一、TTV基因组的克隆与进化分析（论文文献综述）
王倩[1]（2021）在《云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究》文中指出[背景]蜱是最早被确认可将病原体传播给人类的媒介节肢动物,是世界上仅次于蚊子的第二大传染病媒介,可以感染、传播和贮存的病原体包括病毒、细菌和原虫等,且通常会同时携带多种病原体。病毒是蜱传病原体的重要组成部分。目前,已经从蜱中发现了至少160种病毒,其中25%左右与人类和/或动物的病毒感染性疾病有关,主要以各种硬蜱作为传播媒介。其中,正内罗病毒隶属于布尼亚病毒目、内罗病毒科,是有包膜且基因组不连续（由大、中和小三段单股负链组成）的RNA病毒,其中一些会引起人类和动物严重疾病。Tamdy正内罗病毒至少包括五种不同型别,其在多种蜱中广泛分布,且被报道与人类疾病以及脊椎动物感染有关。此外,还有近年来报道的与蜱咬病人发热疾病有关、属于黄病毒科荆门病毒群的荆门蜱病毒（Jingmen tick virus,JMTV）和Alongshan virus（ALSV）两种蜱传分节段RNA病毒,以及致病性尚未明确的新发蜱病毒 South Bay Virus（SBV）和 Black-legged tick phlebovirus（BTPV）等。目前,对这些新型蜱传病毒的研究相对较少,因此,有必要对其进行探索和研究。自1982年以来,我国大陆已经发现了由近30种不同蜱类传播的33种新发蜱传病原体,其中立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫等细菌和原虫最为常见,感染后可分别引起人和动物立克次体病、无形体病、埃立克体病、莱姆病、蜱传回归热、巴贝西虫病以及泰勒虫病。此外,一种蜱可以同时携带和传播多种病原体,几种蜱媒疾病往往共存于同一自然疫源地。被复合感染的蜱类叮咬的人和动物的症状会更加复杂,预后更差。因此,新发蜱传病原体的流行及其复合感染将对人类和动物健康构成严重威胁。宏转录组学具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等优势,同时结合生物信息学工具,可以有效获得病毒的全基因组信息,还可以在保守的宿主基因背景下,无偏倚的量化病毒丰度,为揭示病毒的遗传多样性、挖掘新病毒、以及防控新发传染病等提供重要技术支持。当前,融合病原学（病原体特征及其致病性）、生态学（生态环境、传播媒介和宿主动物）全面、系统的自然疫源地调查研究已成为蜱媒病研究的发展趋势。我国蜱种丰富,蜱媒传染病的自然疫源地复杂、流行形势严峻,因此需要对其深入调查研究。[目的]1.对我国南方地区七个省/直辖市的蜱进行病毒组筛查,获得其携带的病毒谱,识别新病毒。2.获得新发现的蜱病毒的分离株,进一步研究其遗传特性和生物学特性,评价其对人类的感染性和致病性。3.了解不同地域、不同蜱种中,成功分离的新的蜱病毒以及其他多种新发蜱传病原体的感染与复合感染情况。[方法]1.蜱标本采集、鉴定:在我国不同地区选择有代表性的地理景观作为采样点,于2017～2019年在蜱活跃的高峰季节进行蜱类标本的采集。游离蜱采用拖旗法采集,寄生蜱则通过控制或者捕获家畜或野生动物后采集,之后对其进行形态学鉴定。2.宏转录组测序、分析:提取蜱标本的RNA并检测其浓度、纯度和完整性,之后构建宏转录组测序文库并测序。使用生物信息学分析软件,对测序产生的数据分别进行病毒基因组的发现和组装以及相对转录本丰度量化等。3.病毒分离培养、鉴定:将蜱标本分别接种到HUVEC、Vero 81和IDE8细胞上进行病毒分离,盲传三代后提取细胞培养物RNA进行高通量测序筛查。待获得病毒分离株后,对其全基因组进行测序,并运用生物信息学分析软件进行进一步的结构和功能预测、同源性分析、系统发育分析和重组分析;建立病毒检测方法和生长复制曲线;采用超薄切片电镜观察病毒的形态特征;通过间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验观察病毒在不同细胞中的感染情况;同时通过间接免疫荧光实验对哨点医院收集的蜱咬病人双份血清标本进行病毒筛查。4.蜱携带病原体检测:将蜱标本研磨并提取其核酸;使用特异性引物,采用一步法荧光定量RT-PCR对蜱标本中的云南蜱病毒（Yunnan tick virus,YNTV）进行筛查,并通过一步法RT-PCR扩增YNTV的大、中和小三个片段;采用SYBRGreen荧光定量 RT-PCR 筛查蜱标本中的 Tacheng tick virus 1（TTV1）、Tamdy virus（TDYV）、JMTV、ALSV、SBV和BTPV 1～3;采用普通/半巢式/巢式PCR对蜱标本中的立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫进行检测;在Mega7.0软件中对测序产生的序列进行系统发育分析;采用卡方检验或Fisher确切检验比较不同地点以及不同蜱种中各种病原体的感染情况。[主要结果]1.宏转录组测序结果:本研究共构建了 93个测序文库,得到3473838929条原始reads,3362776236条高质量reads（cleanreads）以及28413469条平均长度为592 nt的contigs。其中有22930535条reads可以注释到病毒相关序列,且以未分类病毒为主,其余病毒共分为65个科。2.云南蜱病毒分离培养、鉴定结果:从云南剑川猛突血蜱幼蜱的HUVEC细胞培养物中分离到一株新的正内罗病毒,将其暂时命名为云南蜱病毒（YNTV）。①YNTV为负链RNA病毒,其基因组共分为大、中和小三个片段,其长度分别为12077nt、4489nt和2057nt,分别编码含有3255、1357和492个氨基酸的大蛋白、糖蛋白前体以及核衣壳蛋白·;②仅中片段具有信号肽和跨膜螺旋区,大、中和小片段中分别有6个、9个和1个潜在的糖基化位点,且大片段编码的氨基酸序列中存在Pre-Motif A以及Motif A～E 6个保守的motif;③同源性分析显示,YNTV与Tamdy正内罗病毒的核苷酸同源性（41.8%～68.0%）和氨基酸同源性（44.2%～63.2%）均高于其与其他正内罗病毒的核苷酸（29.3%～44.2%）和氨基酸（18.4%～32.2%）同源性,表明YNTV是一种新的Tamdy正内罗病毒型别;④YNTV与正内罗病毒代表株基于三个片段氨基酸全长序列的系统发育分析显示,其在进化上属于Tamdy正内罗病毒,且大片段和小片段均与2012年从我国豪猪血蜱中检测到的Wenzhou tick virus（WTV）处于同一进化分支,中片段则与我国西北地区蜱咬发热病人中分离的TTV1 