一、Lats1基因敲除小鼠保种的研究（论文文献综述）
赵巧云[1]（2021）在《PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究》文中研究说明研究背景与目的:胃癌是最常见的恶性肿瘤之一,预后较差。胃癌的发生发展经过了一系列漫长的演变过程,其中幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染是该演变过程中最重要的始动因子。H.pylori通过多种毒力因子如Cag A、Oip A、Vac A等调控胃上皮细胞生物学行为的改变,但其致病机制目前尚不明确。我们前期利用H.pylori 7.13和CCS9803两种野生菌株分别感染胃上皮细胞GES-1,构建体外细菌细胞共培养模型,并进行细胞转录组学测序分析和实验验证,发现H.pylori感染可上调胃上皮细胞GES-1的前列腺跨膜蛋白雄激素诱导基因1（prostate transmembrane protein androgen inducible gene 1,PMEPA1）的m RNA和蛋白的表达,提示了PMEPA1可能参与H.pylori感染相关的胃黏膜病变过程。PMEPA1是于2000年在前列腺组织中被发现的一种新型雄激素诱导基因,主要在细胞膜和亚细胞器如溶酶体、高尔基体等的亚细胞器膜上表达。已知PMEPA1基因是一种TGF-β诱导基因,负性调控TGF-β信号通路。研究发现,PMEPA1在多种肿瘤中高表达,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学过程。然而,PMEPA1在胃癌中的研究尚不明确,且PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜改变过程中的作用也未见报道。因此本文通过生物信息学、PMEPA1基因干预、细胞转录组学等多种方法研究了PMEPA1在H.pylori感染相关胃黏膜病变过程中的作用及机制,为进一步挖掘H.pylori感染致病的新的分子机制及为H.pylori相关胃癌的靶向调控提供新的理论依据。材料方法:（一）PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中的表达分析:（1）利用Oncomine数据库、GEO数据库、TCGA数据库的胃癌测序数据,分析PMEPA1在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达及PMEPA1在不同劳伦分型胃癌中的表达;（2）从南昌大学第一附属医院手术室收集18对胃癌及癌旁组织标本,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）及蛋白质印迹（western blot,WB）的方法检测了PMEPA1在胃癌及癌旁组织的表达。2.PMEPA1表达与胃癌患者的预后分析:利用Kaplan-Meier Plotter在线分析数据库,评价PMEPA1与胃癌患者的总体生存期（over survival,OS）,无进展生存期（progression-free survival,FP）和进展后生存期（post-progression survival,PPS）的关系,明确PMEPA1的表达与胃癌患者预后的关系。3.PMEPA1在胃癌的诊断价值:利用p ROC包对TCGA数据库中的375例胃癌和32例正常胃黏膜组织测序样本进行受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析,并计算曲线下面积（Areas under the curve,AUC）,评估PMEPA1在胃癌的诊断价值。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）根据PMEPA1的中位表达值,将TCGA数据库的375个胃癌样本分为PMEPA1高表达组和低表达组,利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）分析两个差异基因集富集的生物学过程;（2）用R语言对TCGA数据库中与PMEPA1基因相关的基因进行批量计算,并对相关基因进行KEGG信号通路富集。（二）H.pylori感染及其毒力因子对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.H.pylori及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）构建H.pylori 7.13和PMSS1的oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）,并制备抗Oip A抗原的抗体,在基因和蛋白水平对oip A基因的敲除效果进行验证;（2）将H.pylori PMSS1野生菌株以不同感染复数（MOI）与胃上皮细胞GES-1共培养不同时间（1h,3h,6h,12h,24h）,检测PMEPA1蛋白表达水平,并检测感染6h时PMEPA1的m RNA表达水平;（3）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）分别以不同MOI感染AGS细胞6h,检测PMEPA1蛋白的表达水平;（4）将H.pylori 7.13和PMSS1野生菌株（Hp7.13wt和Hp PMSS1wt）、cag A基因敲除菌株（Hp7.13Δcag A和Hp PMSS1Δcag A）及oip A基因敲除菌株（Hp7.13Δoip A和Hp PMSS1Δoip A）分别与胃上皮细胞GES-1细胞和AGS细胞共培养6h,检测PMEPA1的蛋白和m RNA表达水平。2.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:从南昌大学第一附属医院病理科收集H.pylori感染的不同胃黏膜病理阶段的内镜标本石蜡切片,通过免疫组化法检测PMEPA1的表达。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1过表达及敲减稳转细胞株的构建:分别构建过表达PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1highGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1highGES-1)、敲减PMEPA1基因的GES-1细胞(PMEPA1lowGES-1)及对照细胞(NC-PMEPA1lowGES-1)、过表达PMEPA1的BGC-823细胞(PMEPA1highBGC-823)及对照细胞(NC-PMEPA1highBGC-823)。2.PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响及机制:（1）通过平板克隆形成实验、实时无标记细胞分析（Real Time Cellular Analysis,RTCA）技术、CCK8法检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞增殖的影响;（2）通过transwell侵袭和迁移实验、划痕修复实验检测PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞侵袭和迁移的影响;（3）通过生物信息学分析TCGA数据库胃癌数据集中PMEPA1与EMT转录因子的相关性;（4）Western Blot检测EMT相关分子的蛋白表达水平。3.PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响:（1）H.pylori PMSS1的野生菌株、cag A及oip A敲除菌株感染PMEPA1highBGC-823细胞及其对照细胞,RTCA技术、transwell侵袭和迁移实验检测PMEPA1过表达对H.pylori感染的胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响;（2）H.pylori 7.13野生型菌株感染PMEPA1lowGES-1及其对照细胞NC-PMEPA1lowGES-1,transwell实验检测PMEPA1敲减对H.pylori感染的胃上皮细胞的侵袭和迁移能力的影响。（四）转录组学分析PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学功能的影响1.转录组学样品准备:将Hp7.13wt和Hp PMSS1wt分别感染PMEPA1lowGES-1及NC-PMEPA1lowGES-1细胞（MOI=100）,将Hp7.13wt、Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染PMEPA1highGES-1及NC-PMEPA1highGES-1细胞（MOI=100）,H.pylori感染6h后收集细胞总RNA;同时收集PMEPA1highBGC-823及NC-PMEPA1highBGC-823细胞总RNA;每个组设置三个生物学重复,共收集48个RNA样品。2.转录组测序及分析:（1）转录组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司,基于Illumina Novaseq 6000测序平台,通过c DNA文库构建、上机测序、测序数据质控、基因注释等步骤获得基因表达量数据;（2）利用DESeq2软件对表达基因进行差异分析,筛选标准为差异基因表达倍数（Fold Change）>1.5,校正P<0.05;（3）采用Goatools软件对差异基因进行GO富集分析,校正P<0.05为显着富集;采用R语言对差异基因进行KEGG富集分析,P<0.05为显着富集。结果:（一）PMEPA1在胃癌组织的表达、预后及生物信息学分析1.PMEPA1在胃癌组织中高表达:（1）Oncomine数据库分析结果显示,PMEPA1在多种癌症组织中显着高表达（P<0.05）,包括乳腺癌、宫颈癌、头颈癌、肺癌及多个消化系统肿瘤如食管癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌。（2）利用GEPIA数据库,共纳入408例TCGA胃癌样本和211例包含TCGA及GETx数据库的正常胃黏膜组织样本,分析结果显示,PMEPA1在胃癌组织样本的表达显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（3）从GEO数据库中下载三个胃癌测序数据集（GSE54129,GSE79973,GSE118916）,分析结果显示,在三个GEO数据集中,PMEPA1在胃癌组织中的转录水平均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（4）利用Oncomine数据库分析PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织中的表达情况,结果显示PMEPA1在不同劳伦分型胃癌组织的表达均显着高于正常胃黏膜组织（P<0.05）。