卵巢恶性肿瘤的主要治疗手段,但化疗对患者身体毒副作用大,且容易复发并产生耐药性。磷酸化是目前研究最广泛的翻译后修饰（post-translational modifications,PTMs）,能够调节细胞生长、分化、凋亡等多种细胞功能。磷酸化信号通路的改变与癌症密切相关,同时它们也可作为抗癌药物开发的潜在靶点。蛋白质组学研究表明,由磷酸化等蛋白翻译后修饰介导的信号通路在卵巢癌的发生和耐药过程中起着关键作用。苦参碱是从中药苦参中提取的有效生物活性成分,具有广泛的生物学活性,比如抗炎、抗病毒、抗癌、镇痛、抗菌、抗氧化、降血脂、抗肝纤维化等。大量研究表明,苦参碱在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌等多种类型的癌症中具有明确的抗癌效果。然而,苦参碱对卵巢癌的影响及其潜在的分子机制尚未见报道。目的:本研究旨在探究苦参碱对卵巢癌的作用及其分子机理,为苦参碱作为新型抗癌药物的深入研究提供线索和依据。方法:1.MTT法和平板克隆形成实验检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP增殖能力的影响。2.流式细胞术检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞周期和凋亡的影响。3.透射电子显微镜和荧光显微镜观察苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP自噬的影响。4.划痕实验、Transwell侵袭实验和免疫荧光技术评估苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞迁移和侵袭的影响。5.体外血管生成试验探讨苦参碱对肿瘤血管生成的影响。6.酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3分泌血管内皮生成因子VEGFA的影响。7.逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测苦参碱对血管内皮生成因子VEGFA和血管生成素ANG-1m RNA水平的影响。8.Western blot检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780、SKOV3增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关蛋白的表达及肿瘤相关磷酸化信号通路的影响。9.分别建立卵巢癌细胞A2780和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP裸鼠皮下移植瘤和尾静脉小鼠模型,定期腹腔注射苦参碱,观察苦参碱对体内卵巢癌细胞增殖和转移能力的影响。10.苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,H&E）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织坏死、肿瘤转移及肝脏损伤的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记技术（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）染色观察苦参碱对小鼠肿瘤组织凋亡的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对卵巢癌细胞A2780和小鼠肿瘤组织总的蛋白质磷酸化水平的影响以及肿瘤组织中增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成相关信号通路蛋白磷酸化水平的影响。12.免疫组织化学技术（Immunohistochemistry,IHC）进一步验证苦参碱对小鼠肿瘤组织中信号通路蛋白磷酸化水平的影响。13.全自动生化分析仪测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartic aminotransferase,AST）含量,评估苦参碱对小鼠肝功能的影响。结果:1.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱阻滞卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞周期在G0/G1期,上调p21蛋白表达,下调cyclin D1和CDK4蛋白表达;同时降低ERK1/2和MEK1/2蛋白磷酸化水平。3.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3发生凋亡,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达;同时降低PI3K和Akt蛋白磷酸化水平。4.苦参碱诱导卵巢癌细胞A2780和SKOV3自噬,上调LC3-II蛋白表达,下调SQSTM1蛋白表达;同时降低Akt和m TOR蛋白磷酸化水平。5.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780和SKOV3迁移和侵袭,降低FAK和Rho A蛋白活性及磷酸化水平。6.苦参碱抑制卵巢癌细胞对血管生成的促进作用,降低卵巢癌细胞A2780和SKOV3分泌VEGFA水平,同时降低卵巢癌A2780和SKOV3细胞中VEGFA m RNA和蛋白表达水平。7.苦参碱降低HUVEC/A2780和HUVEC/SKOV3共培养体系中内皮细胞HUVECs中ANG-1 m RNA和蛋白表达水平,同时下调VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。8.苦参碱抑制卵巢癌细胞A2780体内肿瘤增殖和转移能力,降低卵巢癌细胞和肿瘤组织中总的蛋白质磷酸化水平。9.Western blot和IHC结果表明,苦参碱下调肿瘤组织中信号通路相关蛋白ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2、Tie2蛋白磷酸化水平。10.苦参碱对肝脏组织无损伤作用,对小鼠血清中ALT和AST含量变化无显着影响。11.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,抑制细胞迁移和肿瘤血管生成。12.苦参碱抑制卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP体内肿瘤增殖和转移能力。结论:苦参碱能够抑制卵巢癌细胞A2780、SKOV3和卵巢癌顺铂耐药细胞A2780/DDP细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制细胞迁移和侵袭、抑制肿瘤血管生成,同时降低ERK1/2、MEK1/2、PI3K、Akt、m TOR、FAK、Rho A、VEGFR2和Tie2蛋白磷酸化水平。苦参碱通过抑制肿瘤相关磷酸化信号通路调控细胞增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭、血管生成,从而抑制卵巢癌的发生发展。背景:近几十年来,分子靶向治疗已在许多癌症类型的临床治疗中取得了良好的疗效,如乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌等。确定理想的靶点是肿瘤分子靶向治疗成功的关键。分子靶向治疗的靶点可作用于细胞表面抗原、受体和生长因子,能够调控细胞增殖和转移、细胞周期和血管生成相关信号转导通路。靶向治疗可与过表达的分子结合,调节该分子调控的信号转导通路,从而抑制肿瘤细胞增殖,最终导致细胞死亡。原癌基因c-Src（Src）是一种非受体酪氨酸激酶,与多种人类癌症的发生、维持、进展和转移扩散密切相关。Src通过与多种蛋白和蛋白复合物相互作用并使其磷酸化,在细胞信号传导过程中起关键作用。苦参碱是从传统中药苦参中提取的生物碱之一,具有抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等广泛的药理学活性。研究表明,苦参碱对多种癌症类型包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、白血病等均具有抗肿瘤活性。苦参碱发挥抗肿瘤作用主要是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和自噬、抑制肿瘤细胞迁移和侵袭、抑制血管生成等途径实现的。目前,有关苦参碱抗肿瘤作用的研究颇为广泛,然而其发挥抗癌活性的直接作用靶点尚未见报道。目的:本研究旨在寻找苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点并探讨其作用机制,为开发肿瘤靶向药物提供实验依据。方法:1.选取人结肠癌细胞HT-29、人乳腺癌细胞MCF7、人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3、人宫颈癌细胞He La六种癌细胞为研究对象,MTT法检测苦参碱对癌细胞增殖能力的影响。2.