QH1亲缘关系更近;⑤重组分析显示,YNTV大、中和小三个片段的全基因序列整体上均与WTV的同源性最高,但其大片段在6750～7000 bp以及8000～8250 bp的位置与TDYV和Songling virus（SGLV）的同源性更高,中片段在2700～3200 bp、小片段在625～850 bp的位置分别与TTV1和SGLV的同源性更高,表明YNTV分离株的三个片段均存在重组信号;⑥基于YNTV大片段和小片段建立的标准曲线分别为:x（大）=（39.99-y（大））/3.390和x（小）=38.48-y（小）)/3.152,其中y为Ct值,病毒载量为10x;⑦病毒生长复制曲线结果显示,YNTV在IDE8和C6/36两种细胞系中基本没有生长,在Vero 81细胞中生长缓慢并在接种后的第144 h即达到生长的平台期,但其可以在BHK-21和HUVEC两种细胞中迅速复制并在感染的第168 h达到生长的平台期,且YNTV的病毒载量变化趋势在五种受感染细胞的冻融物和培养上清中基本一致;⑧YNTV可引起HUVEC细胞产生致细胞病变效应,表现为细胞皱缩、变圆以及折光度增加,而在受感染的BHK-21和Vero 81细胞中则无CPE;⑨YNTV病毒颗粒为有包膜的球体,直径大约80～100 nm;⑩间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验结果显示,YNTV能够有效感染HUVEC、BHK-21和Vero 81三种细胞;（11）牡丹江林业中心医院93例蜱咬病人的急性期和恢复期双份血清标本YNTV筛查结果为阴性,说明其均未感染YNTV。3.蜱传病毒检测结果:YNTV的总阳性率为1.34%,仅在广西和云南的卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱中检出,且蜱标本中测得的YNTV片段与该病毒分离株在进化树上聚集在一起,形成不同于其他Tamdy正内罗病毒的独立分支;JMTV的总阳性率为3.23%,在广西、重庆、贵州和黑龙江4省/直辖市的龟形花蜱、豪猪血蜱、爪哇花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中检出;在吉林省的嗜群血蜱中检测到1份 BTPV 1 阳性样本;TTV1、TDYV、ALSV、SBV、BTPV2 和 BTPV 3 六种病毒的检测结果均为阴性。4.蜱传细菌和原虫检测结果:共从8个省/直辖市的14种（豪猪血蜱和镰形扇头蜱除外）356只蜱（阳性率为47.85%）中检测到24种已知病原体（6种立克次体、4种无形体、4种埃立克体、3种螺旋体、3种巴贝西虫和4种泰勒虫）以及17种未定种病原体（4种立克次体、4种无形体、3种埃立克体、2种螺旋体和4种巴贝西虫）。立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫的平均感染率分别为33.87%、10.89%、2.15%、4.44%、1.75%和3.23%,且其在不同地点以及不同蜱种中的感染率差异均具有统计学意义。5.蜱标本中病原体的复合感染情况:采集的16种744只蜱中,共9种76只（10.22%）存在复合感染情况,龟形花蜱中的复合感染发生率最高,其次为嗜龟花蜱和猛突血蜱。有69只蜱同时携带两种病原体,另外7只蜱则同时携带三种病原体,以立克次体和无形体的复合感染最为常见。此外,在猛突血蜱中还存在YNTV与立克次体或/和无形体复合感染的情况,在龟形花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中存在JMTV与多种不同细菌/原虫复合感染的情况。[结论]1.我国南方地区蜱类携带的病毒种类多样,且以未分类病毒为主。2.从云南的猛突血蜱中分离到一株新的Tamdy正内罗病毒,将其命名为云南蜱病毒（YNTV）,其基因组结构和功能与典型的正内罗病毒相似,且在其三个片段的全基因序列中均有重组事件的发生。3.YNTV具有正内罗病毒的典型形态特征;可以感染多种哺乳动物细胞系并在其中生长复制,且引起HUVEC细胞产生CPE,提示其具有潜在致病性。4.YNTV主要在我国云南和广西的蜱类中分布,卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱为其可能的传播媒介,且其可以与立克次体和无形体发生复合感染。5.我国蜱类中存在多种病毒、细菌和原虫的感染与复合感染,此外,还有一些潜在的新病原,反映了我国蜱类携带病原体的高度多样性和复杂性。[创新点]1.本研究从云南的猛突血蜱中分离到一株新的正内罗病毒,在未发现其可以感染人之前即对其相关特性进行了初步研究,为后续评价其致病性等奠定了基础。2.本研究对我国南方约一半省/直辖市地区内近10种蜱携带的病毒组进行了全面调查,为后续蜱传病毒的深入研究及蜱媒病毒性疾病的防控提供理论依据。3.本研究对我国3种不同动物地理区划内近20种蜱携带的9种新发蜱传病毒以及6种新发蜱传细菌和原虫的感染与复合感染情况进行了广泛筛查,为了解蜱媒传染病风险地域及制定相应精准防控策略和措施提供科学依据。
窦安华[2]（2021）在《江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究》文中认为目的:为探讨HIV感染人群血液病毒群落组成,分析HIV感染人群血液病毒群落的特点,研究病毒载量对HIV感染人群血液病毒群落的影响,本研究对江苏某地区203份HIV感染人群的血浆样本进行了病毒宏基因组学研究,以期了解HIV感染人群的血浆病毒谱以及病毒载量对血浆病毒谱的影响。方法:1.样本采集后,通过样品组合设计、样品的核酸酶消化、病毒核酸提取、逆转录及合成双链DNA即转化为cDNA,使用文库构建试剂盒构建高通量测序文库,文库纯化及质量检测合格后进行Illumina MiSeq深度测序,最后用生物信息学方法对数据分析。2.通过生物信息学方法对获取目的病毒序列分析后,用套式引物对已知序列进行反向PCR扩增,填补gap,得到全基因组序列信息,随后对病毒全基因组结构进行研究并注释获得的信息,最后构建系统进化树。3.基于203个HIV感染患者和40个健康体检者的血浆样本对指环病毒TZ19进行PCR筛查。结果:1.基于高通量测序技术,本研究得到243824条基因序列注释为病毒,可注释到至少17个不同的病毒科（含未分类病毒）,包括12种哺乳动物类病毒（99.87%）,2种昆虫病毒（0.05%）,1种植物病毒（≤0.01%）,2种其他病毒（0.02%）及未分类病毒（0.06%）。2.