（5）18例胃癌及癌旁手术标本的q RT-PCR及WB结果显示,PMEPA1在胃癌组织的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）。2.PMEPA1高表达与胃癌患者不良预后有关:Kaplan-Meier Plotter数据库分析结果显示,PMEPA1是胃癌患者预后不良的风险因素（HR>1）,PMEPA1高表达的胃癌患者总体生存期（HR=1.52）、无进展生存期（HR=1.38）及进展治疗后生存期（HR=1.67）显着缩短（P<0.05）。3.PMEPA1诊断胃癌的临床价值:对TCGA数据库的胃癌数据集绘制PMEPA1基因的受试者工作曲线（ROC）,曲线下面积AUC为0.893,说明PMEPA1是良好的胃癌诊断标志物。4.生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程:（1）GSEA分析结果显示,PMEPA1高表达与TGF-β、上皮间充质转化（EMT）、血管生成、缺氧、Wnt信号通路和Hedgehog信号通路显着正相关（FDR q-value<0.05）;（2）批量相关性基因的KEGG富集分析结果显示,PMEPA1及其相关性基因主要富集在E2F靶基因、有丝分裂纺锤体、MYC靶基因、蛋白质分泌、DNA修复、G2M细胞周期检查点、血管生成、Wnt信号通路、TGF-β信号通路、紧密连接、EMT等信号通路,其中PMEPA1与EMT信号通路呈显着正相关（校正P值=0.005）。（二）H.pylori感染对胃黏膜上皮细胞PMEPA1表达的影响1.成功构建了Hp7.13和Hp PMSS1菌株的oip A基因敲除菌株,及抗Oip A抗原的兔多克隆抗体。2.H.pylori感染上调胃上皮细胞PMEPA1蛋白和m RNA表达水平:（1）前期转录组学分析结果显示,Hp7.13和Hp CCS9803菌株感染感染GES-1细胞24h,与未感染H.pylori的细胞相比,PMEPA1表达分别上调1.59倍和1.13倍,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）Hp PMSS1以不同MOI感染胃上皮GES-1细胞1、3、6、12、24h,在感染6h和12h时随着MOI增大,PMEPA1蛋白表达水平逐渐上升,在MOI=50表达水平最高（P<0.05）,PMEPA1的m RNA表达水平在感染6h时MOI=100表达最高（P<0.05）。（3）将Hp 7.13和PMSS1以不同MOI感染胃癌细胞株AGS 6h,随着MOI的增加,PMEPA1蛋白表达水平上升,其中MOI=50在两个菌株中都有统计学差异（P<0.05）。3.Hp毒力因子Cag A和Oip A对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响:（1）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1 6h,Western Blot结果显示,Hp7.13wt或PMSS1wt感染后PMEPA1蛋白表达高于未感染的对照组,而cag A和oip A基因敲除菌感染的PMEPA1蛋白表达低于野生组;（2）Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）和Hp PMSS1wt（或Hp PMSS1Δcag A、Hp PMSS1Δoip A）感染胃上皮GES-1和AGS细胞6h,荧光定量PCR结果显示,Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染GES-1和AGS细胞后,PMEPA1的m RNA表达水平显着高于未感染细胞（P<0.05）,而cag A和oip A基因敲除菌感染时PMEPA1的m RNA表达显着低于野生菌感染的细胞（P<0.05）。4.PMEPA1在不同胃黏膜疾病阶段中的表达及其与H.pylori感染的关系:（1）PMEPA1在炎细胞和腺细胞中均有表达,主要定位于细胞质及核膜。（2）在腺细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的轻度慢性非萎缩性胃炎、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）;在炎细胞中,PMEPA1的表达在H.pylori感染的重度非萎缩性炎症、肠化生和异型增生组均显着高于H.pylori未感染患者（P<0.05）。（3）在H.pylori感染的标本中,PMEPA1在轻度和重度非萎缩性胃炎患者标本腺细胞中的表达显着低于肠化生、异型增生和胃癌组（P<0.05）;在轻度非萎缩性胃炎的炎细胞中的表达显着低于其它各组（P<0.05）;在H.pylori未感染患者,无论是腺细胞还是炎细胞,PMEPA1的表达在胃癌组均显着高于其它各组（P<0.05）。以上结果提示,PMEPA1可能参与了H.pylori感染的胃黏膜病变过程。（三）PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制1.PMEPA1促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖:（1）平板克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highGES-1的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;PMEPA1lowGES-1的增殖能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）体外克隆形成实验、RTCA技术和CCK8增殖实验均显示,PMEPA1highBGC-823的增殖能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）;2.PMEPA1促进胃上皮和胃癌细胞的侵袭和迁移:（1）Transwell侵袭和迁移实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的侵袭和迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1lowGES-1细胞的侵袭和迁移能力显着低于相应的NC细胞（P<0.05）。（2）划痕修复实验表明,PMEPA1highGES-1和PMEPA1highBGC-823的迁移能力显着高于相应的NC细胞（P<0.05）。3.PMEPA1与上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）有关:（1）利用Cbioportal数据库分析了PMEPA1与EMT有关基因的相关性,分析结果显示,PMEPA1与间充质细胞标志物N-cadherin的编码基因CDH2、Vimentin的编码基因VIM、EMT间充质细胞转录因子ZEB1、TWIST1、TWIST2显着正相关（P<0.05）,与Snail转录因子编码基因SNAI1和Slug转录因子编码基因SNAI2显着正相关（P<0.05）;与基质金属蛋白酶分子编码基因MMP11、MMP14、MMP7、MMP2、MMP1、MMP17、MMP13和MMP24显着正相关（P<0.05）;（2）Western Blot结果显示,PMEPA1lowGES-1的E-cadherin蛋白表达显着高于NC细胞（P<0.05）,N-cadherin蛋白表达显着低于NC细胞（P<0.05）,而PMEPA1high GES-1则反之（P<0.05）。4.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞BGC-823增殖的影响:Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823细胞和对照细胞,RTCA结果显示,H.pylori感染18小时后开始促进NC组细胞的增殖,在感染后的40-78h内,Hp PMSS1wt菌株显着促进NC-PMEPA1highBGC-823细胞的增殖（P<0.05）,而Hp PMSS1Δcag A及Hp PMSS1Δoip A感染组与Hp PMSS1wt感染组相比,细胞增殖无统计学差异（P>0.05）;Hp PMSS1wt菌株及cag A和oip A敲除菌株对PMEPA1highBGC-823细胞的增殖无统计学差异（P>0.05）。5.PMEPA1对H.pylori感染的胃癌细胞和胃上皮细胞迁移和侵袭的影响:（1）PMEPA1过表达对H.pylori感染的BGC-823胃癌细胞迁移和侵袭的影响:H.pylori未感染组中,过表达PMEPA1显着促进BGC-823细胞的迁移和侵袭（P<0.05）;Hp7.13wt感染PMEPA1highBGC-823及对照细胞后细胞迁移和侵袭能力显着高于未感染细胞（P<0.05）,同时Hp7.13wt感染组细胞的迁移和侵袭能力显着高于Hp7.13Δcag A和Hp7.13Δoip A感染组（P<0.05）;Hp PMSS1wt感染PMEPA1highBGC-823和NC细胞后,细胞侵袭能力同Hp7.13菌株,而迁移能力在PMEPA1highBGC-823细胞各组无统计学差异（P>0.05）。（2）PMEPA1敲减对Hp7.13wt感染的胃上皮GES-1细胞的迁移和侵袭的影响:Hp7.13wt感染PMEPA1lowGES-1及对照细胞后,细胞迁移和侵袭能力显着增加（P<0.05）。（四）转录组学分析PMEPA1在H.pylori感染的胃上皮细胞作用的生物学功能1.PMEPA1对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响:（1）PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞GES-1转录水平的影响:（1）GES-1过表达PMEPA1后共有1025个差异基因,敲减PMEPA1后共有1376个差异基因;（2）差异基因主要富集的GO通路有细胞运动相关如质膜黏附分子的细胞间黏附作用、趋化运动、黏附过程、细胞迁移、细胞运动、细胞外基质成分、细胞运动的调节等生物过程;（3）差异基因富集到的KEGG信号通路主要有细胞粘附分子、TGF-β、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）PMEPA1过表达对胃癌细胞株BGC-823转录水平的影响:（1）共有132个差异基因;（2）主要富集的GO通路有细胞外基质组成、组织形态发生、急性炎症反应、TGF-β的分泌调控等生物过程;（3）主要富集到的KEGG通路包括耶尔森菌感染、小细胞肺癌、内吞、抗坏血酸和醛酸代谢、肌动蛋白细胞骨架的调控、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用、ECM-受体相互作用。