分别建立人非小细胞肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞Bx PC-3、人卵巢癌细胞SKOV3皮下移植瘤模型,定期腹腔注射苦参碱或生理盐水,观察苦参碱对体内肿瘤增殖能力的影响。3.以槐果碱和乙醇胺为原料进行化学反应,合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱。红外光谱和质谱对13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱进行结构表征。4.13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱与氨基偶联树脂进行偶联反应,制备苦参碱偶联树脂。紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度变化,间接反映偶联反应效率。5.提取卵巢癌细胞SKOV3总蛋白,利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色寻找苦参碱特异性结合蛋白。液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）鉴定苦参碱特异性结合蛋白。6.细胞热转变分析（Cellular thermal shift assay,CETSA）实验验证苦参碱作用靶点;构建GST-Src重组蛋白,Pull down实验进一步验证苦参碱作用靶点。7.构建Src分段质粒,转染HEK293T细胞,Pull down实验验证苦参碱结合区域。8.构建GST-Kinase重组蛋白,Western blot进一步验证苦参碱结合区域。9.采用Discovery Studio 4.5软件,分子对接苦参碱与Src激酶结构域,探究苦参碱结合Src激酶结构域的氨基酸。10.选取苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞,测定苦参碱对癌细胞中Src激酶活性的影响。11.Western blot分别检测苦参碱对MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平的影响。结果:1.苦参碱抑制癌细胞增殖,且呈浓度和时间依赖性。2.苦参碱抑制体内癌细胞增殖能力。3.化学合成苦参碱修饰物13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱,产率为65%,红外光谱与质谱结构表征结果与13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱结构一致。4.制备苦参碱偶联树脂,紫外-可见光吸收光谱检测偶联反应前后13α-（2-氨基）乙氧基苦参碱浓度,偶联反应效率为54%。5.利用苦参碱偶联树脂进行Pull down实验,考马斯亮蓝染色结果显示,分子量55-70 k Da之间有明显蛋白条带;且加入苦参碱后,此蛋白条带明显减弱,猜测此蛋白可能为苦参碱特异性结合蛋白。LC-MS/MS质谱定性分析发现,Src为苦参碱特异性结合蛋白。6.CETSA实验结果表明,与对照组相比,苦参碱处理组Src蛋白的热稳定性明显增强。同时,GST-Src重组蛋白进行Pull down实验,结果显示,苦参碱偶联树脂组检测到Src蛋白,且加入苦参碱后,Src蛋白明显减少,进一步证实Src为苦参碱作用靶点。7.分别构建Src分段质粒USH3、SH4-UD、SH3、SH2、Kinase,转染HEK293T细胞过表达后,提取总蛋白进行Pull down实验,Western blot结果分析显示,苦参碱结合Src激酶结构域。8.GST-Kinase重组蛋白进行Pull down实验,Western blot结果表明,苦参碱偶联树脂组检测到目的蛋白,且加入苦参碱后,目的蛋白明显减少,进一步证实Src激酶结构域为苦参碱结合区域。9.Discovery Studio 4.5软件预测苦参碱与Src激酶结构域3D分子对接情况,结果显示,苦参碱结合Src激酶结构域,主要作用可能是因为苦参碱与Ala392形成较强的氢键作用力;同时,苦参碱与周围氨基酸形成范德华力等其他作用力。10.苦参碱最佳作用浓度处理癌细胞后,细胞中Src激酶活性均显着降低。11.Western blot结果表明,苦参碱显着下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3、PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。结论:苦参碱抑制癌细胞增殖。苦参碱作用靶点为Src,Src激酶结构域为苦参碱结合区域。同时,苦参碱能够下调癌细胞中MAPK/ERK、JAK2/STAT3和PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。因此,苦参碱通过靶向Src激酶结构域下调磷酸化信号通路进而抑制癌细胞增殖。
王玉洁[8]（2020）在《基于多种生物传感器的血液肿瘤诊断及标志物检测》文中进行了进一步梳理癌症是全球第二大死亡原因,严重影响着社会经济的发展。根据中国国家癌症中心2019年发布的新一期的全国癌症统计数据,全国新发恶性肿瘤病例数约为392.9万例,全国恶性肿瘤死亡例数约为233.8万。其中血液肿瘤的发病率一直位列前十。为了降低患者的死亡率并阻止癌症的扩散,必须早发现、早诊断、早治疗。当前用于肿瘤诊断的金标准通常为组织活检。鉴于其活检性质,组织活检存在许多局限性,包括患者风险,样品制备,敏感性和准确性,成本高昂以及有创检查。这使得该方法不兼容于临床的早期监测。虽然一些辅助检测手段,例如医学影像学诊断技术,主要包括透视、X线、电子计算机断层扫描（Computed tomography,CT）、核磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）、超声、血管造影与PET-CT等,它们在临床上被广泛应用,为疾病的诊断提供了直观依据,在配合临床症状进而最终确诊中发挥着不可替代的作用。然而,影像学检查成本高、易出现假阴性/阳性、且某些方法辐射剂量较大,同样不适用于人群的早期筛查和诊断。因此,开发新型检测手段,降低检测的经济和时间成本,增强检测的敏感性和特异性,提高癌症的早期检测和诊断率,是当前卫生健康事业的主要任务之一,对肿瘤的二级预防可起到关键作用。当下热门的液体活检理念具有克服这些现有限制的巨大潜力。液体活检,又称液相活检,主要对血液等非固体生物组织进行采样和分析。该技术目前被广泛用于肿瘤的诊断和监测,例如检测血液中肿瘤的特异性靶点或标志物,其主要优点是无创检查。因此,它可以更好地跟踪一段时间内的肿瘤进展和突变,还可以用来监测患者治疗后的复发。该方法尤其适用于血液肿瘤患者。目前常用的液体活检的方法,包括酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）,荧光光谱,放射免疫测定和免疫组化。但是,这些方法通常需要复杂的仪器,这使其变得昂贵、费力、费时。因此,这些缺点限制了它们在临床诊断中的广泛应用。与之相比,生物传感器具有便携性、敏感性、特异性和实用性等特点,是液体活检的绝佳工具选择。生物传感器常用生物受体来特异性地识别和结合靶标,包括蛋白质、DNA/RNA、核酸等,再将产生的生物信号转换为可分析的物理化学信号。目前常用的生物传感器,如电化学传感器、光学传感器,都可对样品中检测到的生物信号进一步放大,这极大地降低了样品的消耗和检测成本,同时提高了检测的敏感性,对癌症患者的早期筛查和诊断有十分重要的意义。基于以上背景,本课题分别采用电化学生物传感器和光学生物传感器技术,对血液肿瘤进行筛查鉴别和靶标检测,并将生物传感器检测结果与临床常用的经典方法的检测结果进行比对,验证新型检测手段在血液肿瘤患者中的临床应用价值和前景。具体工作内容分为以下三个部分:一、基于电化学传感器的血液肿瘤鉴别诊断及初步筛查即开发和评估一种电化学生物传感器,利用丝网印刷电极检测全血中的白细胞来鉴别健康个体、血液肿瘤患者和实体肿瘤患者。由于细胞在静息和兴奋状态下都会不断地产生电荷的转移、传递和传导,使得人体的电生理活动不断进行着电荷变化。细胞的生化反应同电极上发生的电化学反应极其相似,因此可用电化学传感器检测血液中细胞的电化学信号。由于血液中含有不同种类的细胞,不同细胞会产生不同的氧化还原反应,因此,正常细胞和肿瘤细胞将会呈现出不同的响应,从而能被灵敏地识别出来。所以,我们将从医院中收取的血液样本分为三组:健康个体、血液肿瘤和实体瘤。基于血液样本中不同疾病患者血细胞的电化学行为各不相同,本实验用差分脉冲伏安法（Differential pulse voltammetry,DPV）,通过生物电化学传感器检测滴在丝网印刷电极上的血液样本中白细胞的电压峰值,然后将扫描出的电位曲线进行组内和组间比较,根据其电压差和峰位移来区分疾病。通过以上实验,每个人只需被抽出极少的外周血,就可以通过电化学技术的分析,初步确定是否患上肿瘤。同时还能加强肿瘤的二级预防（早期发现、早期诊断和早期治疗）,提高早期检出率,加强人群筛查普查。通过提高肿瘤的早期诊断率和检出率,进而提高患者的存活率。二、基于表面增强拉曼射散（Surface-enhanced roman scattering,SERS）的光学传感器在白血病耐药蛋白中的检测及临床应用P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是白血病多药耐药（Multidrug resistance,MDR）重要的调节剂,因此P-gp的检测对于发现耐药病人,调整化疗方案具有至关重要的意义。