检出HIV病毒载量组的病毒群落中占据主导地位的是细小病毒科,其次是黄病毒科和指环病毒科;未检出HIV病毒载量组的病毒群落中占主导地位的是黄病毒科,其次为指环病毒科和细小病毒科。3.本研究获得了一个指环病毒的全基因组序列（命名为TZ19,GenBank No.MW857571）和一支人细小病毒B19的完整编码序列。对TZ19的系统进化分析显示该指环病毒与GenBank中已有的指环病毒TTVydyzj-8180（MT783407）同源性最高（同源性为89.64%）,属于同一种病毒。基于203个HIV感染患者和40个健康体检者的血浆样本我们进行了指环病毒TZ19的PCR筛查,结果显示在203个血浆样本中有9个样本阳性,40个健康体检者中有1个阳性。结论:1.利用病毒宏基因组学方法对HIV感染人群血浆病毒群落的组成有了初步认识。2.检出HIV病毒载量组与未检出HIV病毒载量组的病毒群落构成类似,但是病毒序列数和优势病毒类型差别很大。3.从HIV感染患者血浆中发现了 1支指环病毒全基因组和1支人细小病毒B19的完整编码区序列。
陈柯[3]（2021）在《两株猪细环病毒的全基因组测序及分析》文中提出猪细环病毒（Torque teno sus virus,TTSuV）是一种小型环状单链负性DNA病毒,在猪群中广泛流行,目前有两种不同基因型感染猪群,两种基因型均可通过垂直和水平传播,且体内病毒含量随着年龄的增长有增加趋势。近年来,随着研究者对该病毒不断深入研究发现,TTSuV感染健康动物的比例逐渐增高,病毒自身感染后并不会立即引起疾病发生,但是该病毒会使猪只机体抵抗其他疾病的能力下降。尽管该病毒的致病性尚不能确定,但已有试验表明TTSuV对猪群高致病性病原体具有促进作用,给我国养殖行业造成重大的经济损失。为了解河南地区猪源TTSuV的遗传多样性,本研究对河南某养殖场采集的11份TTSuV组织病料进行PCR检测,将检测阳性的组织进行全基因组扩增,对扩增出的TTSuV全基因组序列进行遗传学分析,在线软件预测分析ORF1蛋白理化性质及基本结构;并将阳性样品进行病毒分离培养。结果发现TTSuV可在Marc145细胞上成功传代培养,为后续更好的了解TTSuV的遗传变异和生长特性提供数据支持,其致病性需进一步研究。使用PCR方法对10份阳性样品进行全基因组扩增,成功扩增出2株TTSuV1全基因组序列,使用生物信息学软件分析显示,2株分离株之间核苷酸相似性仅有86.2%,推导氨基酸相似性为77.7%;2株分离株与TTSuV1参考毒株核苷酸之间相似性在70.3%～96.0%之间,推导氨基酸相似性在56.2%～90.9%之间,与TTSuVk2参考毒株核苷酸之间相似性小于50%。与不同亚型参考毒株共同构建系统发育进化树,发现2株分离株均与TTSuV1c亚型毒株亲缘关系较近,处于同一分支,即2株分离株均为TTSuV1c亚型。基因重组软件分析发现,2株TTSuV1分离株均存在基因重组现象,且重组区域相似,西班牙株G21株为亲本毒株,中国LNJZ株提供重组片段。重组区域位于ORF1与ORF3部分重叠区域,He N1-A9重组位点位于2195～2530 bp,He N1-A11重组位点位于2147～2650 bp。使用Net NGlyc1.0、Net OGlyc3.1和Net Phos2.0等在线软件对2株TTSuV1分离株ORF1蛋白进行结构预测,结果显示,2株分离株ORF1均由648位氨基酸组成,不含有O糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲等组成,He N1-A9毒株含有4个糖基化位点和23个潜在的磷酸化位点,而He N1-A11含有1个N糖基化位点和35个潜在的磷酸化位点。对TTSuV1检测阳性的组织病料进行病毒分离,将10份阳性样品分别感染Marc145细胞进行病毒分离培养,He N1-A9毒株盲传至第5代观察到明显细胞病变（CPE）,进行半数组织细胞感染量(TCID50)的测定和动物致病性实验,结果表明,He N1-A9病毒株毒价约为105.0 TCID50,以2 m L 105.0TCID50/m L的TTSuV1病毒液对21 d仔猪进行攻毒,攻毒7 d后采血PCR检测TTSuV1阳性,进行序列测定,确定为He N1-A9毒株。饲养至28 d,未发现任何临床症状,剖检无明显病变。
仲昭辉[4]（2021）在《水稻CRISPR-Cas基因组编辑新系统构建及应用》文中研究说明水稻（Oryza sativa）是世界上最重要的粮食作物之一,也是重要的结构及功能基因组研究模式植物。开展水稻基因组结构解析、功能关联、表达调控等方面的深入研究,对水稻生物学关键问题解读、种质遗传改良、粮食安全保障均具重大意义。对于水稻功能基因组基础研究及种质创新应用实践而言,有效获得目的基因可靠突变体材料是后续工作能否顺利开展的关键要素,但水稻天然突变体材料的发现、鉴定十分有限,且基于MES化学诱变剂、T-DNA插入等人工突变体创制方法存在周期长、投入大、随机性强等缺陷,难以满足基础研究及育种实践的实际需求。自1996年起,研究者相继报道了ZFN（zinc finger nuclease）、TALEN（transcription activator-like effector nuclease）、CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR-CRISPR associated protein 9）三种主要序列特异性核酸酶的DNA定向剪切活性,为基因组编辑技术在植物功能基因基础研究及种质资源定向遗传改良中的有效应用奠定了研究基础。由于集成了编辑效率高、可靠性优、识别位点多样、基因资源丰富、工具库拓展性强、操作简单易行等优势,CRISPR-Cas迅速成为相关研究中最主要的基因组编辑系统。近年来,研究者先后报道了CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas12b等基因组编辑特性各异的植物CRISPR-Cas基因组编辑系统,有效拓展了CRISPR-Cas基因组编辑系统在植物基因组功能研究及分子育种实践中的应用范围。目前,从Streptococcus pyogenes中分离的Sp Cas9核酸酶系统及从Lachnospiraceae bacterium中分离的Lb Cas12a核酸酶系统是使用最为广泛的植物CRISPR-Cas基因组编辑系统。然而,Sp Cas9及Lb Cas12a均面临编辑位点受限（Sp Cas9优先识别5’-NGG-3’PAM位点;Lb Cas12a优先识别5’-TTTV-3’PAM位点）、非主效PAM位点编辑效率低、编辑工具库尚需有效完善、基础分子元件知识产权限制等问题,一定程度上限制了CRISPR-Cas基因组编辑工具在植物功能基因组研究及分子育种实践中的进阶应用。