综上,PMEPA1过表达或敲减主要影响细胞运动、迁移、细胞黏附、受体配体相关作用、TGF-β信号通路、ECM-受体相互作用等生物学过程。2.H.pylori感染对敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响（1）H.pylori感染对敲减PMEPA1的GES-1细胞转录水平的影响:（1）Hp7.13wt和Hp PMSS1wt感染PMEPA1lowGES-1细胞后,分别有2315和959个差异基因;（2）差异基因富集的GO通路相似,主要包括细胞对缺氧的反应、细胞分裂、血管发育的调控、细胞周期的正向调控、细胞运动的正向调控等生物过程;（3）共同富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、缺氧诱导因子-1信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用等。（2）H.pylori感染对过表达PMEPA1的GES-1转录水平的影响:（1）Hp7.13wt感染NC-PMEPA1highGES-1后,共有1646个差异基因,富集的KEGG通路主要有MAPK信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路的研究、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路等;（2）Hp7.13wt与Hp7.13Δcag A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因富集到了17条信号通路,主要有肿瘤中的micro RNAs、细胞周期、P53信号通路、细胞衰老、FOXO信号通路、癌症中的转录调控异常、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路等,说明cag A可能通过以上这些通路起作用。（3）Hp7.13wt与Hp7.13Δoip A菌株感染NC-PMEPA1highGES-1细胞的差异基因未富集到KEGG通路。综上,H.pylori感染可能通过转录因子的调控作用、缺氧诱导因子-1信号通路、AMPK信号通路、IL-17信号通路、Wnt信号通路、Hippo信号通路、JAK-STAT信号通路、Hedgehog信号通路介导敲减或过表达PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的变化,其中毒力因子Cag A可能发挥重要作用。3.PMEPA1对不同H.pylori菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响（1）PMEPA1敲减对Hp7.13（或PMSS1）感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp PMSS1wt）感染PMEPA1lowGES-1及其对照组细胞,差异基因富集的KEGG通路相似,主要包括AGE-RAGE信号通路的研究、癌症中胆碱代谢、细胞衰老、Hippo信号通路、EGFR酪氨酸酶抑制耐受、癌症中的micro RNA、Fox O信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、细胞骨架调控等;（2）PMEPA1过表达对不同H.pylori菌株感染的GES-1细胞的影响:Hp7.13wt（或Hp7.13Δcag A、Hp7.13Δoip A）感染PMEPA1highGES-1及其对照细胞,差异基因富集的信号通路相似,主要的GO富集有TGF-β的反应、趋化性的调节、质膜粘附分子的粘附、细胞对生长因子刺激反应等过程等生物过程;主要的KEGG富集有细胞因子-细胞因子受体相互作用、AGE-RAGE信号通路、TGF-β信号通路、Hedgehog信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17信号通路等。综上,在H.pylori感染胃上皮细胞的过程中,PMEPA1可能通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。结论:1.PMEPA1在胃癌组织高表达,与胃癌不良预后有关,是良好的胃癌诊断标志物。2.PMEPA1高表达促进胃上皮细胞和胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,与EMT表型相关。3.H.pylori感染调控PMEPA1的表达,促进胃上皮细胞的增殖、侵袭和迁移,部分依赖于毒力因子Cag A和Oip A的作用。4.H.pylori感染胃上皮细胞调控多种生物学过程;PMEPA1通过多种途径参与H.pylori介导的胃上皮细胞生物过程的改变。
李纳[2]（2021）在《生物钟基因Bmal1敲除对糖尿病小鼠心肌纤维化的影响》文中认为目的:探讨生物钟基因Bmal1基因敲除对糖尿病小鼠心肌纤维化的加重作用。方法:12只野生型C57BL/6小鼠和12只Bmal1基因敲除C57BL/6小鼠随机分为野生型对照组（WT组）、野生型DM组（WT-DM组）、基因敲除型对照组（KO组）及基因敲除型DM组（KO-DM组）,每组6只。采用链脲佐菌素（STZ）连续腹腔注射5天,剂量为50mg/kg/天,建立1型DM小鼠模型。鼠龄和性别匹配的对照组腹腔注射等体积的PBS溶液。干预8周后做超声心动图测定心功能,测小鼠体重及血糖,然后处死小鼠,取心肌组织,HE染色观察小鼠心脏组织形态及病理变化,Masson染色观察小鼠心脏组织胶原纤维表达情况。Western blotting检测各组小鼠心肌TGF-β1和Smad 2、MMPl/TIMPl、MMPl3和MMPl4的表达。结果:1.与WT组相比,WT-DM组小鼠成模后体重下降,血糖升高（P<0.05）;与WT-DM组相比,KO-DM组小鼠成模后体重下降,血糖升高（P<0.05）;2.与WT-DM组相比,KO-DM组小鼠肌组织胶原表达量增加,心肌间质出现明显纤维化,左室短轴缩短率（FS）减小,射血分数（EF）及心输出量（CO）降低,心搏量（SV）下降（P<0.05）;3.与WT相比,BMAL1蛋白表达下降,TGF-β1和Smad2表达升高,MMPl/TIMPl比值发生显着改变,MMP13、MMP14的含量表达明显上升（P<0.05）。结论:糖尿病小鼠心肌Bmal1表达降低,Bmal1基因敲除显着恶化了STZ诱发的心脏功能障碍和纤维化,Bmal1基因可能是糖尿病心肌病的治疗靶点之一。
李纳,陈志彦,王力杰,刘哲,郭炳彦,李拥军[3]（2021）在《Bmal1时钟基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定》文中进行了进一步梳理目的对Bmal1基因敲除小鼠进行繁育及基因型进行鉴定,为生物节律研究提供理想的动物模型。方法将引进的Bmal1基因敲除小鼠,以1雄2雌的合笼方式进行饲养繁殖,从仔鼠中提取鼠尾基因组DNA,PCR扩增目的基因片段,琼脂凝胶电泳进行基因结果判定,Western Blot检测心肌组织中Bmal1蛋白表达进行结果验证。结果 Bmal1-/-小鼠与Bmal1+/+小鼠相比,表型除体重外未见明显差异,纯合敲除小鼠丧失繁殖能力; Bmal1-/-小鼠24 h血糖节律改变,Bmal1基因敲除小鼠繁育成功,获得一批基因敲除鼠。结论应用PCR法可成功鉴定Bmal1基因敲除纯合小鼠,PCR扩增法是检测小鼠基因的有效方法。
吴倩[4]（2020）在《用CRISPR/Cas9技术构建TOX2基因敲除小鼠模型并对其进行初步分析》文中研究表明研究目的:TOX2是一种转录因子,属于TOX家族。虽然TOX2已被证明在NK细胞的发育过程中发挥重要的作用,但对TOX2在淋巴细胞发育过程中的作用仍知之甚少。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TOX2基因敲除小鼠模型,能对其功能和作用进行深入研究。研究方法:具有设计简单,效率高等优点的CRISPR/Cas9基因编辑技术成为了目前发展最为迅速的基因编辑技术。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了TOX2基因敲除小鼠。首先,根据CRISPR/Cas9基因编辑技术的相关原理,设计了特异性的sg RNA（single guide RNA）,并将sg RNA连接到PX459质粒载体上。在体外和细胞水平,对sg RNA的有效性进行验证。将证实有效的重组质粒注射到小鼠受精卵中,待其稳定遗传并得到纯合子小鼠后,对纯合子小鼠进行初步分析。研究结果:本研究中,共设计了3个sg RNA。经体外和细胞水平验证,证实sg RNA1和sg RNA2的效果较好。然后通过原核显微注射,得到了TOX2基因敲除小鼠,并能够稳定遗传,TOX2基因敲除小鼠得以成功构建。运用流式细胞术对TOX2基因敲除小鼠的淋巴细胞及其亚群的数据进行分析,结果显示均无明显变化。结论:经分析显示,在小鼠中的TOX2基因对T、B淋巴细胞的发育没有明显影响。而成功构建TOX2基因敲除小鼠模型对进一步研究TOX2基因的功能提供了重要基础。
饶必林[5]（2020）在《TGIF1基因敲除小鼠模型的构建及表型分析》文中指出转化生长相互作用因子1（Transforming growth-interacting factor-1,TGIF1）是一种转录抑制因子,可以调节视黄酸（Retinoic acid,RA）和转化生长因子（Transforming growth factorβ,TGF-β）信号通路。参与小鼠胚胎发育,骨髓分化及脂质代谢等过程。在人类中,TGIF1的突变可能导致人类遗传病前脑无裂畸形（Holoprosencephaly,HPE）的发生。TGIF1的突变亦通过不同途径促进多种恶性肿瘤的发展和转移。已有研究表明TGIF1调节的TGF-β信号传导对T细胞和B细胞的分化和功能具有调节作用,且TGIF1在淋巴细胞高表达,但其在免疫系统中的功能仍不详。在这里,我们探究了Tgif1基因敲除对小鼠免疫细胞功能的影响。本研究利用CRISPR/Cas9及显微注射技术构建C57BL/6J系Tgif1基因敲除小鼠模型,并使用流式细胞术分析Tgif1基因敲除小鼠中各类型T、B细胞与野生型小鼠的差异。我们发现,相比于野生型小鼠,体型正常的Tgif1-/-小鼠各免疫器官中T、B细胞各亚群和自然杀伤细胞等免疫细胞无显着差异。但是,约30%的Tgif1-/-小鼠出现磨牙功能障碍,致使其体型瘦弱,这或许与多篇文章指出的Tgif1基因敲除将导致小鼠左右不对称相符合。磨牙功能障碍的Tgif1-/-小鼠多种淋巴细胞亚群相较于野生型小鼠发生明显变化,包括成熟B细胞、未成熟B细胞和T细胞等。但磨牙缺陷小鼠出现的免疫细胞差异可能是由于饥饿产生的应激反应,在此我们不作深究。后续将采用免疫接种的方法来进一步探究Tgif1基因敲除对小鼠相关免疫细胞分化和功能的影响。