目前,光学生物传感器在肿瘤标志物识别领域正迅速发展。光学传感器检测方法由于具有高效快速、操作简便等特点而广受关注。因此,在这项研究中我们选取了光学传感器其中的一种,即SERS方法来评估白血病细胞株和白血病患者外周血中P-gp表达水平。与常规肿瘤标志物检测方法相比,SERS技术采用常规的拉曼光谱法测定吸附在粗糙的胶质金属颗粒表面的样品,被吸附的样品其拉曼光谱的信号强度可提高103～1010倍,具有信号强、灵敏度高、光谱窄、可多重检测的优势,可以实现样本的定性和定量检测及临床应用,对有效解决多元肿瘤标志物检测有十分重要的意义。我们利用抗体装饰的磁珠捕获靶细胞,再用抗体修饰的SERS探针识别细胞中P-gp,最终形成“磁珠-细胞-探针”的三明治结构,然后用拉曼光谱仪检测该三明治结构的SERS信号强度,从而判断P-gp的表达量。本实验不仅在细胞水平进行检测,还用于评估白血病患者的临床样本。由于SERS技术具有极好的灵敏度、特异性、可靠性和应用潜力,凭借这些出色的功能,我们预计这种基于SERS的光学传感器检测方法可能对白血病早期多药耐药的临床诊断非常有帮助。三、基于SERS技术的光学传感器在B细胞系血液肿瘤中对其微小残留标志物的多元检测及临床监测微小残留病灶（Minimal residual disease,MRD）的测量对于临床中血液肿瘤的诊断和预后至关重要。因此,迫切需要一种灵敏而准确的方法来监测相应的表面标志物,以进行早期诊断和治疗指导。本实验中,我们同样利用以SERS技术为基础的光学传感器,来检测血液肿瘤患者的微小残留标志物。由于单个标志物缺乏特异性,检测单个标志物往往不能准确诊断肿瘤的性质和疾病类别,因此开发多元肿瘤标志物检测技术显得格外重要。相比传统的单次平行检测技术而言,多元检测技术可以提高样品的通量、减少样品消耗、缩短检测时间和降低检测成本。为此,本实验设计同时检测B细胞系的白血病/淋巴瘤的两个表面标志物,同时将实验结果与流式细胞术获得的结果进行比较,评估SERS技术在细胞株和患者血液样本中多元检测的特异性、灵敏度和可重复性。在上述条件下,本实验将临床中最为棘手的肿瘤标志物多元检测与血液肿瘤患者的微小残留病灶监测相结合,该新方法有望降低标志物检测限,提高微小残留病灶的早期筛查及检出率,为诊断难治/复发性血液病和快速调整个性化化疗方案提供有力的技术支撑。同时,本项目的研究成果也可以拓展到其他类型肿瘤标志物的多元检测,具有重要的基础科研和临床应用意义。综上所述,本课题采用的生物传感器技术,具有高灵敏、高特异性和可重复性等特点,不仅可以用于从健康人群中筛选出早期肿瘤患者、从免疫表型上区分高度同源的血液肿瘤细胞和耐药细胞、还可以发现肿瘤患者体内残存的极少的微小残留病灶。对提高临床实际样本检测的适用性和检出率,提高血液肿瘤诊断分类分型和预后评估的准确性具有重大意义。该方法方便快捷、省时省力、所需样本量少、无须定位、可定量和动态监测,而且由于标本可以集中处理,减少生物污染,具有极高的临床意义与商业价值,应受到广泛重视。
毕长龙[9]（2019）在《MiR-520a-3p调控JAK/STAT信号通路对PTC生物学行为的影响》文中提出甲状腺癌（Thyroid cancer,THCA）是人类内分泌系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率在头颈部恶性肿瘤中居第一位,在所有内分泌肿瘤发病率中的占比为94.5%,在所有恶性肿瘤发病率中的占比为2.6%。其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是最为常见的类型,约占所有分化型甲状腺癌病理类型的90%,多发于青少年及女性人群,绝大多数患者伴随有颈淋巴结转移。越来越多的研究表明,Micro RNAs（miRNAs）参与了甲状腺乳头状癌的发生和发展。Micro RNA-520a-3p（miR-520a-3p）是miR-520家族的一员,该家族定位于人类第19号染色体上,是一个相对保守的miRNA家族。研究发现,miR-520a在乳腺癌、食管鳞癌、结肠癌及髓系白血病等多种癌症中发挥了重要的抑癌作用。然而,其在甲状腺乳头状癌中的临床意义和潜在分子机制尚不明确,因而研究甲状腺乳头状癌的侵袭和转移过程,探讨癌细胞转移的分子机制,是目前相关临床研究工作中亟待解决的关键问题。为探讨miR-520a-3p对甲状腺乳头状癌生物学行为的影响及其具体的作用机制,首先收集217例甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织及对侧正常甲状腺组织标本,苏木精-伊红（haematoxylin&eosin,HE）染色观察组织病理学改变,采用实时荧光定量PCR检测甲状腺乳头状癌组织及细胞系中miR-520a-3p的相对表达量,并分析miR-520a-3p的相对表达与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征间的关系。结果发现,miR-520a-3p在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中表达水平明显下调,并且与患者肿瘤有无淋巴结转移、侵袭程度及TNM分期显着相关。为了进一步探讨miR-520a-3p的具体作用机制,本研究使用生物信息学网站（micro RNA.org）预测miR-520a-3p的作用靶分子,发现JAK1基因的3’-UTR包含与miR-520a-3p高度匹配的碱基序列,并且通过双荧光素酶基因报告实验证实了miR-520a-3p能特异结合JAK1 3’-UTR并在转录后下调JAK1基因表达。通过免疫组化法检测组织中JAK1蛋白表达阳性率,结果表明,JAK1蛋白在正常组织中的表达阳性率明显低于甲状腺乳头状癌组织,并且与患者肿瘤分化程度、有无淋巴结转移、侵袭程度及TNM分期显着相关。同时,q RT-PCR和Western blot实验结果显示,在甲状腺乳头状癌组织中JAK1、JAK2和STAT3的表达水平明显上调。该结果表明,在甲状腺乳头状癌组织中JAK/STAT通路被激活。进一步本研究对正常细胞和甲状腺乳头状癌细胞进行培养并分为7组:Normal组、Blank组、NC组、miR-520a-3p mimic组、miR-520a-3p inhibitor组、siRNA-JAK1组和miR-520a-3p inhibitor+siRNA-JAK1组。q RT-PCR和Western blot检测各转染组细胞中JAK/STAT通路相关基因（JAK2、STAT3）的表达水平,证实了miR-520a-3p通过负调控JAK1抑制JAK/STAT信号通路的激活。为了进一步明确miR-520a-3p对甲状腺乳头状癌细胞生物学行为的影响及其相关分子机制。本研究通过MTT法检测转染后细胞生长的情况、流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡情况、划痕实验检测细胞迁移、Transwell检测细胞侵袭、q RT-PCR和Western Blot实验检测细胞中上皮间质转化标志物E-cadherin和Vimentin的相对表达水平。结果发现,甲状腺乳头状癌组织中细胞侵袭、迁移及上皮间质转化能力明显下降,凋亡增加,提示miR-520a-3p通过负调控JAK1表达可以抑制甲状腺乳头状癌细胞的生长、迁移、侵袭及上皮间质转化能力,促进细胞凋亡。本文的研究表明,miR-520a-3p具有可抑制甲状腺乳头状癌细胞侵袭与迁移的能力,能显着降低细胞肿瘤的恶性程度,并且通过靶向下调JAK1,抑制JAK/STAT信号通路的激活,从而阻止甲状腺乳头状癌侵袭转移及上皮间质转化。本文的研究揭示了miR-520a-3p在甲状腺乳头状癌恶性生物学行为中的作用,为探寻早期诊断甲状腺乳头状癌、干预治疗及判断预后的靶点提供了理论依据,对于进一步提高患者治愈率和生存率具有重要意义,为甲状腺乳头状癌的治疗寻找新的靶标。