基于当前CRISPR-Cas植物基因组编辑系统构建、拓展及应用的研究现状,本学位论文围绕CRISPR-Cas9及CRISPR-Cas12a编辑能力提升、工具库拓展、新成员挖掘应用等核心科学问题及关键技术瓶颈展开工作,主要研究结果如下:1.基于识别5’-NG-3’PAM的x Cas9核酸酶变体,构建识别非5’-NGG-3’PAM位点的CRISPR-Cas9植物基因组编辑系统,对其编辑能力进行评价。研究结果表明,x Cas9在水稻原生质体中,主要表现了针对5’-NGG-3’PAM位点的编辑（编辑效率:1.3%～60.9%）,而在5’-NGH-3’PAM位点处编辑活性较低（编辑效率:0.1～9.3%）,但与野生型Cas9相比,x Cas9编辑特异性较好。随后,我们构建了基于x Cas9的单碱基编辑系统,在5’-NGG-3’及5’-NGH-3’PAM位点处均实现了C to T碱基编辑;2.进一步工作中,基于识别5’-NG-3’PAM的Sp Cas9-NG、Sp Cas9-NGv1核酸酶变体,构建识别非5’-NGG-3’PAM位点的CRISPR-Cas9植物基因组编辑系统,对其编辑能力进行评价。水稻原生质体转化结果表明,Sp Cas9-NG、Sp Cas9-NGv1在多个5’-NGN-3’PAM位点表现出了编辑活性（编辑效率:0.1%-～41.7%）,但在野生型Cas9识别的5’-NGG-3’PAM位点处的编辑活性有明显下降（Sp Cas9-NG编辑效率:1.6%～20.3%;Sp Cas9-NGv1编辑效率:2.3%～11.9%;Sp Cas9编辑效率:0.6%～48.4%）。水稻稳定转化结果与之相符:Sp Cas9-NG编辑效率为6.7%～56.3%、Sp Cas9-NGv1编辑效率为3.5%～46.4%。通过融合Pm CDA1脱氨酶结构域,构建了基于Sp Cas9-NG的单碱基编辑系统,在5’-NGH-3’PAM位点处实现了有效的单碱基编辑,编辑效率为30.4%～45.0%;3.针对之前报道的存在5’-TTV-3’PAM位点编辑活性的Fn Cas12a核酸酶系统,构建、测试了其在水稻细胞中的编辑特性,明确了其最优PAM位点仍然为5’-TTTV-3’（编辑效率:10.3%～37.2%）,但可识别部分5’-TTV-3’PAM位点（编辑效率:2.3%～11.2%）的编辑特性。水稻稳定转化结果同样说明Fn Cas12a的最优编辑位点为5’-TTTV-3’:该系统在5’-TTV-3’PAM位点处平均编辑效率为26.0%,而5’-TTTV-3’PAM位点处的平均编辑效率为88.2%;4.基于哺乳动物报道的As Cas12a-RR（识别5’-TYCV-3’、5’-CCCC-3’PAM位点）、As Cas12a-RVR（识别5’-TATV-3’PAM位点）核酸酶变体序列信息,构建了Lb Cas12a及Fn Cas12a对应变体植物基因组编辑系统,并在水稻中进行活性测试:Lb Cas12a-RR系统编辑活性（瞬时转化编辑效率:0.2%～41.3%;稳定转化平均编辑效率为56.2%）优于Fn Cas12a-RR系统（瞬时转化编辑效率:0.1%～5.7%;稳定转化平均编辑效率为6.7%）,而Fn Cas12a-RVR系统的瞬时转化编辑效率为0.1%～40.9%;优于Lb Cas12a-RVR系统（0.1%～10.2%）;5.为了进一步丰富植物CRISPR-Cas基本表达系统,构建了基于内含子剪切加工的单转录单元（intron-based single transcript unit,i STU）水稻CRISPR-Cas系统,实现了针对水稻内源基因的基因组编辑。在原生质体中,i STUCRISPR/Cas9系统编辑效率为3.8%～35.2%,i STU-CRISPR/Cas12a系统的编辑效率为0.7%～9.0%,并且实现了双位点编辑及大片段删除。通过水稻稳定转化,基于i STU-CRISPR/Cas9及i STU-CRISPR/Cas12a系统在T0代单株中实现了单位点编辑（i STU-CRISPR/Cas9系统平均编辑效率为48.7%;i STUCRISPR/Cas12a系统平均编辑效率为15.3%）,基于i STU-CRISPR/Cas9系统实现了双位点编辑（平均编辑效率为36.0%）;6.最后,基于数据挖掘,我们成功应用源自Lactobacillus spp.的Lac Cas9系统（识别5’-NGAAA-3’PAM）在水稻、小麦中实现了基因组编辑,对其编辑特性进行了明确分析,并构建了多样化编辑工具库。研究结果表明:1)Lac Cas9在对应PAM位点处的编辑活性明显优于Sp Cas9-NG、Sp RY及Lb Cas12a系统,在水稻T0代植株中单位点编辑效率可达68.0%,双位点共编辑效率可达66.7%;2)基于Lac Cas9切口酶融合Pm CDA1、ABE8e系统可以实现有效的C to T（编辑效率:19.1～38.0%）、A to G碱基编辑（编辑效率:14.3%）;3)基于Lac Cas9核酸酶融合转录激活结构域、转录抑制结构域实现了目的基因定向激活及抑制调控。
燕超[5]（2019）在《广西和新疆地区蝙蝠病毒组及小型环状DNA病毒遗传多样性研究》文中研究表明蝙蝠是多种新发和再发人兽共患病毒的自然宿主,当前已发现的蝙蝠病毒超过200种。目前我国已发现的蝙蝠有7科33属135种,主要分布于我国华中、华南、西南等人口密集、气候湿热的地区。本课题组前期调查研究表明,广西地区蝙蝠种类丰富且携带多种人兽共患病毒,而新疆蝙蝠种类单一数量较少,所携带病毒也存在明显的地域特征。为了进一步挖掘广西和新疆蝙蝠携带病毒的本底数据和该地区病毒的流行情况,本研究利用病毒宏基因组学对广西11种268只蝙蝠和新疆1种122只蝙蝠样品进行了病毒组学研究,并对蝙蝠小型环状DNA病毒进行检测、全序列扩增和关键蛋白编码基因的遗传分析,以揭示蝙蝠相关病毒跨种跨域传播途径,为防止蝙蝠病毒跨境传播、防范新发病毒病提供了重要的基础数据。通过实验,获得的结果如下;1.通过测序,在2016年广西11种268只蝙蝠样品中获得了 49个病毒科的reads,其中包括了脊椎动物病毒、植物病毒、昆虫病毒和噬菌体,分别占总病毒reads的83.0%、1.2%、0.4%、15.5%。2.对小双节RNA病毒、杯状病毒、多瘤病毒和丙肝病毒等4种病毒的重叠序列进行遗传进化分析发现:（1）广西可能存在2种新的小双节RNA病毒和杯状病毒;（2）多瘤病毒展示了与宿主共进化特征,肝炎病毒在蝙蝠中有着丰富的遗传多样性,可能存在一个变异株。