邬昊[6]（2020）在《miR-29c-3p通过DNMT3B参与Hippo信号通路调控肝癌恶性生物学行为的机制研究》文中研究表明目的:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌（primary liver carcinoma,PLC）的重要组成部分,也是临床上最常见的恶性肿瘤之一,每年造成788000人死亡[1]。同时,肝细胞肝癌也是我国肿瘤死亡的主要原因,患者就诊时多为中晚期,并伴有肝内、外转移,预后较差[2]。肿瘤的复发与转移仍是导致肝细胞肝癌治疗失败的主要原因,给家庭及社会造成沉重负担。重要的是,肝细胞肝癌的发生发展是一个涉及多个信号通路的复杂病理生理过程。因此,迫切需要找到肝细胞肝癌发生发展的关键分子靶点及信号通路,为防控肝细胞肝癌提供精准的方向,并改善肝细胞肝癌患者的生存质量。Micro RNA（miRNA）是一类长度为20-24nt的单链非编码小RNA,以序列特异性方式结合靶基因的m RNA转录物,导致相应m RNA的降解或翻译抑制,并调控靶基因的表达[3]。最新研究表明,在多种疾病中均能发现miRNAs表达异常,这些表达异常的miRNAs被认为与肿瘤的恶性发生发展有关[4]。大量的科学研究表明,miR-29c-3p作为miRNAs重要成员在肿瘤的发生发展中扮演了重要的角色。然而,miR-29c-3p在肝细胞肝癌中的表达与作用还尚不明确,其通过哪些信号通路参与了肝细胞肝癌的的恶性生物学行为还不得而知。在本研究中,我们将分析miR-29c-3p在肝细胞肝癌中的表达及与患者临床病理特征和预后之间的联系,研究miR-29c-3p及其靶基因在肝细胞肝癌恶性生物学行为中的作用,进一步找到miR-29c-3p通过具体的信号通路调控肝细胞肝癌的恶性生物学行为的分子机制。本研究将为肝细胞肝癌的精准诊断与治疗提供一定的科学理论依据。方法:1.通过荧光定量PCR与miRNA原位杂交方法检测miR-29c-3p在肝细胞肝癌肿瘤组织和配对癌旁组织中的表达水平。利用Kaplan-Meier生存分析、单因素和多因素Logistic回归分析miR-29c-3p的表达水平与肝细胞肝癌患者不良预后之间的联系。荧光定量PCR检测miR-29c-3p在不同肝癌细胞系中的表达水平。2.采用人工合成pre-miR-29c-3p和miR-29c-3p inhibitor干扰miR-29c-3p的表达水平。采用Ed U增殖,细胞克隆和CCK8实验检测干扰miR-29c-3p表达后对Hep G2与MHCC-97H细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验检测干扰miR-29c-3p表达后对Hep G2与MHCC-97H细胞迁移能力的影响。采用甲基化特异性PCR与亚硫酸氢盐测序法检测干扰miR-29c-3p表达后对Hep G2与MHCC-97H细胞中LATS1基因DNA甲基化水平的影响。构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察在干扰miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞在裸鼠皮下移植瘤生长的影响。3.使用生物信息学在线网站寻找并验证miR-29c-3p的下游靶基因。荧光素酶标记实验验证miR-29c-3p与下游靶基因DNMT3B的结合作用。采用Ed U增殖,细胞克隆和CCK8实验检测在过表达miR-29c-3p的细胞中过表达DNMT3B对Hep G2与MHCC-97H细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验检测在过表达miR-29c-3p的细胞中过表达DNMT3B对Hep G2与MHCC-97H细胞迁移能力的影响。采用甲基化特异性PCR检测在过表达miR-29c-3p的细胞中过表达DNMT3B对Hep G2与MHCC-97H细胞中LATS1基因DNA甲基化水平的影响。采用western blot检测在过表达miR-29c-3p的细胞中过表达DNMT3B对Hippo信号通路表达的影响。结果:1.miR-29c-3p在77.6%的肝细胞肝癌肿瘤组织中存在低表达的情况,而miR-29c-3p在68.9%的配对癌旁组织中存在高表达的情况,统计学分析表明miR-29c-3p在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平明显低于配对癌旁组织（P<0.05）。统计学分析发现miR-29c-3p的表达与肿瘤大小（P=0.018）、肿瘤个数（P=0.011）和肝内转移（P=0.035）密切相关。miR-29c-3p低表达的肝细胞肝癌患者术后总体生存时间显着缩短,低表达miR-29c-3p是肝细胞肝癌患者预后较差的独立危险因素。2.荧光定量PCR结果显示在肝癌细胞系SMMC-7721、Huh-7、MHCC-97H和Hep G2细胞中miR-29c-3p表达水平显着低于LO2;其中MHCC-97H表达水平最低。CCK8细胞增殖实验、Edu摄取实验与克隆形成实验结果提示有效提高miR-29c-3p的表达后肝癌细胞的细胞增殖能力、Edu摄取能力与细胞克隆形成率均显着低于对照组,统计学分析表明提高miR-29c-3p的表达能够显着抑制Hep G2与MHCC-97H细胞的增殖能力。细胞划痕实验结果提示有效提高miR-29c-3p的表达后肝癌细胞的细胞划痕宽度显着大于对照组,统计学分析表明提高miR-29c-3p的表达能够显着抑制Hep G2与MHCC-97H细胞的迁移能力。动物模型结果提示有效提高miR-29c-3p的表达后肝癌细胞在裸鼠皮下移植瘤的形成与生长水平显着低于对照组,统计学分析表明提高miR-29c-3p的表达能够显着抑制Hep G2与MHCC-97H细胞的裸鼠皮下移植瘤的形成与生长。WB结果显示有效提高miR-29c-3p表达后LATS1,p-YAPs127,BAX的表达水平显着高于对照组,而YAP,BCL-2,KI-67的表达水平显着低于对照组,统计学分析表明提高miR-29c-3p的表达能够显着促进Hep G2与MHCC-97H细胞中Hippo信号通路的表达。3.生物信息学在线网站与荧光素酶标记实验证实DNMT3B为miR-29c-3p的有效靶基因。甲基化特异性PCR结果提示有效提高miR-29c-3p表达后LATS1基因的DNA甲基化水平显着降低,并且过表达DNMT3B后LATS1基因的DNA甲基化水平显着得到恢复与提高,统计学分析表明过表达DNMT3B能够部分逆转由过表达miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞中LATS1基因DNA甲基化水平的抑制作用。CCK8细胞增殖实验、Edu摄取实验与克隆形成实验结果提示在过表达miR-29c-3p的肝癌细胞中有效提高DNMT3B的表达后肝癌细胞的细胞增殖能力、Edu摄取能力与细胞克隆形成率均显着高于对照组,统计学分析表明过表达DNMT3B能够部分逆转由过表达miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞增殖能力的抑制。细胞划痕实验结果提示在过表达miR-29c-3p的肝癌细胞中有效提高DNMT3B的表达后肝癌细胞的细胞划痕宽度显着低于对照组,统计学分析表明过表达DNMT3B能够部分逆转由过表达miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞迁移能力的抑制。WB结果显示在过表达miR-29c-3p的肝癌细胞中有效提高DNMT3B的表达后YAP,BCL-2,KI-67的表达水平显着高于对照组,LATS1,p-YAPs127,BAX的表达水平显着低于对照组,统计学分析表明过表达DNMT3B能够部分逆转由过表达miR-29c-3p对Hep G2与MHCC-97H细胞中Hippo信号通路表达的促进作用。免疫组化结果提示DNMT3B在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平显着高于配对癌旁组织,预后统计学分析表明高表达DNMT3B的肝癌患者预后较差（P<0.05）。免疫组化结果提示LATS1在肝细胞肝癌肿瘤组织中的表达水平显着低于配对癌旁组织,预后统计学分析表明低表达LATS1的肝癌患者预后较差（P<0.05）。结论:1.miR-29c-3p在肝癌患者中的低表达与肝细胞肝癌患者预后呈显着相关性,是肝细胞肝癌患者预后的独立危险因素。2.miR-29c-3p通过DNMT3B调控LATS1基因的DNA甲基化水平及其蛋白表达水平。3.miR-29c-3p通过DNMT3B影响LATS1的表达并参与Hippo信号通路对肝细胞肝癌恶性生物学行为的调控。
张仙玉[7]（2020）在《内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究》文中研究表明猪肉是我国居民肉类消费的主要来源。在现代养猪生产中,顶级种公猪通过人工授精技术可繁殖大量后代,对于提高养殖效益和经济效益发挥着重大作用。如何能大量复制顶级种公猪或其遗传物质?体细胞克隆是当前的主要技术手段,但由于克隆动物的效率低,限制了这一技术的规模化应用。将外源精原干细胞（SSCs）移植到自身无SSCs生精能力的受体睾丸中产生精子,这是一个类似于动物克隆技术,实现外源遗传物质完全复制的新途径。本文的目的是,研究制备自身SSCs消融但能利用外源SSCs生产精子的受体模型动物,为下一步建立替代克隆技术复制供体动物遗传物质的新体系打下坚实基础。全文主要研究内容包括:采用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠的ETV5基因,制备小鼠模型,将体外培养的正常SSCs移植到小鼠模型睾丸中,观察精子的发生,评估该技术的可行性,进一步制备ETV5基因敲除猪动物模型。全文主要结果如下:1、ETV5基因敲除小鼠的制备:（1）通过CRISPR/Cas9系统敲除了小鼠ETV5基因后,纯合敲除的公鼠(ETV5-/-),从3周龄开始,其睾丸明显比野生型（WT）要小,睾丸重也显着低于WT（P<0.01）。（2）ETV5-/-小鼠睾丸生殖细胞渐行性丢失,到12周龄生殖细胞丢失殆尽,出现唯支持细胞综合症。（3）性成熟后ETV5-/-小鼠睾酮含量显着低于WT（P<0.01）,附睾中精子在12周龄丢失殆尽,且丧失了繁殖后代的能力。（4）ETV5基因杂合敲除的小鼠,其睾丸形态和发育均与WT小鼠无差别,生育能力正常。2、小鼠SSCs体外培养体系的建立:（1）通过两步酶消化法能得到活力99%以上的睾丸单细胞悬液,通过差速贴壁法获得纯度79%以上的SSCs。（2）丝裂霉素C处理之后的小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层,Stem Pro-34（含SFM）作为基础培养基,添加GDNF、LIF、b FGF、IGF1生长因子的复合培养体系,能支持SSCs的体外增殖与长期培养。（3）小鼠SSCs能正常冻存与复苏,在体外培养与富集后用AKP免疫染色和PLZF免疫荧光均可观察到大量阳性克隆集落。