张萍[10]（2020）在《识别髓系白血病Hu3A4-CAR的构建及体内外生物学特性研究》文中研究指明研究背景和目的急性白血病是儿童中最常见的癌症类型。尽管该疾病的治疗取得了进展,但仍有约20%的患者死于耐药或复发[1]。在过去的十年中,分子研究已经发现与儿童急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）和急性淋巴细胞白血病（acute lymphocytic leukemia,ALL）相关的遗传标记越来越多,这些标志物可以增强风险分层,改变治疗策略可改善患者预后。ALL常伴有与淋巴细胞发育和细胞周期调控有关的基因突变和染色体易位[2]。现在越来越多的证据表明,表观遗传学改变（包括DNA甲基化差异）会影响白血病的易感性和预后[3]。组蛋白甲基化失调可能影响与肿瘤发生有关的重要细胞过程,例如增殖和分化,从而导致肿瘤[4]。TET2是10-11易位基因家族的成员,催化DNA中的5-甲基胞嘧啶向5-羟甲基胞嘧啶的转化。SET和MYND结构域蛋白2（SMYD2）是一种甲基转移酶,可以调节包括组蛋白在内的几种蛋白质的活性[5]。两种基因的异常表达都被报道与血液肿瘤相关[6,7]。我们前期的实验已经证实了TET2基因m RNA水平的降低和SMYD2基因m RNA水平的升高是儿童ALL的预后不良因素。相比较于ALL,儿童AML相对预后不良,治愈率更低。随着优化化疗方案,开展造血干细胞移植等技术,儿童AML的治疗效果虽有了明显提高,但始终有部分AML患儿无法耐受化疗、复发及原发耐药而治疗失败。白血病干细胞（leukemia stem cells,LSCs）是儿童AML复发或耐药的根源[8]。对复发难治性AML来说,常规化疗已无法彻底杀灭LSCs,迫切需要寻求新的治疗方法。近年来,以CD19为靶标的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞在B系肿瘤的应用中已取得令人瞩目的成果,这也给儿童复发难治性AML的治疗带来新的希望,但少有靶点被批准用于AML临床治疗,到目前为止,仅CD123-CAR被美国FDA批准用于复发难治性AML的临床治疗,而其他靶点的CAR仍在进行治疗试验中,现正在研发的AML-CAR靶标包括CD33,CD123,FLT3,Lewis-Y和CLL-1等靶点,但效果大多不良,迫切需要寻找新的靶点。3A4是本课题组前期研制的单抗,它是可识别人CD45亚类的Ig Gκ类抗体。我们之前实验显示,3A4仅识别B系肿瘤细胞、正常B细胞、髓系白血病和其干细胞、na?ve T细胞、少量单核细胞,而不识别红细胞、嗜中性粒细胞、正常记忆T细胞、血小板和大部分造血干细胞,是一个靶向AML的良好靶点。究其原因,CAR的成功率一方面与靶点调变有关系,另一方面,跟识别靶点单源抗体人源化的程度有关。大多数CAR是鼠源的,鼠源CAR对人体有免疫原性,可产生抗sc Fv抗体,CAR被中和导致CAR的功能大大被削弱。为了解决这个问题,我们提出用人源化CAR,可明显降低抗sc Fv抗体的产生,从而保证CAR的杀伤活性;为此,3A4抗体已进行了人源化改造,取名为Hu3A4,人源化程度达到93%（课题组前期研究结果）。Hu3A4可特异性结合髓系和B系LSCs,并对髓系KG1a细胞有较强的靶向杀伤作用,利用Hu3A4单抗构建Hu3A4-CAR,靶向杀伤白血病干细胞和治疗难治性AML具有重要科学意义及临床应用前景。本研究包含如下四个部分:1.识别髓系白血病人源化3A4-CAR（Hu3A4-CAR）慢病毒表达载体的构建;2.Hu3A4-CAR慢病毒包装、浓缩、滴度测定研究和Hu3A4-CAR在T细胞的成功表达及体外扩增;3.Hu3A4-CAR-T对白血病细胞的体外靶向杀伤作用及机制,与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究;4.Hu3A4-CAR-T靶向治疗白血病动物模型的作用及与Mu3A4-CAR-T靶向抗肿瘤差异的比较研究。方法1 识别AML-LSC的Hu3A4-CAR表达载体的构建1.1 二代真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的构建:检索文献,确定二代CAR的基因结构,核实Hu3A4-CAR胞外区、跨膜区和胞内区各个结构的基因序列;通过分子克隆技术进行构建真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。1.2 Hu3A4-CAR真核表达载体和慢病毒表达载体的活性鉴定:采用瞬时转染CHO细胞的方法,用流式细胞术（FCM）法检测验证Hu3A4-CAR基因是否表达,并比较两种载体表达CAR效率的差别,选择出效率高的表达载体用于下一步实验。2 Hu3A4-CAR在T细胞的成功表达2.1慢病毒包装及滴度鉴定:包装质粒Rev,Gag-Pol,Vsvg及表达质粒p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的大量抽提后,选用人胚肾293T细胞作包装细胞,脂质体作用下对包装质粒和表达质粒进行包装,收集携有Hu3A4-CAR慢病毒的上清液并测定慢病毒滴度。2.2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达和体外扩增:Ficoll密度梯度离心法分离人外周血中T细胞,抗人CD3/28磁珠及IL-2活化刺激T细胞、然后用含Hu3A4-CAR基因的慢病毒转导到T细胞中。采用RT-PCR,Western blot、流式细胞术分别鉴定Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR是否表达于T细胞。研究Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T在体外培养的扩增倍数。3 Hu3A4-CAR-T的体外靶向杀伤作用及与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究:细胞形态学和流式细胞仪结合检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T与3A4+靶细胞的靶向结合情况,并比较在不同效靶比其靶向结合率的变化;采用Calcein-AM释放法检验Hu3A4-CAR-T细胞靶向杀伤KG1a细胞株及新发AML患者体内的白血病细胞的作用,并与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异进行比较研究;FCM CBA法检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T靶向杀伤靶细胞时分泌细胞因子的水平;Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T杀伤机制研究:Real-time PCR法验证Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T靶向杀伤时穿孔素（perforin,PFN）基因和颗粒酶B（granzyme B,GZM-B）表达是否变化。采用Ficoll密度梯度离心法分离健康骨髓中的单个核细胞（bone marrow mononuclear cells,BMMNCs）,将BMMNCs、Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞充分洗涤,计数并重悬在IMDM培养基中。将5×103个BMMCs分别与具有良好特异性靶向杀伤功能的Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞以效应细胞:靶细胞=10:1的比例共孵育20小时,然后将细胞悬液转移至含有重组细胞生长因子基于甲基纤维素的半固体培养基Metho Cult SF H4436（加拿大Stem cell公司）,并一式两份铺板。14天后,在光学显微镜下通过形态学观察CFU集落并进行分类计数。4 AML小鼠模型体内Hu3A4-CAR-T抗肿瘤作用及与Mu3A4-CAR-T抗肿瘤差异的研究:实验选用NOD/SCID小鼠,设为模型组、空白对照组、T细胞治疗对照组、Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组,共5组,每组6只;先予浓度10mg/ml的环磷酰胺预处理,每只小鼠200ul连续腹腔注射2天;除PBS组外,其余4组小鼠每只接种2x106KG1a细胞以建立AML的动物模型,在注射KG1a细胞后第一天和第二天,予T细胞、Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞静脉输注;监测小鼠的体重变化、观察精神状态,有无活动减少、行动迟缓、弓背抬高等发病症状;每1-3周小鼠眶周静脉采血,流式检测Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞的植入与存留情况,细胞因子的水平;记录小鼠发病和死亡的日期,绘制生存曲线,比较各组小鼠之间生存时间的差别。观察各组小鼠器官的病理与免疫组化的结果。结果1识别AML-LSC的Hu3A4-CAR表达载体的构建1.1真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ的构建:我们确定构建二代CAR的基因,Hu3A4-CAR的基本结构:CD8a leader是Hu3A4-CAR的前导序列,Hu3A4-sc Fv是靶向识别区,CD8a hinge是铰链区,CD8a TM是Hu3A4-CAR的跨膜区,4-1BB的胞内共刺激信号转导区和CD3ζ的内信号转导区则串联连构成Hu3A4-CAR的胞内段。我们构建了Hu3A4-CAR的二代真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。测序结果表明,基因序列与设计序列一致,说明载体构建成功,能用于下一步实验。1.2 Hu3A4-CAR真核表达载体及慢病毒表达载体活性鉴定:FCM法证实我们构建的Hu3A4-CAR的真核表达载体及慢病毒表达载体都是有活性的载体,可成功地在CHO细胞表达Hu3A4-CAR重组蛋白。就表达效率来说,慢病毒载体高于真核表达载体（36%vs.24.3%,P=0.046）。2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达2.1 慢病毒包装及滴度鉴定:293T细胞成功包装了含Hu3A4-CAR基因和Mu3A4-CAR基因的慢病毒,采用q RT-PCR测定Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR慢病毒滴度在5 x105数量级以上。