3.对蝙蝠样品中HBV、BcV、RVA、AstV CoV、RV等6种病毒进行检测和进化分析发现:（1）广西蝙蝠携带AstV具有普遍性,出现在了每个采样点和多个蝙蝠品种中;（2）小黄蝠具有复杂的病毒本底,携带有AstV、CoV、RVA和RV等4种病毒,而其它蝙蝠都不超过2种;（3）肝炎病毒株与浙江和贵州的毒株存在着区域相互传播;博卡病毒的进化与宿主有一定的关系;轮状病毒能跨种传播到人,或与人源的轮状病毒发生一定重排;星状病毒能够在不同的蝙蝠中传播、并且也能在蝙蝠和其他动物（啮齿和猪）中传播;弹状病毒与本课题组之前发现的毒株和目前已经报道的毒株显着的进化差异足以使其成为新的病毒属的代表成员;冠状病毒在蝙蝠中具有一定的物种偏向性,CoV-FCRA23与新发现的猪急性腹泻病原体的HKU2或者SADS CoV具有很高的同源性,提示防城港地区养猪业也面临着该病毒的威胁。4.在新疆蝙蝠样品中扩增到1株双环病毒、50株圆环病毒和5株指环病毒基因组全序列,在广西地区样品中扩增到3株双环病毒、3株圆环病毒和8株指环病毒基因组全序列,并通过进化分析发现了2种新的双环病毒、3种新的圆环病毒、4种新的指环病毒。（1）双环病毒:在广西蹄蝠和新疆普通伏翼蝠发现该病毒拓展了其蝙蝠宿主范围;根据ICTV新种的界定,广西3株和新疆1株可能各是一种新双环病毒。（2）圆环病毒:在新疆获得的50株根据编码区域不同分为2种类型,且可能存在1种新的圆环病毒株,其余毒株是该毒株的变异株;在广西蝙蝠中发现3株圆环病毒,属于2种新圆环病毒。（3）指环病毒:在新疆获得的5株可能为1个新种,在广西获得的8株可能为4个新种。本次发现的指环病毒与已报到的指环病毒结构不同,仅仅只包括一个ORF,可能属于一种未分类的环状病毒。结论:（1）利用病毒宏基因组学技术分析了桂越边境地区蝙蝠携带病毒的群落结构,丰富了该地区病毒的本底数据;并分析了小双节RNA病毒、杯状病毒、多瘤病毒和肝炎病毒等10种病毒的遗传多样性及部分病毒的跨种或跨域传播的可能性。（2）通过PCR在新疆蝙蝠样品中扩增到1株双环病毒、50株圆环病毒和5株指环病毒基因组全序列,在广西地区样品中扩增到3株双环病毒、3株圆环病毒和8株指环病毒基因组全序列,并通过多序列比较分析发现可能存在2种新的双环病毒、3种新的圆环病毒、4种新的指环病毒。
吴悦[6]（2019）在《鼠源TTV基因组分析与呼吸道HRSV抗病毒药物筛选》文中指出研究目的:近年来新发病毒性传染病对人类的健康产生了巨大的威胁,对其进行及时的预防、诊断和有效的治疗是防治传染病的三个重要环节。本论文从预防诊断角度,通过对海南省重要的传染病动物储存宿主啮齿类动物携带的鼠源TTV病毒RoTTV（Rodent Torque teno virus,RoTTV）,进行测序及遗传进化分析溯源,并建立real-time PCR检测方法,为海南省啮齿类动物来源TTV的感染情况及潜在威胁的研究提供研究基础。与此同时通过建立呼吸道合胞体病毒（Human Respiratory syncytial virus,HRSV）的药物筛选平台,筛选天然商品化药品库,为HRSV的治疗提供新的天然药物。研究方法:1.RoTTV全基因组分析及检测方法的建立:基于本实验室前期在海南发现的啮齿类动物来源的TTV流行株（RoTTV 3）高通量宏病毒组测序分析结果用PCR方法进行RoTTV 3基因组序列拼接,并根据RoTTV 3保守序列以构建的含ddrp基因的重组质粒为标准品,优化实验条件,建立RoTTV的real-time PCR检测方法。2.HRSV-A的抗病毒药物体外筛选模型及抗病毒药物筛选:以Hep-2（人类喉上皮癌细胞）为敏感细胞系通过CCK-8方法和传统观察CPE方法建立了体外抗病毒药物细胞筛选模型,比较两种方法的异同,建立一种更加准确的体外筛选平台,并通过已建立的筛选平台从天然药品库中筛选出有效天然药物单体,通过测定有效药物的细胞毒性及药效评价药物的抗病毒效果。研究结果:1.根据已获得的啮齿类动物来源的TTV病毒高通量基因组测序结果,对获得TTV相关reads 19,863条经过拼接,共获得5条contig序列,其N50为361 bp,覆盖RoTTV 3-HMU 1基因组的68%,成功拼接获得一株海南省海口市褐家鼠携带的RoTTV的基因组序列,命名为RoTTV 3-HMU 1,遗传进化结果表明RoTTV 3-HMU 1属于RoTTV基因3型。并对已获得基因型RoTTV 3建立一种real-time PCR检测方法,线性范围为1×1021×108 copies/mL,其扩增系数为1.000,溶解曲线只出现1特异性峰,检测灵敏度达到102个拷贝。2.用CCK-8方法和传统CPE观察法评价已报道的抗HRSV-A病毒的药物Cyclopiazonic acid（CPA）,结果表明CCK-8法和传统CPE观察法在评价体外药物抗病毒药效果实验时结果具有相同性。但相对于传统观察CPE方法,CCK-8方法是通过OD值计算细胞存活率从而定量反映药效结果,所以更加客观、准确、直接,更适合在抗HRSV药物筛选时提供有效平台。用建立的CCK-8抗病毒药物筛选平台在天然药品库中395种药物中筛选出有效的药物单体7种,选定出药效最好的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）,测定出EGCG半数致死率(TD50)=39.93μg/m L,半数有效浓度(EC50)=2.039μg/mL,治疗指数为（TI）=19.6,经过统计学独立样本t检验分析,EGCG组与病毒组有明显统计学差异（P<0.05）,证明EGCG对HRSV-A病毒具有良好的抗病毒活性。结论:1.成功拼接获得一株海南省海口市褐家鼠携带的RoTTV的基因组序列,遗传进化分析表明该病毒属于RoTTV 3基因型。2.成功建立RoTTV3 real-time PCR检测方法,标准曲线在1×1021×108 copies/mL的浓度时呈现良好线性关系,其扩增系数为1.000,溶解曲线只出现1特异性峰,检测灵敏度达到102个拷贝。3.CCK-8法和传统CPE观察法检测药物对HRSV-A的抗病毒效果具有相同性。但CCK-8方法更加客观、准确、直接,而且操作简单,更适合在抗HRSV药物筛选时提供有效平台。4.EGCG在体外针对HRSV-A具有良好的抗病毒效果。