用RT-PCR和Q-PCR检测SSCs中标志基因的表达水平,均显示SSCs可在体外稳定培养增殖并维持干性。3、小鼠SSCs移植:（1）幼鼠(3周龄的ETV5-/-小鼠)作为移植受体比成鼠(7周龄的ETV5-/-小鼠)易于重启外源精子的发生。移植后2个月,幼鼠睾丸中全部恢复了精子的发生,精子统计数约为9.58±5.05×104,而成鼠受体睾丸中无精子发生的恢复。（2）荧光显微镜下,幼鼠受体附睾中产生的精子头部发出绿光,说明精子来源于外源供体的SSCs（移植前用慢病毒感染使其带有EGFP报告基因）。精液中外源基因EGFP和ETV5的表达,进一步说明恢复的精子来源于外源供体的SSCs,而非内源产生。4、ETV5基因敲除猪动物模型探讨:（1）用构建成功的p X330-g RNA质粒转染莱芜猪胎儿成纤维细胞,敲除效率约为41.92%。（2）通过体细胞核移植得到8头新生克隆猪,基因型检测显示ETV5基因在靶位点被敲除,Western blot结果证实了ETV5蛋白的丢失。（3）睾丸组织切片的H.E.染色和UCHL-1蛋白的表达显示,1月龄的ETV5-/-公猪曲细精管的形态和生殖细胞与WT公猪几乎无差异。但2.5月龄的ETV5-/-公猪曲细精管管腔中央的生殖细胞有消融的趋势。另外,UCHL-1蛋白标记的阳性SSCs细胞比WT睾丸中要少。这些结果说明ETV5基因的敲除影响猪生殖细胞的发育。综上所述,本研究制备了ETV5基因纯合敲除后生殖细胞消融且无生育能力的受体小鼠;随后进行外源正常的精原干细胞移植,受体小鼠的生精能力得以恢复;最后将小鼠上构建的方法体系借鉴应用于猪受体模型的制备。目的为家畜优质个体遗传物质大量复制,物种的保种和精原干细胞研究等提供科学依据。
赵微[8]（2020）在《热休克转录因子2在DSS结肠炎小鼠黏膜屏障功能中的作用研究》文中研究说明[背景]溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）是一种病因不清,难以治愈的慢性复发性结肠炎症性疾病,主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液血便等,因其病程冗长,反复发作且无法彻底治愈,严重影响患者的身心健康,并给家庭及社会带来较大负担。近年来,UC的发病率在世界范围内呈快速增长趋势。本课题组前期研究发现,热休克转录因子2（Heat shock transcription factors 2,HSF2）在UC患者中高表达,并与疾病严重程度呈正相关,在细胞实验中发现HSF2可上调细胞紧密连接蛋白Occludin,提示其可能参与调控UC黏膜屏障功能。目前,HSF2在UC发病机制中的作用尚未明确,且尚无关于HSF2在UC中与黏膜屏障功能关系的研究。本实验拟首先建立Hsf2基因敲除小鼠,然后研究Hsf2基因缺失对葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate,DSS）诱导的小鼠肠道炎症及黏膜屏障功能的影响,进一步揭示其在UC发生发展中的作用。[目的]首先通过CRISPR/Cas9技术建立Hsf2基因敲除纯合子转基因小鼠。其次,利用DSS诱导小鼠形成结肠炎模型,观察小鼠疾病活动指数（Disease activity index,DAI）、肠道损伤情况、肠道缩短程度、脾脏体积变化等,综合评估Hsf2对DSS小鼠结肠炎模型炎症反应的影响。最后,检测小鼠结肠组织内黏膜屏障相关蛋白:紧密连接蛋白Occludin、Zonalu Occluden-1（ZO-1）的基因转录水平及蛋白表达水平,从动物水平层面探讨Hsf2对肠黏膜屏障功能的影响。[方法]本研究分为两部分第一部分:Hsf2基因敲除小鼠的建系第二部分:Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道炎症及肠黏膜屏障功能的作用机制研究第一部分:Hsf2基因敲除小鼠的建系1、Hsf2基因敲除小鼠的建立:运用CRISPR/Cas9技术及显微注射方法,基本步骤包括:1)根据目标基因,在体外设计构建单链向导RNA（single guide RNA,sgRNA）和Cas9 mRNA;2)将sgRNA和Cas9 mRNA通过显微注射方法注射到受精卵雄性原核;3)将胚胎转移至假妊娠雌鼠输卵管中继续发育至分娩,得到Hsf2基因敲除的杂合子小鼠,采用PCR及测序方法对小鼠进行鉴定筛选,培育出F0代Hsp基因敲除杂合子小鼠。该实验引入通过此技术构建的Hsf2+/-小鼠F0代杂合子小鼠4只,进行保种及繁育。2、繁育及Hsf2基因敲除纯合子小鼠建系:选择周龄为7-8周的SPF级别C57BL/6基因敲除（Knock out,KO）小鼠及野生型（Wild type,WT）小鼠进行配种,合笼比例雄:雌为1:2或1:3,合笼至检查到雌性小鼠阴道出现阴道栓,提出雄鼠,单独饲养雌性小鼠至生育,采用PCR技术鉴定出Hsf2-/-小鼠,再用RT-PCR、Western Blot检测Hsf2基因转录水平及蛋白表达水平,验证敲除效果,建立纯合子Hsf2基因敲除小鼠。第二部分:Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道炎症及肠黏膜屏障功能的作用机制研究1、分组:选取健康SPF级C57BL/6小鼠进行实验。按照Hsf2基因是否敲除,将小鼠分为野生型组（WT组,16只）及基因敲除组（KO组,16只）,采用RT-PCR及Western Blot技术验证敲除效果,予DSS诱导小鼠结肠炎造模,将上述两组分别组内随机分组为WT对照组（WT+H2O组,8只）、WT造模组（WT+DSS组,8只）,KO对照组（KO+H2O组,8只）、KO造模组（KO+DSS组,8只）。2、DSS诱导结肠炎模型:造模组于实验第一天早上8点开始饮用含有2.5%DSS溶液的蒸馏水,对照组同时自由饮用蒸馏水,均连续饮用7天,第8日上午乙醚麻醉后予颈椎脱臼法处死小鼠,手术取小鼠结肠标本。3、Hsf2对DSS小鼠肠道炎症的作用:实验期间每天记录各组小鼠体重、大便潜血、进食、精神、活动、毛发光泽情况,根据体重变化、大便情况和便血情况评估疾病活动指数（Disease activity index,DAI）,观察结肠组织大体标本,测量结肠长度和重量,脾脏长度及重量,结肠组织HE染色后进行病理学评分,综合评估肠道炎症程度。4、Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道黏膜屏障功能机制探索:RT-RCR及免疫组织化学检测结肠组织黏膜屏障相关蛋白中的紧密连接蛋白Occludin、Zonalu Occluden-1（ZO-1）的基因转录及蛋白表达水平。[结果]第一部分:Hsf2基因敲除小鼠的建系1、成功建立Hsf2基因敲除纯合子小鼠。采用RT-PCR、Western Blot对鉴定为Hsf2-/-小鼠验证其敲除效果,结果提示:KO组小鼠Hsf2基因转录水平及蛋白表达水平较WT组小鼠均明显降低,成功建立Hsf2基因敲除纯合子小鼠。2、Hsf2-/-小鼠生长正常,体重与同龄KO小鼠相近,成活率高,无畸形,且能正常受孕、正常繁殖后代。第二部分:Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道炎症及肠黏膜屏障功能作用机制的研究1、DSS成功诱导小鼠结肠炎模型。对比各组,KO+DSS组炎症反应最剧烈,小鼠血便最明显,体重降低最多,DAI评分、结肠大体评分最高,结肠缩短程度最明显,脾脏增大最明显;HE染色提示KO+DSS组小鼠结肠组织炎症反应最剧烈,结构破坏最显着,病理评分最高。各组间差异具有统计学意义。2、DSS造模后,紧密连接蛋白Occludin、ZO-1基因转录水平及蛋白表达水平降低。比较各组结肠组织紧密连接蛋白Occludin、ZO-1基因转录水平及免疫组化蛋白表达,结果提示,与对照组相比,模型组Occludin和ZO-1基因转录水平、蛋白表达水平明显降低,以KO+DSS组最为明显。各组间差异具有统计学意义。[结论]1、运用CRISPR/Cas9技术及显微注射方法,获得稳定的Hsf2-/-小鼠,Hsf2基因敲除后不影响小鼠成活率,无畸形发生,且能正常生长,可能会对繁殖有影响,成活小鼠能耐受DSS,成功构建Hsf2基因敲除小鼠。2、2.5%DSS可成功诱导小鼠实验性结肠炎模型。2.5%DSS诱导造模后,小鼠出现体重下降、便血等症状,造模期间无小鼠死亡,均能耐受该浓度DSS;处死后获取小鼠结肠组织,DSS造模组炎症更明显。3、Hsf2基因敲除后,小鼠对DSS诱导的结肠炎更敏感。低水平Hsf2小鼠经DSS诱导结肠炎症后,小鼠DAI评分明显升高,结肠组织炎症反应更加明显。4、Hsf2基因敲除后,小鼠肠上皮紧密连接蛋白Occludin和ZO-1基因转录水平及蛋白表达下降,提示Hsf2可能参与调控小鼠肠黏膜屏障功能。
吴婷[9]（2020）在《F-box蛋白Cdc4对新型隐球菌有性生殖和致病性的影响》文中指出隐球菌性脑膜炎（Cryptococcal Meningitis）是一种严重危害人类生命健康且不能被有效治疗的真菌疾病。普遍存在于环境中的干燥隐球菌菌体及其担孢子,可通过呼吸道吸入并侵染免疫力缺陷或低下人群,如AIDS患者、癌症患者、器官移植患者或新型冠状病毒肺炎患者等。此类人群由于免疫系统不健全而不能对吸入的隐球菌进行有效清除进而导致隐球菌侵袭肺部,而后隐球菌又随血液循环侵染人体其他器官,最终穿透血脑屏障感染中枢神经系统,引发致命的隐球菌性脑膜炎,导致每年数十万人死亡。对新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）形态发育及毒力机制进行深入解析有助于我们寻找新的药物靶点并用于隐球菌病治疗。F-box蛋白所参与的泛素蛋白系统特异性地降解真核细胞内的大多数蛋白,其中底物蛋白的特异性降解由F-box蛋白决定。F-box蛋白对维持生物体生理稳态至关重要,不仅影响动植物的生长发育,与癌症、糖脂紊乱等相关疾病的研究治疗息息相关,并且在真菌生长、有性生殖、毒力等方面也扮演着非常重要的角色。本课题对新型隐球菌F-box蛋白Cdc4时空表达和其在新型隐球菌形态发育、逆境胁迫以及致病性中的作用进行了探究,得到了以下结果:1.CDC4基因鉴定与时空表达分析我们对CDC4进行基因序列分析发现:CDC4基因编码区全长3126 bp,包含3个内含子和4个外显子,编码一全长为991个氨基酸的蛋白Cdc4;对Cdc4进行蛋白结构域预测分析发现其含有1个F-box蛋白结构域和8个WD40结构域,表明Cdc4为典型的F-box蛋白。接着,我们对新型隐球菌F-box蛋白Cdc4进行时空表达分析:在Cdc4空间定位分析中,通过荧光观察GFP-Cdc4融合表达菌株发现绿色荧光在GFP-Cdc4菌株的细胞核与细胞膜上均有定位,且不因压力应激条件的影响发生转移;GFP-Cdc4菌株交配实验发现绿色荧光定位于交配菌丝、担子头以及担孢子的细胞核和细胞膜上,进一步说明Cdc4在新型隐球菌中定位于细胞核和细胞膜。