2.2 Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR在T细胞的成功表达和体外扩增:RT-PCR、Western blot和流式细胞术鉴定Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T的表达,3种方法均证明,Hu3A4-CAR和Mu3A4-CAR基因能成功导入且表达于T细胞表面。慢病毒感染体系感染人活化原代T细胞中的感染效率在42%-62%。在CD3/CD28磁珠活化T细胞,1640完全培养基加上IL-2的培养条件下,Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在体外能扩增110-200倍,两者之间扩增倍数无统计学差异（平均扩增倍数分别为130倍和135倍,P>0.05）。3 Hu3A4-CAR-T的体外靶向杀伤作用及与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究:Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T均可靶向识别和结合3A4+的KG1a及Raji细胞,并随着效靶比例的增加,其与靶细胞的结合率也升高。Calcein-AM是一种荧光染料,在活细胞内荧光较为稳定,而在死细胞内荧光不明显,被Calcein-AM标记的靶细胞,分别与Hu3A4-CAR-T、Mu3A4-CAR-T及普通T细胞共孵育24小时。FCM显示与T细胞共孵育24小时的靶细胞,Calcein-AM阳性率为（95.3+0.3%）,在FITC通道可被检测到绿色荧光,而与Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T共孵育24小时的靶细胞,Calcein-AM阳性细胞分别为（17.2+0.5）%和（12.8+1.4）%,有大部分被CAR-T靶向结合而检测不到绿色荧光,两组间无统计学差异（P=0.079）,但分别与T细胞杀伤对照组有显着差异（P<0.001）,说明与CAR-T靶向结合的靶细胞被杀伤,随着效靶比的逐步升高,杀伤功能有不同程度的增强。Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T在靶向杀伤的过程中,可以引起IFN-γ分泌升高,效靶比为10:1时,Hu3A4-CAR-T及Mu3A4-CAR-T组分泌IFN-γ分别为69.4pg/ml和51.8pg/ml,两组之间差异无统计学意义（P=0.739）,但分别与T细胞杀伤对照组有显着差异（P<0.05）。用Real-time PCR方法可检测到颗粒酶B m RNA表达水平升高,CT值分别为0.0929和0.0925,差异无统计学意义（P=0.096）,但分别与T细胞杀伤对照组有显着差异（P<0.05）。Hu3A4-CAR-T、Mu3A4-CAR-T与5×103个BMMNCs共孵育后进行集落形成单位（CFU）培养,14天后在倒置显微镜下观察集落形态并计数,未经CAR-T杀伤的造血干/祖细胞（对照组）的集落数为（26.3+0.88）/5x103,而经Mu3A4-CAR-T和Hu3A4-CAR-T共孵育杀伤的造血干/祖细胞组的集落数分别为（27+1.15）/5x103和（23+1.15）/5x103,与对照组相比,CFU集落数差异无显着意义（P>0.05）。说明两种3A4-CAR-T细胞（人源化、鼠源）对骨髓造血干/祖细胞无明显影响。4 Hu3A4-CAR-T白血病小鼠模型体内抗肿瘤作用及与Mu3A4-CAR-T抗肿瘤差异的研究:设模型组、PBS空白对照组、T细胞治疗对照组、Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组共5组,每组小鼠6只。除PBS组注射PBS外,其余4组小鼠我们成功地通过尾静脉接种了KG1a细胞2x106个/只,接种KG1a细胞后第一天和第二天,T细胞治疗组的小鼠予成功静脉输注了T细胞,Hu3A4-CAR-T细胞治疗组和Mu3A4-CAR-T细胞治疗组的小鼠分别成功地静脉注射了Hu3A4-CAR-T细胞和Mu3A4-CAR-T细胞;Hu3A4-CAR-T治疗组中的1只小鼠D2天予尾静脉注射Hu3A4-CAR-T后半小时死亡,其余小鼠继续进行实验。采用流式细胞仪检测两种3A4-CAR-T细胞在小鼠体内的存留,结果显示,在D11天Mu3A4-CAR-T细胞治疗组所有小鼠外周血中可以检测到Mu3A4-CAR-T细胞（0.005%-0.052%）,Hu3A4-CAR-T细胞治疗组的5只小鼠也都能检测到Hu3A4-CAR-T细胞（0.002%-0.127%）,遗憾的是,在D25天,Mu3A4-CAR-T细胞治疗组所有小鼠外周血中Mu3A4-CAR-T细胞水平<0.001%,而Hu3A4-CAR-T细胞治疗组只剩下2只小鼠能检测到Hu3A4-CAR-T（分别为0.003%和0.013%）,D41天这2只小鼠也没再检测到Hu3A4-CAR-T。至观察期（140天）结束,空白对照组NOD/SCID小鼠均存活;造模组小鼠和T细胞治疗对照组小鼠全部发病死亡,中位生存时间分别是54（44-94）天和59（52-140）天;Mu3A4-CAR-T治疗组有3只小鼠发病死亡,至观察期结束3只小鼠仍存活,中位生存时间为98（68-140）天;Hu3A4-CAR-T治疗组有3只小鼠存活至观察期结束,中位生存时间为89（2-140）天;各组小鼠间的生存时间差异具有统计学意义（P<0.05）。病理结果显示,发病小鼠的脑膜组织有肿瘤细胞浸润,免疫组化染色也证实了肿瘤细胞浸润了脑膜,这可能是导致小鼠出现后肢瘫痪的原因。而其他心、肺、肝、脾、肾、肠、胰腺等组织未见肿瘤细胞浸润。结论1.本研究通过分子克隆的方法成功地构建了以3A4为靶点的人源化真核表达载体pc DNA3.1/Hu3A4-4-1BB-3ζ和慢病毒表达载体p Lenti/Hu3A4-4-1BB-3ζ。两者能成功转染CHO细胞,慢病毒载体感染的效率要高于真核表达载体。2.慢病毒载体成功感染了293T细胞,包装成功的Hu3A4-CAR慢病毒和Mu3A4-CAR慢病毒能顺利感染T细胞,并在细胞水平、蛋白水平和分子水平得以证实。3.Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在体外能培养成功。CD3/CD28磁珠活化联合IL-2的体外培养可以使Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T细胞在2周的时间在体外扩增110-200倍。4. Hu3A4-CAR-T可靶向结合3A4+靶细胞,随效靶比例的升高,其与靶细胞的结合率也增加。Hu3A4-CAR-T和Mu3A4-CAR-T可靶向杀伤3A4+细胞株和新发AML患者体内的白血病细胞,但对3A4-的Nalm-6细胞无杀伤功能。在靶向杀伤过程中,鼠源和人源化3A4-CAR-T均伴随IFN-γ水平上升;同鼠源一样,人源化3A4-CAR-T可通过颗粒胞吐途径介导的溶细胞功能发挥杀伤活性。两种3A4-CAR-T细胞（人源化、鼠源）对骨髓造血干/祖细胞无明显影响。5. Hu3A4-CAR-T细胞及Mu3A4-CAR-T细胞在移植肿瘤动物体内均可以发挥抗肿瘤作用。
二、白血病患者血清肿瘤特异性生长因子水平及其与治疗效果的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、白血病患者血清肿瘤特异性生长因子水平及其与治疗效果的关系（论文提纲范文）
（1）PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的研究进展 |
| 1.1.1 肺癌的分类 |
| 1.1.2 非小细胞肺癌的诊断 |
| 1.1.3 非小细胞肺癌的治疗 |
| 1.2 肿瘤-睾丸抗原(CTA)的研究进展 |
| 1.2.1 CTA分类及特征 |
| 1.2.2 CTA表达调控 |
| 1.2.3 CTA作用和功能 |
| 1.2.4 配子发生与恶性生殖 |
| 1.2.5 CTA在恶性肿瘤中的诊断价值 |
| 1.2.6 肿瘤疫苗和免疫治疗 |
| 1.3 人鱼精蛋白1(PRM1) |
| 1.3.1 PRM1 的作用 |
| 1.3.2 PRM1 与恶性肿瘤 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备和试剂 |
| 2.1.1 实验设备 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验细胞和动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 临床样本的收集 |
| 2.2.2 RT-PCTR法检测样本mRNA水平 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.4 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.2.5 细胞株复苏与培养 |
| 2.2.6 非小细胞肺癌细胞株活力检测 |
| 2.2.7 非小细胞肺癌细胞在不同血清浓度下孵育 |
| 2.2.8 质粒转染和RNA干扰 |