李玉晖[7]（2018）在《我国啮齿目动物携带的指环病毒基因组学特征分析》文中研究表明近年来新发传染病屡有发生,全球近75%的新发传染病是动物源性的。啮齿目动物作为全球种类最多、分布最广的哺乳动物种群,它们与人类密切接触,是各种新发病毒的自然储库,可传播60多种已知的人畜共患传染病。因此我们对我国啮齿目动物携带的病毒组进行了大规模系统性的研究,该课题作为啮齿目动物病毒组研究的一部分聚焦于指环病毒。由于缺乏有效的细胞系模型和合适的动物模型来支持病毒复制研究,指环病毒的致病性仍然存在争议,但是目前其中的一些基因型被认为具有致病能力。近年来指环病毒已相继从人类及其他哺乳动物中检出。啮齿类动物指环病毒之前已在英国报道过,然而目前国内没有关于啮齿动物携带指环病毒的报道,因此对于了解不同地区的多种啮齿目动物的指环病毒的存在情况是十分必要的。在本研究中,我们利用宏基因组学研究方法,对我国20个代表性省份的5个科的42种啮齿目动物,共计2416份咽拭子和肛拭子样品的指环病毒的存在情况进行检测,结果显示几乎所有的啮齿目动物都携带有指环病毒,扩充了啮齿目动物携带指环病毒的宿主种类。根据高通量测序结果提示,结合巢式PCR方法对原始样本中的指环病毒基因序列进行了进一步验证,并根据序列相似性选择具有代表性的序列进行全基因扩增,最终得到了 11个代表性的全基因组和2个部分基因组序列信息。我们获得的啮齿目动物指环病毒基因组长度约有2.3kb-2.6kb。根据序列拼接和基因注释结果,本研究获得的指环病毒基因组包含2-3个开放阅读框,此外还包括一个495-868bp的非编码区。通过进一步对13个指环病毒ORF1的进化分析,啮齿类动物指环病毒形成了 4个谱系（1-4）,根据序列同源性、系统进化及基因组结构等分析结果,建议其与英国的啮齿目动物指环病毒构成3个新的病毒属,这些新发现的指环病毒扩展了病毒学的分类。本研究表明鼠科的小家鼠携带啮齿目动物指环病毒毒株RtMm-AneV/ZJ2016,这提示同一种属的实验室小鼠也可能被该毒株感染而用于研究指环病毒的复制周期和致病性。本研究中概述了啮齿目动物指环病毒并鉴定出中国啮齿目动物携带的13种新型指环病毒。这些数据可以为识别和追踪啮齿目动物携带潜在的指环病毒提供重要的科学依据。
王玲[8]（2018）在《猪细环病毒的序列分析及抗体检测方法的建立》文中研究表明猪细环病毒（Torque teno sus virus,TTSuV）是一种小的,无包膜的单链环状DNA病毒。首次发现于1997年,一名日本急性肝炎患者输血后,在病人血清中检测到一种非包膜单链环状病毒,将其命名为TTV（TT Virus）。这是第一个“人类圆环病毒”,具有单链环状DNA基因组（ssDNA）,属于指环病毒科。随后TTV也在家养的动物如猪、鸡、牛、羊、猫和狗身上发现。TTSuV可以分为两个型,分别是TTSuV1和TTSuV2,TTSuV1属于细环病毒属,TTSuV2属于Kappa细环病毒属,均可感染猪。近年来,不同国家在猪体内均发现有TTSuV。同时,在灵长类动物如猩猩、长臂猿等体内也发现存在有TTV。TTSu V主要通过动物粪口途径传播,也可通过垂直传播途径如胎盘、子宫方式传播。TTSuV单独感染无特异的临床症状,但TTSuV常与猪的其他病毒如猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）等共感染,具有某种未知的协同效应,可加重动物病情。目前TTSuV在全世界的猪场中广泛存在,但现有的检测方法仅限于PCR法进行病毒病原学检测或ELISA法进行血清学检测。临床上还没有商品化试剂盒来专一性检测TTSuV抗体。因此,建立一种快速、高效、敏感的抗体检测方法十分重要。同时,目前对于TTSuV的致病机理的研究还很少。因此,开展TTSuV病毒的序列分析,建立其抗体检测方法将为该病毒的早期发现和治疗提供理论基础和技术支撑,同时将有助于对不同地区猪群中主流毒株的分型以及不同猪群中的病毒的感染情况进行深入了解。1.本研究采集20162017年河南省南阳市周边地区多个规模化养猪场发病猪的病料,并进行基因组DNA提取,根据GenBank内报道的参考序列,设计3对覆盖TTSuV基因组全长的特异性引物进行扩增和测序,最终成功获取21株TTSuV基因组序列,分别命名为HeN1-A1、HeN1-A2、HeN1-A6、HeN1-A7、HeN1-A8、HeN1-A9、HeN1-A10、HeN1-A11、HeN1-A12、HeN1-A31、HeN1-A32、HeN1-A51、HeN1-A52、HeN1-A132、HeN2-A2、HeN2-A4、HeN2-A5、HeN2-A9和HeN2-A11。通过与GenBank收录的120株TTSuV的参考序列进行序列同源性和进化树分析表明,HeN1-A2、HeN1-A6、HeN1-A8、HeN1-A9、HeN1-A11、HeN1-A31、HeN1-A52和HeN1-A132全基因序列的同源性为95.7%97.6%,差异较小;HeN1-A51、HeN1-A32、HeN1-A12、HeN1-A1和HeN1-A10序列基因的同源性为84.3%86.6%,差异较小;HeN2-A11、HeN2-A9、HeN2-A4和HeN2-A5序列基因的同源性为78.8%99%,差异也较小。而HeN1-A7和HeN2-A2与全基因组序列比较同源性分别为33.2%34.3%和27.629.6%左右,说明这两个基因序列和其他的基因序列的同源性差异较大,因此在进化树上单独分支。2.本研究参考GenBank中TTSuV1的Cap基因序列,设计特异性引物进行扩增,连接pcDNA3.1,构建重组表达载体pcDNA-TTSuV1,通过转染HEK293T细胞系,成功建立了TTSuV的间接免疫荧光抗体检测方法（Indirect Immunofluorescence,IFA）。对20162017年采集的河南省南阳市周边地区多个规模化养猪场血清进行检测,结果显示临床血清的阳性率为48.48%65.4%（65.4%、50%、48.48%、51.28%和55.36%）,均在50%左右。表明我们建立的TTSuV的间接免疫荧光抗体检测方法具有较好,可以用于临床检测。