通过qRT-PCR方法和构建PCDC4-mCherry菌株诱导交配,分析了CDC4在新型隐球菌交配早期以及各发育时期的表达情况,结果发现CDC4在新型隐球菌交配早期以及在交配菌丝、担子头和担孢子形态均有表达,且在交配早期的表达呈先升高后下降的趋势,由此推测CDC4可能在新型隐球菌交配过程中发挥作用。2.CDC4基因敲除、互补及超表达菌株表型分析为进一步研究Cdc4的功能,我们构建了cdc4Δ突变体菌株、CDC4互补菌株以及CDC4OE超表达菌株来探究Cdc4在新型隐球菌逆境胁迫、有性生殖以及致病性中的作用。经典毒力因子检测发现隐球菌野生型菌株、cdc4Δ突变体菌株、CDC4互补菌株及CDC4超表达菌株在荚膜形成、色素产生以及37oC条件下生长没有显着差异,表明CDC4基因不影响新型隐球菌三种经典毒力因子的形成。在应激压力检测中,我们发现CDC4OE超表达菌株对SDS敏感,但对刚果红不敏感,表明CDC4过表达会影响新型隐球菌细胞膜的完整性。交配实验发现cdc4Δ突变体菌株交配后能产生菌丝和担子,但不能产生担孢子,表明CDC4基因缺失后新型隐球菌有性产孢过程受阻,推测CDC4基因在新型隐球菌有性生殖过程中扮演重要角色。为此,我们构建了核定位的Nop1-mCherry荧光菌株对cdc4Δ突变体菌株交配产孢受阻原因进行初步探究,通过荧光共聚焦观察交配过程中细胞核发育情况,发现CDC4缺失后新型隐球菌交配产生的担子内只有1个或2个细胞核。由此推测,CDC4缺失后新型隐球菌在交配过程中只能进行细胞核融合但不能进行细胞核分裂导致减数分裂过程受阻,最终导致不能产生4条担孢子链,从而影响了新型隐球菌的有性生殖过程。3.小鼠致病性分析小鼠致病性实验发现感染cdc4Δ突变体菌株的小鼠在实验终止时（接种后80天）全部存活且未发病;CFU统计和组织切片结果发现感染cdc4Δ突变体菌株的小鼠肺部有少量隐球菌细胞存在,但肺泡组织未遭到破坏,脑部和脾部则没有发现隐球菌细胞以及遭到破坏的痕迹。对感染cdc4Δ突变体菌株不同时间的小鼠进行肺部CFU统计和组织切片观察,结果发现随着时间的推移,感染野生型菌株的小鼠肺部组织载菌量是呈上升趋势,且肺部组织破坏严重;与之相反,感染cdc4Δ突变体菌株的小鼠肺部组织的载菌量维持在一个较低且持久水平,且小鼠肺部组织依然保持完整。这些结果表明cdc4Δ突变体菌株致病性丧失。综上所述,CDC4基因缺失导致新型隐球菌丧失交配后产孢能力和致病性,表明F-box蛋白Cdc4在新型隐球菌的有性生殖及致病性中发挥重要的作用。
陈健[10]（2019）在《NIH被毛突变小鼠生物学特性研究及Hr基因敲除小鼠制备》文中提出自发基因突变是获得新的小鼠模型的重要途径。由于缺少了人为因素的干扰,自发基因突变小鼠模型突变疾病发生的过程与相应人类疾病的发生过程更加接近,因此自发基因突变小鼠模型非常适合于相关人类疾病的研究。NIH小鼠是一种来源于Swiss小鼠的封闭群鼠种,相同来源的有ICR、KM小鼠。NIH被毛突变小鼠是本实验室在NIH小鼠繁育过程中发现的自发突变小鼠,其表型主要表现为被毛稀疏、无胡须。在出生后第一个毛发生长期出现异常,出生7 d后,同正常小鼠在表型上表现出明显差异;正常小鼠被毛逐渐浓密、白色毛发已覆盖完全,而被毛突变小鼠仍然呈现全身裸露的状态。随着时间的推进,被毛突变小鼠出现了无毛-稀毛-无毛的表型变化。在5-6周龄也就是第二个毛发生长周期的生长期的中后期,两种小鼠呈现出了表型差异的最大化。该小鼠有胸腺,可以在屏障环境里进行饲养;后期能够出现自发肿瘤;免疫水平发生改变。自2007年本实验室发现该突变小鼠以来,通过10余年的近交繁育,已建立了突变表型稳定遗传的实验动物新种群。本研究通过近交繁育方法建立了被毛突变小鼠近交系种群,分析了突变小鼠种群的表型及生物学特性;进而应用全基因组重测序技术分析了被毛突变小鼠基因组信息,通过SNP位点和Indel位点与被毛突变表型进行关联分析,解析Hr基因与被毛突变表型的相关性;利用CRISPR/Cas9技术,大片段敲除Hr基因exon3-7,获得F0代嵌合体小鼠;将其与正常小鼠交配后得到F1代杂合子,建立可稳定遗传的Hr基因敲除小鼠种群。结果表明:1.NIH小鼠被毛突变是由隐性基因控制的突变。同正常小鼠相比,被毛突变种群雌性小鼠肝、脾、肺、左肾、胸腺、卵巢和子宫脏器系数存在显着差异;雄性小鼠心、肺、左右肾、胸腺和精囊腺脏器系数存在显着差异。被毛突变小鼠血清氨基转移酶（ALT和AST）、尿酸、甘油三酯（TG）升高,差异显着。突变小鼠的红细胞、血红蛋白、红细胞压积、LY淋巴细胞及其比例显着降低（p<0.05）;单增李斯特杆菌感染前后被毛突变小鼠CD3+CD4+/CD3+CD8+比值均明显低于正常小鼠（p<0.05）。2.在体成瘤实验结果显示,黑色素瘤在被毛突变小鼠体内保持着较好的生长状态及侵袭能力;葡萄糖耐量实验结果显示,被毛突变小鼠糖耐量增高,差异显着。表明被毛突变小鼠适合开展糖代谢和肿瘤相关的药物筛选研究。行为学结果表明,NIH被毛突变小鼠的学习记忆能力增强,可用于相关神经认知的药物筛选研究。3.被毛突变小鼠与正常小鼠共有991844个SNP位点存在差异,关联最高的SNP区间包含345个基因,涉及47条生物学通路;共有341082个Small In Del差异位点,关联最高的Small In Del区间包含518个基因,涉及55条生物学通路。5.首次利用CRISPR/Cas9技术,获得了Hr基因exon3-7大片段敲除的F0代嵌合体小鼠,表型为被毛发育异常。6.通过F0代嵌合鼠与正常小鼠交配获得了F1代杂合子小鼠种群。F1代杂合子小鼠阳性率为14.3%。综上所述,本研究对被毛突变小鼠种群的表型及生物学特性进行了分析,基因组层面解析了Hr基因与被毛突变表型的相关性,获得了Hr基因大片段敲除的F0代嵌合体小鼠和F1代杂合子小鼠,为进一步解析被毛突变表型产生的生物学机制提供理论依据。
二、Lats1基因敲除小鼠保种的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Lats1基因敲除小鼠保种的研究（论文提纲范文）
（1）PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 H.pylori主要的致癌因子 |
| 1.3 H.pylori感染胃黏膜改变的关键分子PMEPA1 |
| 第2章 PMEPA1在胃癌组织中的表达、预后及其生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 临床组织标本及资料收集 |
| 2.1.2 生物信息学数据库 |
| 2.1.3 主要试剂耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 生物信息学数据挖掘 |
| 2.2.2 组织蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 2.2.3 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PMEPA1在胃癌组织中显着高表达 |
| 2.3.2 PMEPA1与胃癌患者预后的关系 |
| 2.3.3 PMEPA1诊断胃癌的临床价值 |
| 2.3.4 生物信息学预测PMEPA1可能参与胃癌的生物过程 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 H.pylori感染及其毒力因子对胃上皮细胞PMEPA1表达的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 临床组织标本收集 |
| 3.1.2 细胞系及实验菌株 |
| 3.1.3 质粒及感受态细胞 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.1.6 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 幽门螺杆菌的复苏、鉴定、传代 |
| 3.2.2 H.pylori7.13和PMSS1 oipA基因敲除菌株的构建 |
| 3.2.3 制备抗oipA重组抗原的免疫兔多克隆抗体 |
| 3.2.4 细胞培养及细菌细胞共培养模型的构建 |
| 3.2.5 蛋白提取、BCA定量及免疫印迹实验 |
| 3.2.6 RNA提取、逆转录及荧光定量PCR实验 |
| 3.2.7 石蜡切片及免疫组织化学 |
| 3.2.8 细胞转录组学 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Hp7.13和PMSS1 菌株的oipA基因敲除菌株的构建及鉴定 |
| 3.3.2 H.pylori感染上调胃上皮细胞中PMEPA1的表达水平 |
| 3.3.3 H.pylori cag A和 oipA影响胃上皮细胞PMEPA1的表达 |
| 3.3.4 PMEPA1在不同胃黏膜病变阶段的表达及与H.pylori感染的关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮细胞生物学行为的影响及机制 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 慢病毒稳转细胞株的构建 |
| 4.2.2 CCK8 细胞增殖实验 |
| 4.2.3 实时无标记细胞增殖实验 |
| 4.2.4 Transwell细胞迁移和侵袭实验 |
| 4.2.5 划痕修复实验 |
| 4.2.6 克隆形成实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 成功构建PMEPA1过表达和敲减稳转细胞株 |
| 4.3.2 PMEPA1对胃上皮和胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.3 PMEPA1对H.pylori感染的胃上皮和胃癌细胞的生物学行为的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 PMEPA1在H.pylori感染胃上皮细胞改变的转录组学研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞系及实验菌株 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞转录组测序流程 |
| 5.2.2 转录组测序数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 测序样品的RNA验证 |
| 5.3.2 PMEPA1过表达或敲减对胃上皮细胞和胃癌细胞转录水平的影响 |
| 5.3.3 Hp感染对过表达或敲减PMEPA1的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.3.4 PMEPA1对不同Hp菌株感染的胃上皮细胞转录水平的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 小结和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述一 PMEPA1在肿瘤中的作用及机制 |