| 2.2.9 人源重组PRM1 蛋白孵育实验 |
| 2.2.10 CCK8 法检测细胞增殖 |
| 2.2.11 EdU法检测细胞增殖实验 |
| 2.2.12 动物实验 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 PRM1 在非小细胞肺癌肿瘤组织和外周血中的表达 |
| 3.1.1 非小细胞肺癌肿瘤组织与配对正常组织PRM1-mRNA水平的差异 |
| 3.1.2 非小细胞肺癌肿瘤组织中PRM1 蛋白水平及临床相关性 |
| 3.1.3 非小细胞肺癌患者外周血中PRM1 蛋白水平及与临床特征的相关性 |
| 3.2 PRM1 诊断价值的评估 |
| 3.2.1 外周血PRM1 蛋白水平对非小细胞肺癌的诊断价值 |
| 3.2.2 PRM1 在肺腺癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.3 PRM1 在肺鳞癌中诊断价值的评估 |
| 3.2.4 PRM1 在组合标志物中诊断价值的评估 |
| 3.2.5 PRM1 对不同分期的非小细胞肺癌的诊断价值评估 |
| 3.2.6 PRM1 在Ⅰ-Ⅱ期肺鳞癌和肺腺癌中的诊断价值 |
| 3.3 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用的研究-细胞学实验 |
| 3.3.1 PRM1 在非小细胞肺癌细胞株中的表达 |
| 3.3.2 PRM1 基因过表达和敲低对非小细胞肺癌细胞株增殖的影响 |
| 3.3.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对非小细胞肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.3.4 细胞营养状态对PRM1 表达水平的影响 |
| 3.3.5 PRM1对A549、NCI-H460 细胞的细胞周期和凋亡的影响 |
| 3.4 PRM1 在非小细胞肺癌中生物学作用研究-动物学实验 |
| 3.4.1 构建A549 细胞裸鼠转移瘤模型 |
| 3.4.2 非小细胞肺癌细胞A549 转移瘤裸鼠血清中PRM1 表达水平 |
| 3.4.3 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤生长曲线的影响 |
| 3.4.4 外源性PRM1 重组蛋白和PRM1 抗体对肿瘤体积和重量的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）Thomsen-Friedenreich单克隆抗体（A78-G/A7）在甲状腺乳头状癌中的作用靶点研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. TF-Ag在肿瘤中的研究背景 |
| 2. 中和TF-Ag的TF-Ab免疫治疗在肿瘤中的研究进展 |
| 3. PTC致病相关分子机制的相关研究 |
| 4. 天然TF-Ab表达特征作为肿瘤患者无创筛查诊断指标的研究现状 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂与仪器耗材 |
| 2. 实验方法 |
| 结果 |
| 1. mAb A78-G/A7在甲状腺癌细胞株上的潜在作用探讨 |
| 2. mAb A78-G/A7对裸鼠PTC异种移植瘤的治疗作用研究 |
| 3. TF-Ag单克隆抗体(mAb A78-G/A7)治疗对PTC差异表达基因E2F4、DDB2、DDIT3的影响研究 |
| 4. TF-Ab中和TF-Ag及对PTC抑癌作用的证据探索 |
| 讨论 |
| 1. 中和TF-Ag的mAb A78-G/A7对PTC细胞株存在潜在抑癌作用 |
| 2. mAb A78-G/A7对裸鼠PTC异种移植瘤存在潜在治疗效应 |
| 3. mAb A78-G/A7干预对可能性较大的PTC差异表达基因的影响研究 |
| 4. TF-Ab在PTC无创诊断方面的潜在价值及其中和TF-Ag与发挥抑癌作用的证据探索 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 治疗性抗体在肿瘤免疫治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LRG1 在不同肿瘤中的表达及临床意义的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 乳腺癌组织中LRG1 蛋白表达与临床特征及生存预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LRG1 在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 LRG1在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）TRIB3调控急性早幼粒细胞白血病脂代谢异常及促进MYC驱动淋巴瘤进展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述一: 白血病骨髓微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二: 蛋白质质量控制及靶向蛋白质相互作用的药物研发进展 |
| 参考文献 |
| 第一部分: TRIB3调控急性早幼粒细胞白血病脂代谢异常的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| A 实验材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.细胞系 |
| 3.患者样本 |
| 4.质粒、siRNA、病毒 |
| 5.实验试剂 |
| 6.试剂盒 |
| 7.抗体 |
| 8.引物 |
| 9.药物 |
| 10.主要仪器 |
| B 实验方法 |
| 1.细胞的传代及冻存 |
| 2.稳定细胞株的建立 |
| 3.小鼠原代APL细胞分离 |
| 4.小鼠原代肝脏细胞分离 |
| 5.肝脏细胞与白血病细胞共培养 |
| 6.白血病小鼠转接模型 |
| 7.蛋白提取 |
| 8.Western Blotting |
| 9.免疫共沉淀 |
| 10.瞬时转染 |
| 11.免疫荧光 |
| 12.流式细胞术及分选 |
| 13.RNA提取 |
| 14.逆转录 |
| 15.实时定量PCR |
| 16.双荧光素酶报告基因检测 |
| 17.蛋白质-染色质免疫共沉淀(CHIP) |
| 18.肝脏细胞脂质检测样品制备 |
| 19.TC水平检测 |
| 20.TG水平检测 |
| 21.ELISA检测Leptin、Resistin、PCSK9水平 |
| 22.变量定义 |
| 23.统计方法 |
| 实验结果 |
| 1.APL患者易发生血脂异常 |
| 1.1 相比非APL患者,APL患者有更高脂代谢异常的发生率 |
| 1.2 APL细胞介导机体脂代谢异常 |
| 1.3 APL细胞在脂代谢异常中起重要作用 |
| 2.APL细胞能够诱导肝细胞脂质合成异常 |
| 2.1 APL细胞能够促进肝脏细胞脂质合成 |
| 2.2 PML-RARα融合蛋白在APL脂代谢异常起重要作用 |
| 3.PML-RARα抑制PPARγ转录活性和脂代谢信号通路 |
| 3.1 APL患者中脂代谢信号通路异常,脂代谢相关基因的异常表达 |
| 3.2 RETN,LEP,PPARγ和TRIB3是介导脂代谢异常的关键基因 |
| 3.3 APL细胞中TRIB3和Resistin蛋白表达升高,PPARγ蛋白表达降低 |
| 3.4 PPARγ通过调控Leptin和Resistin的分泌介导脂代谢异常 |
| 3.5 APL细胞能够诱导小鼠血清中Resistin和PCSK9分泌 |
| 3.6 Resistin能够诱导肝脏细胞分泌PCSK9 |
| 3.7 Resistin调控肝脏细胞脂质代谢 |
| 4.APL细胞中PPARγ活性降低导致脂质代谢异常 |
| 4.1 PML-RARα能够抑制PPARγ的活性 |
| 4.2 APL细胞中敲除PPARγ诱导小鼠血脂异常 |
| 5.TRIB3通过维持PML-RARα稳定性,抑制PPARγ/RXR异源二聚体形成 |
| 5.1 PML-RARα抑制PPARy/RXR异源二聚体的形成 |
| 5.2 TRIB3抑制PPARy/RXR异源二聚体的形成 |
| 5.3 TRIB3进一步增强PML-RARα对PPARγ降解的促进作用 |
| 5.4 TRIB3增强PML-RARα介导的PPARγ泛素化 |
| 6.ATRA/As_2O_3治疗后依然存在脂代谢异常 |
| 6.1 ATRA/As_2O_3治疗恢复PPARγ蛋白表达水平 |
| 6.2 ATRA/As_2O_3诱导Resistin的表达上调和Leptin的表达下调 |
| 6.3 ATRA/As_2O_3处理后APL细胞能诱导肝脏细胞脂代谢异常 |
| 6.4 ATRA/As_2O_3治疗导致APL患者血清TG水平升高 |
| 7.ATRA/As_2O_3治疗诱导TRIB3表达水平升高,介导治疗引发的血脂异常 |
| 7.1 TRIB3抑制PPARγ转录活性 |