孙文超[9]（2017）在《PRRSV与PCV2的分子流行病学调查及其重组腺病毒疫苗实验免疫研究》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）已经成为中国流行比较严重的猪病之一,特别是2006年爆发的高致病性PRRSV,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前国内PRRSV流行毒株仍以美洲型为主,但在2011年以后随着欧洲型毒株在国内密集报道,证实国内也存在欧洲型毒株流行。PCV2是无囊膜单链DNA病毒,可分为PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d四个亚型。PCV2是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原体,临床上常见PRRSV和PCV2混合感染,推测二者可能存在协同作用,导致猪死亡率增高。PRRSV和PCV2混合感染实验证实,PCV2复制增强可以导致PRRSV对肺组织损伤的严重性增强。本研究首先对2015-2016年广西猪场PRRSV和PCV2的流行情况进行监测,并分析其遗传变异情况;然后利用腺病毒载体构建PRRSV和PCV2重组腺病毒候选疫苗;最后,利用小鼠和猪体对重组候选疫苗进行免疫评价。主要研究结果如下:（1）对2015-2016年广西地区PRRSV和PCV2流行病学调查发现,2015年广西部分地区PRRSV和PCV2血清阳性率分别为63%-90%和85%-93%。对广西玉林市2014年-2016年PRRSV和PCV2跟踪调查发现连续三年的PRRSV抗体阳性率出现持续性下降。猪群体免疫不均匀或者免疫效果不佳更容易造成病毒变异,给疾病的预防和净化造成巨大的障碍。本研究发现7株PRRSV均属于美洲型高致病性毒株,且属于2个不同基因亚群。GXB11-2015分离株存在2处不连续150个核苷酸缺失,氨基酸缺失特征为1+20+29。获得27株PCV2全基因组序列,分析表明PCV2d可能成为中国广西猪场的优势毒株。重组分析发现3处基因重组现象,压力选择分析表明ORF2更容易受到阳性筛选。（2）本实验以美洲型经典VR2332株和HP-PRRSV GD株的ORF3、ORF5基因,欧洲型代表株LV株ORF3、ORF5基因及PCV2NM株ORF2基因为基础,利用穿梭质粒pacAd5K-NpA,成功构建美洲型重组腺病毒rAd-NAORF3-ORF5、欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV二价重组腺病毒rAd-EUORF3-ORF5-NAORF3-ORF5、美洲型 PRRSV 和 PCV2 二联重组腺病毒rAd-ORF2-NAORF3-ORF5、欧洲型PRRSV和PCV2二联重组腺病毒rAd-ORF2-EUORF3-ORF5 以及含有 IL18 细胞因子的 rAd-NAORF3-ORF5-IL18和rAd-EUORF3-ORF5-IL18,并对重组腺病毒进行筛选鉴定。（3）小鼠免疫试验结果表明,ORF5和ORF3具有免疫协同作用,可以促进机体细胞免疫水平和体液免疫水平。IL18作为细胞因子佐剂可以促进腺病毒 rAd-NA-ORF3-ORF5-IL18、rAd-EU-ORF3-ORF5-IL18、rAd-ORF2-IL18的免疫效果。PRRSV-PCV2二联重组腺病毒疫苗rAd-ORF2-NA-ORF3-ORF5、rAd-ORF2-EU-ORF3-ORF5能刺激小鼠细胞Th1类和Th2类细胞免疫反应。（4）猪体免疫试验结果表明,PRRSV-PCV2重组腺病毒疫苗能诱导猪体产生较好的体液和细胞免疫反应。免疫第35天时rAd-EU-ORF3-ORF5-NA-ORF3-ORF5免疫组CD4+T淋巴细胞的水平显着高于野毒组1.46倍（P<0.05）。LV株病毒攻毒后,野毒免疫组血液中的病毒载量高于rAd-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5 3.5 倍（P<0.05）。攻毒保护实验表明,重组腺病毒疫苗能够提供有效的免疫保护,表明所构建的重组疫苗在抵抗PRRSV和PCV2病毒感染方面具有很好的发展潜力。综上所述,我国的PRRSV和PCV2毒株不断发生新的变化,PRRSV外来毒株的及PCV2基因型的漂变给疾病的预防和控制带来巨大的挑战。本研究丰富了当前PRRSV及其PCV2分子流行病学资料;利用腺病毒载体构建欧洲型、美洲型PRRSV及其PCV2重组候选疫苗能够在小鼠和猪体免疫中诱导特异的体液和细胞免疫,攻毒保护实验证明可以提高对仔猪的保护水平,从而为PRRSV和PCV2基因工程疫苗的研究奠定了基础。
王延群[10]（2016）在《严重急性呼吸道感染儿童呼吸道样品病毒组学研究》文中指出严重急性呼吸道感染（Severe Acute Respiratory Infection, SARI）是儿童住院和感染死亡的重要原因之一,而大多数的儿童呼吸道感染是由病毒引起的。与呼吸道感染相关的病毒种类繁多而且变异较快,常规实验室检测方法（分子生物学检测和血清学检测）往往只能检测单一或少数几种病毒,很难准确、全面的反映机体的感染状态。深度测序作为一种无偏向性的高通量测序方法,可以一次性测序、分析样本中所有的微生物核酸序列,确定样本中病毒群落的组成、丰度及病毒的亚型和变异,有助于疾病的检测、预防和控制。中国目前还没有专门针对SARI和非SARI儿童的呼吸道感染进行病毒谱列队研究,也没有针对呼吸道样本进行病毒组学分析的技术平台研究报告。因此本研究首先建立并优化了呼吸道样品的处理和深度测序分析平台,然后进行SARI儿童和非SARI儿童呼吸道样品病毒组学分析,发现两组群体之间存在一定的相同点和差异性,分析了北京地区儿童SARI的主要病毒性病原谱和序列特征,最后利用该平台进行两种呼吸道病毒的全基因组测序和分析,成功获得1株腺病毒全基因组和4株博卡病毒全基因组,序列分析发现一些新的基因组特征。本研究主要结果如下：第一：用于深度测序呼吸道样品的预处理和核酸扩增方法优化采用培养的HCoV-NL63作为样品比较各种预处理方案,并进行深度测序,测序结果表明：样品经处理后目的序列所占比例更高,基因组覆盖度更高。另外对临床样品分别进行不依赖序列的单引物扩增（SISPA）和多重置换扩增（MDA）,比较核酸扩增的灵敏性,发现SISPA适合一般呼吸道样品,而MDA在微量样品测序中效果更好。摸索单一病毒的全基因组扩增、测序方法发现,特异性随机引物扩增方法对HCoV-NL63扩增效果较好,但对其他冠状病毒扩增效果一般。分段扩增结合深度测序方法可以获得HCoV-NL63大部分序列,但部分序列未能扩增成功。第二：SARI与非SARI儿童呼吸道样品病毒组学特征比较分析采集135份SARI儿童呼吸道样品和15份非SARI儿童呼吸道样品,分组进行深度测序比较分析发现：SARI组中检测到的病毒主要来自于以下7种病毒科：aramyxoviridae、 Coronaviridae、Parvoviridae、 Orthomyxoviridae、Picornaviridae、 Anelloviridae和Adenoviridae;而非SARI组的病毒群落主要来自于Anelloviridae病毒科,常规病毒只占其中的少部分。