| 参考文献 |
| 综述二 幽门螺杆菌外膜蛋白致病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）生物钟基因Bmal1敲除对糖尿病小鼠心肌纤维化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 生物钟基因在糖尿病心肌病中作用机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）Bmal1时钟基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 Bmal1基因敲除小鼠的饲养繁育 |
| 1.2.3 Bmal1敲除小鼠表型分析 |
| 1.2.4 Bmal1敲除小鼠鉴定 |
| 1.2.5 Western Blot检测心肌组织中Bmal1蛋白表达情况 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Bmal1敲除小鼠表型 |
| 2.1.1 小鼠外形特征 |
| 2.1.2 小鼠24 h血糖变化 |
| 2.2 小鼠繁殖情况 |
| 2.3 小鼠基因鉴定结果 |
| 2.4 敲除小鼠在心脏中Bmal1表达情况 |
| 3 讨论 |
（4）用CRISPR/Cas9技术构建TOX2基因敲除小鼠模型并对其进行初步分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一章 TOX2 基因敲除载体的构建及验证 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与载体 |
| 1.1.2 细胞系 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 基因敲除方案设计 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 敲除质粒的构建 |
| 1.2.3 细胞水平验证sg RNA的效果 |
| 1.2.4 体外水平验证sg RNA的效果 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 TOX2 基因敲除载体的构建结果 |
| 1.3.2 TOX2 基因重组质粒细胞转染效率 |
| 1.3.3 重组质粒细胞水平验证结果 |
| 1.3.4 sgRNA体外Cas9 酶切验证结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 TOX2 基因敲除小鼠模型的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 小鼠显微注射 |
| 2.2.2 小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 基因敲除小鼠子代鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 显微注射小鼠基因组PCR产物测序结果 |
| 2.3.2 显微注射小鼠TA克隆测序结果 |
| 2.3.3 显微注射小鼠氨基酸序列比对结果 |
| 2.3.4 TOX2 基因敲除小鼠的繁殖 |
| 2.3.5 TOX2 基因敲除小鼠F1 代小鼠基因型鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 TOX2 基因敲除小鼠的初步研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验小鼠和对照小鼠的选择 |
| 3.2.2 单细胞悬液的制备 |
| 3.2.3 抗体配色方案 |
| 3.2.4 免疫染色 |
| 3.2.5 结果分析方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 小鼠各器官及腹水细胞数变化情况 |
| 3.3.2 小鼠各器官中及腹水总B细胞变化情况 |
| 3.3.3 小鼠脾脏B细胞亚群变化情况 |
| 3.3.4 小鼠骨髓中B细胞亚群变化情况 |
| 3.3.5 小鼠淋巴结中B细胞亚群变化情况 |
| 3.3.6 小鼠腹水中B细胞亚群变化情况 |
| 3.3.7 小鼠各器官中CD4~+T 细胞与CD8~+T 细胞的比值的变化情况 |
| 3.3.8 小鼠脾脏中调节性T细胞(Regulatory cells,Tregs)的百分比的变化情况 |
| 3.3.9 小鼠脾脏中自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的变化情况 |
| 3.3.10 小鼠胸腺中DN期细胞各阶段的变化情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
（5）TGIF1基因敲除小鼠模型的构建及表型分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 TGIF1 的概述 |
| 1.1 TGIF1 功能异常相关疾病 |
| 1.2 TGIF1 调节相关的信号通路 |
| 1.3 TGIF1 的功能 |
| 2 TGIF1 研究目的和意义 |
| 3 CRISPR/CAS9 概述 |
| 第一章 Tgif1 基因敲除质粒的构建及有效性验证 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌体和载体 |
| 1.1.2 细胞系 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要溶液的配置 |
| 1.1.5 实验仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Tgif1-KO小鼠模型设计方法 |
| 1.2.2 Tgif1 敲除质粒的制备 |
| 1.2.3 细胞水平上验证重组质粒有效性 |
| 1.2.4 Cas9 体外酶切实验 |
| 1.3 结果与分析 |
| 1.3.1 敲除载体构建 |
| 1.3.2 PX459-Tgif1 敲除质粒细胞水平验证 |
| 1.3.3 体外验证sg RNA切割效率 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 Tgif1 基因敲除小鼠模型的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液的配置 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原核显微注射 |
| 2.2.2 转基因小鼠基因型初步鉴定 |
| 2.2.3 TA克隆 |
| 2.3 Tgif1 基因敲除小鼠的鉴定结果 |
| 2.3.1 F0 代小鼠基因型鉴定结果 |
| 2.3.2 F1 代小鼠基因型鉴定结果 |
| 2.3.3 F2 代小鼠基因型鉴定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 Tgif1 基因敲除小鼠表型初步分析(一) |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要溶液的配置 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 流式细胞术 |
| 3.3 正常Tgif1 基因敲除小鼠流式分析 |
| 3.3.1 各器官细胞总数情况 |
| 3.3.2 脾脏细胞流式分析 |
| 3.3.3 骨髓细胞流式分析 |
| 3.3.4 胸腺细胞流式分析 |
| 3.3.5 淋巴结细胞流式分析 |
| 3.3.6 腹水细胞流式分析 |
| 3.4 总结与讨论 |
| 第四章 Tgif1 基因敲除小鼠表型初步分析(二) |
| 4.1 Tgif1 基因敲除小鼠外观变化 |
| 4.2 外观缺陷Tgif1 基因敲除小鼠流式分析 |
| 4.2.1 磨牙缺陷小鼠脾脏细胞流式分析 |
| 4.2.2 磨牙缺陷小鼠骨髓细胞流式分析 |
| 4.2.3 磨牙缺陷小鼠胸腺细胞流式分析 |
| 4.2.4 磨牙缺陷小鼠淋巴结细胞流式分析 |
| 4.3 总结与分析 |
| 第五章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
（6）miR-29c-3p通过DNMT3B参与Hippo信号通路调控肝癌恶性生物学行为的机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩语名词略对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-29c-3p在肝癌中的表达与患者临床病理特征和预后的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 第二部分 miR-29c-3p对肝癌细胞增殖与迁移的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 第三部分 miR-29c-3p靶向DNMT3B参与Hippo信号通路对肝癌细胞增殖与迁移的调控 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（7）内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 精原干细胞的起源与精子发生 |
| 1.2.2 精原干细胞的应用 |
| 1.2.3 精原干细胞的移植 |
| 1.2.4 受体的制备 |
| 1.2.5 CRSPR/Cas9 技术的应用 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第二章 内源性精子发生消融的小鼠模型制备 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验设备与耗材 |
| 2.1.3 主要试剂与配置 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 F_0代小鼠获得及基因型鉴定 |
| 2.2.2 F_1代新生小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 Western blot鉴定ETV5 蛋白的缺失 |
| 2.2.4 不同基因型小鼠体重的检测 |
| 2.2.5 不同基因型小鼠睾丸重的检测 |
| 2.2.6 睾丸组织形态学比较 |
| 2.2.7 附睾中精子的检测 |
| 2.2.8 精子发生相关基因的表达 |
| 2.2.9 睾酮水平检测 |
| 2.2.10 繁殖能力 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 小鼠精原干细胞的分离培养与检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验设备与耗材 |