| 7.2 TRIB3是介导ATRA/As_2O_3治疗后APL患者血脂异常的关键蛋白 |
| 7.3 敲低TRIB3能明显抑制APL细胞介导的脂质代谢异常 |
| 7.4 小鼠体内敲除TRIB3能缓解ATRA/As_2O_3诱发的脂代谢异常 |
| 8.PPAR激动剂与ATRA/As_2O_3协同治疗APL,改善脂代谢异常 |
| 8.1 PPAR激动剂与ATRA/As_2O_3联用可协同促进APL细胞分化和凋亡 |
| 8.2 PPAR激动剂可抑制砷剂诱导的TRIB3转录活性的升高 |
| 8.3 FN抑制ATRA/As_2O_3诱导的血脂异常 |
| 8.4 ATRA/As_2O_3与FN联合用药可改善APL治疗效果 |
| 9.总结 |
| 讨论 |
| 缩略词 |
| 参考文献 |
| 第二部分: TRIB3调控MYC驱动淋巴瘤进展的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| A 实验材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.细胞系 |
| 3.质粒 |
| 4.抗体 |
| 5.病毒 |
| 6.主要试剂及试剂盒 |
| 7.转基因小鼠基因型鉴定引物 |
| 8.分析软件及网站 |
| 9.统计分析 |
| 10.患者样本信息 |
| B 实验方法 |
| 1.克隆形成实验(CFU) |
| 2.细胞增殖 |
| 3.免疫组化 |
| 4.体外泛素化 |
| 5.PLA邻位连接检测 |
| 6.蛋白纯化 |
| 7.E3泛素连接酶筛选 |
| 8.MYC-K427和MYC-T58突变体Raji细胞株构建 |
| 9.Biacore技术 |
| 实验结果 |
| 1.TRIB3在淋巴瘤组织高表达 |
| 1.1 TRIB3在淋巴瘤组织中表达升高 |
| 1.2 Q84R突变导致TRIB3稳定性增强 |
| 1.3 TRIB3敲除不影响正常淋巴细胞发育 |
| 2.敲除TRIB3抑制淋巴瘤的发生和进展 |
| 2.1 B细胞敲除TRIB3抑制淋巴瘤的发生 |
| 2.2 B细胞敲除TRIB3抑制淋巴瘤的发展 |
| 3.TRIB3促进B淋巴瘤细胞增殖,维持干性 |
| 3.1 TRIB3维持小鼠淋巴瘤细胞的增殖活性和干性 |
| 3.2 TRIB3维持病人原代淋巴瘤细胞的增殖活性和干性 |
| 4.TRIB3调节MYC等关键促肿瘤因子的转录和表达 |
| 4.1 敲除TRIB3抑制MYC的转录活性 |
| 4.2 敲除TRIB3下调MYC的表达水平 |
| 5.TRIB3通过泛素蛋白酶体途径维持MYC的稳定性 |
| 5.1 TRIB3抑制MYC的降解 |
| 5.2 TRIB3通过调控MYC-T58位磷酸化影响MYC降解 |
| 6.UBE3B是介导MYC降解的E3泛素连接酶 |
| 6.1 TRIB3抑制MYC的泛素化修饰 |
| 6.2 TRIB3调控MYC泛素化不依赖于已报道的E3 |
| 6.3 UBE3B是MYC潜在的E3泛素连接酶 |
| 6.4 UBE3B介导MYC泛素化并促进其降解 |
| 7.UBCH3是UBE3B介导MYC泛素化降解的E2泛素偶联酶 |
| 7.1 E2偶联酶UBCH3可以诱导MYC的泛素化 |
| 7.2 UBE3B发挥活性依赖于1036位半胱氨酸 |
| 7.3 鉴定MYC与UBE3B相互作用的结构域 |
| 7.4 淋巴瘤患者易伴随UBE3B-R346Q突变患者 |
| 7.5 UBE3B-R346Q突变抑制MYC的泛素化 |
| 8.K427是UBE3B介导MYC泛素化的位点 |
| 8.1 突变K427R和K443/445R导致MYC泛素化降低 |
| 8.2 MYC-K427R是UBE3B介导MYC泛素化的位点 |
| 9.TRIB3调控淋巴瘤细胞增殖和干性依赖于MYC-T58位磷酸化 |
| 9.1 MYC-T58突变抑制淋巴瘤细胞增殖和干性 |
| 9.2 MYC-T58突变影响MYC靶基因的富集 |
| 10.UBE3B抑制MYC转录及淋巴瘤细胞的增殖和干性 |
| 10.1 MYC-K427R突变增强MYC的转录活性 |
| 10.2 过表达UBE3B抑制MYC的转录活性 |
| 10.3 UBE3B抑制MYC/Max复合物的形成 |
| 10.4 过表达UBE3B抑制淋巴瘤细胞的增殖和干性 |
| 11.TRIB3解除UBE3B对MYC驱动淋巴瘤的抑制作用 |
| 11.1 TRIB3解除UBE3B对小鼠淋巴瘤进展的抑制作用 |
| 11.2 TRIB3解除UBE3B的淋巴瘤细胞干性的维持 |
| 12.TRIB3妨碍UBE3B-MYC的相互作用并促进MYC-Max复合物形成 |
| 12.1 TRIB3抑制UBE3B与MYC的相互作用 |
| 12.2 MYC与TRIB3的KDC结构域结合 |
| 12.3 TRIB3与MYC的C端和N端存在相互作用 |
| 12.4 UBE3B与MYC的C端和N端结合 |
| 12.5 TRIB3抑制MYC-UBE3B的结合并增强MYC-Max的相互作用 |
| 13.总结 |
| 讨论 |
| 附录1: CRISPR-Cas9技术构建Raji突变体细胞测序结果 |
| 附录2: 患者UBE3B和TRIB3突变位点 |
| 缩略词 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 TIGIT在非小细胞肺癌患者CD8+T 细胞上的表达 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 TIGIT抑制肺肿瘤免疫反应的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 anti-TIGIT与 anti-PD-1 联合治疗的抑癌效果 |
| 一、材料方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 TIGIT在肿瘤中的作用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 非小细胞肺癌治疗的策略和展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文及参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（6）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 苦参碱通过调控肿瘤相关磷酸化信号通路抑制卵巢癌的发生发展 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 苦参碱抑制癌细胞增殖的分子靶点与作用机制研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 苦参碱抗肿瘤作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（8）基于多种生物传感器的血液肿瘤诊断及标志物检测（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 血液肿瘤 |
| 1.1.1 血液肿瘤中的多药耐药 |
| 1.1.1.1 多药耐药的表达机制 |
| 1.1.1.1.1 药物外排 |
| 1.1.1.1.2 药物失活 |
| 1.1.1.1.3 药物靶点的改变 |
| 1.1.1.1.4 DNA损伤修复 |
| 1.1.1.2 多药耐药的检测 |
| 1.1.1.2.1 聚合酶链式反应 |
| 1.1.1.2.2 荧光辅助原位杂交 |
| 1.1.1.2.3 蛋白质印迹 |
| 1.1.1.2.4 流式细胞术 |
| 1.1.1.2.5 免疫组化 |
| 1.1.2 血液肿瘤中的微小残留病灶 |
| 1.1.2.1 微小残留的检测方法 |
| 1.1.2.1.1 常用检测方法 |
| 1.1.2.1.2 新型检测方法 |
| 1.2.生物传感器在血液肿瘤诊断中的应用 |
| 1.2.1.生物传感器的制造 |
| 1.2.2 电化学传感器 |
| 1.2.2.1 电化学传感器检测蛋白质标志物 |
| 1.2.2.2 电化学传感器检测核酸标志物 |
| 1.2.3 光学传感器 |
| 1.2.3.1 光学传感器检测蛋白质生物标志物 |
| 1.2.3.2 光学传感器检测mi RNA和循环DNA |
| 1.2.3.3 光学传感器检测端粒酶活性和测量端粒长度 |
| 1.3 本课题任务 |
| 第二章 基于电化学工作站对血液肿瘤的鉴别诊断及初步筛查 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 伦理声明 |
| 2.3.2 患者数据及信息 |
| 2.3.3 样品处理与检测 |
| 2.3.4 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 基于SERS技术的血液肿瘤耐药蛋白(P-GP)检测及临床应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要实验试剂来源及配制方法 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养和MDR模型制备 |
| 3.3.2 CCK-8 分析 |