| 3.1.3 主要试剂与配置 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 用小鼠胎儿成纤维细胞制备饲养层细胞 |
| 3.2.2 两种饲养层培养SSCs细胞体外增殖的比较 |
| 3.2.3 精原干细胞的分离与纯化 |
| 3.2.4 添加不同生长因子对精原干细胞体外增殖的影响 |
| 3.2.5 精原干细胞体外增殖的碱性磷酸酶染色 |
| 3.2.6 精原干细胞体外增殖的免疫荧光染色 |
| 3.2.7 精原干细胞的标志基因表达检测 |
| 3.2.8 精原干细胞标志基因表达水平的实时定量检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 精原干细胞移植与精子来源的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验设备与耗材 |
| 4.1.3 主要试剂与配制 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SSCs的移植 |
| 4.2.2 移植后睾丸重量的检测 |
| 4.2.3 睾丸的组织形态观察(H.E.染色) |
| 4.2.4 睾丸切片的免疫组织化学分析 |
| 4.2.5 附睾精子的检测 |
| 4.2.6 精子来源的检测 |
| 4.2.7 精子发生相关基因的表达 |
| 4.2.8 繁殖能力评估 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 基因敲除猪受体模型的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验设备与耗材 |
| 5.1.3 主要试剂与配制 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 pX330-gRNA质粒的构建 |
| 5.2.2 质粒电转猪胎儿成纤维细胞 |
| 5.2.3 电转后单克隆细胞团的收取 |
| 5.2.4 单克隆细胞团敲除方式的鉴定 |
| 5.2.5 ETV5 基因纯合敲除细胞系的获得 |
| 5.2.6 SCNT制备ETV5 基因敲除克隆猪 |
| 5.2.7 新生克隆猪的基因型鉴定 |
| 5.2.8 新生克隆猪ETV5 蛋白Western blot鉴定 |
| 5.2.9 睾丸发育的组织形态检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 全文总结 |
| 6.1 全文总结与主要结论 |
| 6.2 主要创新点与后续工作 |
| 参考文献 |
| 附录1 主要英文对照缩略表 |
| 附录2 全文 RT-PCR(Q-PCR)引物序列 |
| 附录3 细胞系测序结果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）热休克转录因子2在DSS结肠炎小鼠黏膜屏障功能中的作用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Hsf2基因敲除小鼠的建系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Hsf2调控DSS结肠炎小鼠肠道炎症及肠黏膜屏障功能的作用机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 炎症性肠病实验动物模型 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）F-box蛋白Cdc4对新型隐球菌有性生殖和致病性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 新型隐球菌概述 |
| 1.1.1 隐球菌分类 |
| 1.1.2 新型隐球菌生活史 |
| 1.1.3 新型隐球菌毒力因子 |
| 1.2 隐球菌病的诊断与治疗 |
| 1.2.1 隐球菌病 |
| 1.2.2 隐球菌病的临床检测与药物治疗 |
| 1.2.3 隐球菌病的治疗 |
| 1.3 F-box蛋白 |
| 1.3.1 泛素化通路与F-box蛋白 |
| 1.3.2 F-box蛋白相关研究 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的与意义 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 研究路线 |
| 第3章 CDC4基因的鉴定及其时空表达模式分析 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 实验菌株与质粒载体 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 溶液与缓冲液的配制 |
| 3.1.5 培养基配制 |
| 3.1.6 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 CDC4基因鉴定与分析 |
| 3.2.2 新型隐球菌交配早期CDC4的表达情况 |
| 3.2.3 PCDC4-m Cherry荧光菌株的构建 |
| 3.2.4 CDC4在隐球菌各个发育阶段的表达情况 |
| 3.2.5 GFP-Cdc4 荧光菌株的构建 |
| 3.2.6 GFP-Cdc4 荧光融合蛋白在隐球菌中的定位观察 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第4章 CDC4基因缺失、互补以及超表达菌株的构建 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验菌株 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验试剂及相关溶液配制 |
| 4.1.4 培养基配制 |
| 4.1.5 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 α交配型CDC4基因敲除突变体的构建 |
| 4.2.2 a交配型CDC4基因敲除突变体的构建 |
| 4.2.3 互补菌株的构建 |
| 4.2.4 超表达菌株的构建 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第5章 cdc4Δ基因敲除突变体表型分析 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验菌株 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.1.4 培养基 |
| 5.1.5 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 经典毒力因子检测 |
| 5.2.2 应激表型分析 |
| 5.2.3 交配产孢观察 |
| 5.2.4 不产孢机理初步探究 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第6章 CDC4基因敲除突变体致病性分析 |
| 6.1 实验材料与方法 |
| 6.1.1 实验菌株 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 实验试剂 |
| 6.1.4 培养基 |
| 6.1.5 实验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 cdc4Δ突变体菌株致病性检测 |
| 6.2.2 cdc4Δ突变体菌株致病性丧失机理初探 |
| 6.3 结论与讨论 |
| 第7章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）NIH被毛突变小鼠生物学特性研究及Hr基因敲除小鼠制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 被毛突变小鼠及其研究进展 |
| 1 皮肤研究中的被毛突变小鼠 |
| 2 被毛突变性状的产生机制 |
| 3 被毛突变小鼠及毛囊微环境研究的进展 |
| 4 NIH新型被毛突变小鼠的发现及其表型特征 |
| 第2章 高通量测序技术在毛囊发育障碍方面的应用 |
| 1 高通量测序技术 |
| 2 高通量测序技术的应用 |
| 第3章 CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究进展 |
| 1 CRISPR/Cas9 技术作用原理 |
| 2 CRISPR/Cas9 技术应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 新型NIH被毛突变小鼠生物学特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 NIH被毛突变小鼠基因组序列差异分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 利用CRISPR/Cas9 技术制备Hr基因敲除小鼠模型 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、Lats1基因敲除小鼠保种的研究（论文参考文献）
- [1]PMEPA1在幽门螺杆菌致病中的作用及机制研究[D]. 赵巧云. 南昌大学, 2021(01)
- [2]生物钟基因Bmal1敲除对糖尿病小鼠心肌纤维化的影响[D]. 李纳. 河北医科大学, 2021(02)
- [3]Bmal1时钟基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定[J]. 李纳,陈志彦,王力杰,刘哲,郭炳彦,李拥军. 中国实验动物学报, 2021(01)
- [4]用CRISPR/Cas9技术构建TOX2基因敲除小鼠模型并对其进行初步分析[D]. 吴倩. 福建师范大学, 2020(12)
- [5]TGIF1基因敲除小鼠模型的构建及表型分析[D]. 饶必林. 福建师范大学, 2020(12)
- [6]miR-29c-3p通过DNMT3B参与Hippo信号通路调控肝癌恶性生物学行为的机制研究[D]. 邬昊. 重庆医科大学, 2020(01)
- [7]内源性精子消融的动物模型制备及精原干细胞移植研究[D]. 张仙玉. 湖南农业大学, 2020
- [8]热休克转录因子2在DSS结肠炎小鼠黏膜屏障功能中的作用研究[D]. 赵微. 昆明医科大学, 2020
- [9]F-box蛋白Cdc4对新型隐球菌有性生殖和致病性的影响[D]. 吴婷. 西南大学, 2020(01)
- [10]NIH被毛突变小鼠生物学特性研究及Hr基因敲除小鼠制备[D]. 陈健. 吉林大学, 2019(02)