| 3.3.3 全血样本的收集与处理 |
| 3.3.4 SERS探针和捕获磁珠的制造 |
| 3.3.5 三明治免疫分析 |
| 3.3.6 基于SERS的光学传感器检测 |
| 3.3.7 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 SERS探针和捕获磁珠的表征 |
| 3.4.2 使用 SERS 方法诊断白血病细胞株中的耐药性 |
| 3.4.3 SERS技术分析白血病患者的全血样本 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于SERS技术的血液肿瘤微小残留标志物检测及临床监测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要实验试剂来源及配制方法 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养与制备 |
| 4.3.2 外周血采样 |
| 4.3.3 SERS探针和捕获磁珠的制备 |
| 4.3.4 “三明治”免疫复合物的合成和SERS测量 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 SERS探针和捕获磁珠的合成与表征 |
| 4.4.2 SERS免疫检测在血液肿瘤细胞株中表面标志物的识别 |
| 4.4.3 SERS免疫检测在血液肿瘤的临床应用 |
| 4.4.5 基于SERS的光学传感器监测MRD的动态变化 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 博士期间发表文章与会议 |
| 致谢 |
（9）MiR-520a-3p调控JAK/STAT信号通路对PTC生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题背景及研究的目的和意义 |
| 1.2 甲状腺乳头状癌 |
| 1.2.1 甲状腺乳头状癌流行病学 |
| 1.2.2 甲状腺乳头状癌临床治疗 |
| 1.2.3 甲状腺乳头状癌的易感因素 |
| 1.2.4 甲状腺乳头状癌分子生物学进展 |
| 1.2.5 甲状腺乳头状癌预后影响因素 |
| 1.3 MICRORNA与肿瘤 |
| 1.3.1 Micro RNA的作用机制及研究进展 |
| 1.3.2 MiR-520a-3p在肿瘤中的研究进展 |
| 1.4 JAK/STAT信号通路与肿瘤 |
| 1.4.1 JAK/STAT通路的作用机制 |
| 1.4.2 JAK/STAT通路的研究进展 |
| 1.5 肿瘤生物学行为 |
| 1.5.1 EMT与肿瘤发生发展的关系研究 |
| 1.5.2 侵袭转移与肿瘤发生发展关系研究 |
| 1.5.3 细胞骨架与肿瘤发生发展关系研究 |
| 1.6 本文的主要研究内容和技术路线 |
| 1.6.1 本文的主要研究内容 |
| 1.6.2 本文的技术路线 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.1.4 临床样本 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 RNA提取及逆转录 |
| 2.2.2 实时荧光定量PCR |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 MTT法 |
| 2.2.6 流式细胞术 |
| 2.2.7 细胞划痕 |
| 2.2.8 Transwell实验 |
| 2.2.9 HE染色 |
| 2.2.10 免疫组化 |
| 2.2.11 Western blotting法 |
| 2.2.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 第3章 MIR-520A-3P在甲状腺乳头状癌中的表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 甲状腺乳头状癌与正常组织样本 |
| 3.3 甲状腺乳头状癌与正常组织结构 |
| 3.4 组织中MIR-520A-3P的检测 |
| 3.4.1 组织中miR-520a-3p的表达 |
| 3.4.2 临床病理与miR-520a-3p关系 |
| 3.5 细胞系MIR-520A-3P的表达 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 MIR-520A-3P抑制JAK/STAT通路 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 MIR-520A-3P和 JAK1 基因靶向验证 |
| 4.3 甲状腺乳头状癌组织JAK1 的检测 |
| 4.3.1 甲状腺乳头状癌组织中JAK1 的表达 |
| 4.3.2 甲状腺乳头状癌临床病理与JAK1 关系 |
| 4.4 甲状腺乳头状癌组织中JAK/STAT通路激活 |
| 4.5 MIR-520A-3P下调JAK1 抑制JAK/STAT通路 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 MIR-520A-3P通过JAK/STAT通路调控甲状腺乳头状癌 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 MIR-520A-3P通过JAK/STAT通路影响细胞增殖 |
| 5.3 MIR-520A-3P通过JAK/STAT通路影响细胞周期分布 |
| 5.4 MIR-520A-3P通过JAK/STAT通路影响细胞凋亡 |
| 5.5 MIR-520A-3P通过JAK/STAT通路影响细胞迁移 |
| 5.6 MIR-520A-3P通过JAK/STAT通路影响细胞侵袭能力 |
| 5.7 MIR-520A-3P通过JAK/STAT通路影响上皮间质转化 |
| 5.8 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文及其它成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）识别髓系白血病Hu3A4-CAR的构建及体内外生物学特性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 识别髓系白血病Hu3A4-CAR慢病毒表达载体的构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Hu3A4-CAR在 T细胞的成功表达 |
| 第一章 慢病毒包装及滴度鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 Hu3A4-CAR和 Mu3A4-CAR在 T细胞的成功表达和体外扩增 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 Hu3A4-CAR-T的体外靶向杀伤作用及与Mu3A4-CAR-T靶向杀伤差异的比较研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 Hu3A4-CAR-T体内抗肿瘤作用及与Mu3A4-CAR-T抗肿瘤差异的研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 嵌合抗原受体（CAR）-T 细胞治疗急性髓性白血病（AML）的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
四、白血病患者血清肿瘤特异性生长因子水平及其与治疗效果的关系（论文参考文献）
- [1]PRM1在非小细胞肺癌中的表达及生物学作用研究[D]. 李小丰. 吉林大学, 2021(01)
- [2]Thomsen-Friedenreich单克隆抗体（A78-G/A7）在甲状腺乳头状癌中的作用靶点研究[D]. 彭颖. 昆明医科大学, 2021(02)
- [3]LRG1在乳腺癌中表达的临床意义及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响[D]. 张彦收. 河北医科大学, 2021(02)
- [4]TRIB3调控急性早幼粒细胞白血病脂代谢异常及促进MYC驱动淋巴瘤进展的作用及机制研究[D]. 杨兆娜. 北京协和医学院, 2021(02)
- [5]非小细胞肺癌中TIGIT在CD8+T细胞的表达及作用机制研究[D]. 胡峰. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [6]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020
- [7]苦参碱抗肿瘤作用分子机制研究[D]. 张玺. 华中科技大学, 2020(01)
- [8]基于多种生物传感器的血液肿瘤诊断及标志物检测[D]. 王玉洁. 东南大学, 2020(01)
- [9]MiR-520a-3p调控JAK/STAT信号通路对PTC生物学行为的影响[D]. 毕长龙. 哈尔滨工业大学, 2019(02)
- [10]识别髓系白血病Hu3A4-CAR的构建及体内外生物学特性研究[D]. 张萍. 浙江大学, 2020(01)