两组人群呼吸道样品病毒种类比较分析发现：儿童SARI的病毒性致病原主要包括一下病毒：HRSV、HCoVs（HCoV-OC43、229E、HKU1）、HBoV、HPIVs、 influenza viruses A和 HAdV。两组呼吸道样品中均检测到大量指环病毒科相关病毒,比较分析发现指环病毒科相关病毒与儿童SARI之间没有明显的相关性。第三：两种呼吸道病毒的全基因组测序与分析采用深度测序平台进行了两种呼吸道病毒全基因组测序和分析,针对已分离的基因型未知AdV病毒,采用深度测序平台成功获得1株HAdV全基因组,分析发现该病毒为HAdV-C的一种重组毒株,主要是由HAdV-1和HAdV-2重组产生。针对HBoV核酸阳性临床样品,通过深度测序获得4株HBoV全基因组,序列分析发现了HBoV1特异性的核苷酸缺失和进化特征,VP1基因的进化速率远远大于NS1,大约为后者的15倍。核苷酸多样性分析发现HBoV1的核苷酸多样性主要集中在VP1区,而HBoV2等病毒的核苷酸多样性相对分散和复杂。本研究首次比较分析了SARI与非SARI儿童呼吸道样品的病毒组学特征,确定了北京地区儿童SARI的主要病毒性致病原,为呼吸道疾病的诊断和预防提供新方法。另外采用深度测序平台成功的获得两种常见呼吸道病毒（HAdV和HBoV）全基因组,为呼吸道病毒的进化研究和相关疫情的快速确诊提供了新方法。
二、TTV基因组的克隆与进化分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TTV基因组的克隆与进化分析（论文提纲范文）
（1）云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 基于宏转录组学的新的蜱传病毒的发现 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 生物信息学分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 蜱标本鉴定 |
| 3.2 蜱标本核糖核酸(RNA)提取与检测 |
| 3.3 蜱标本测序文库构建与测序 |
| 3.4 测序数据处理与分析 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 蜱标本采集情况 |
| 5.2 蜱标本RNA提取与检测结果 |
| 5.3 宏转录组测序结果 |
| 6 讨论 |
| 第二部分 云南蜱病毒的分离鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 生物信息学分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 病毒分离培养 |
| 3.3 病毒全基因组测序 |
| 3.4 病毒全基因组序列分析 |
| 3.5 病毒检测方法建立 |
| 3.6 病毒生长复制曲线绘制 |
| 3.7 病毒形态观察 |
| 3.8 病毒多克隆抗体制备 |
| 3.9 病毒抗原片制备及间接免疫荧光实验 |
| 3.10 RNA荧光原位杂交实验 |
| 3.11 蜱咬病人血清标本IFA筛查 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 病毒分离培养结果 |
| 5.2 YNTV全基因组序列特征 |
| 5.3 YNTV结构和功能预测 |
| 5.4 YNTV基因组同源性分析 |
| 5.5 YNTV系统发育分析 |
| 5.6 YNTV重组分析 |
| 5.7 YNTV实时荧光定量RT-PCR标准曲线 |
| 5.8 细胞敏感性分析 |
| 5.9 YNTV的形态特征 |
| 5.10 YNTV在不同细胞中的感染情况 |
| 5.11 蜱咬病人血清标本IFA筛查结果 |
| 6 讨论 |
| 第三部分 云南蜱病毒与其他多种新发蜱传病原体复合感染情况的流行病学调查 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 蜱标本鉴定 |
| 3.2 蜱标本核酸提取 |
| 3.3 蜱标本YNTV检测 |
| 3.4 蜱标本中其他新发蜱传病毒检测 |
| 3.5 蜱标本中细菌和原虫检测 |
| 3.6 系统发育分析 |
| 3.7 统计学分析 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 蜱标本采集结果 |
| 5.2 蜱标本YNTV检测结果 |
| 5.3 蜱标本中其他新发蜱传病毒检测结果 |
| 5.4 蜱标本中细菌和原虫检测结果 |
| 5.5 蜱标本中各种病原体的复合感染情况 |
| 6 讨论 |
| 结论与建议 |
| 本研究的主要创新点与不足 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（2）江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 病毒宏基因组学的概念 |
| 1.2 病毒宏基因组学的研究过程 |
| 1.2.1 样品处理和病毒浓缩 |
| 1.2.2 核酸提取和扩增 |
| 1.2.3 高通量测序 |
| 1.2.4 生物信息学分析 |
| 1.3 病毒宏基因组学的应用 |
| 1.4 病毒宏基因组学的研究现状和发展趋势 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 本研究的总体技术路线 |
| 第二章 江苏某地区HIV感染患者血浆病毒群落分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样本采集 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 样品前处理 |
| 2.1.4 样品组合设计 |
| 2.1.5 样品的核酸酶消化 |
| 2.1.6 病毒核酸提取 |
| 2.1.7 逆转录及合成双链DNA |
| 2.1.8 高通量测序文库的构建 |
| 2.1.9 文库的扩增 |
| 2.1.10 文库的纯化 |
| 2.1.11 病毒文库质量检测 |
| 2.1.12 文库的Miseq深度测序 |
| 2.1.13 文库测序结果的生物信息学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 病毒宏基因组DNA文库的质量检测 |
| 2.2.2 Miseq测序质量 |
| 2.2.3 HIV感染人群血浆的病毒宏基因组学分析结果 |
| 2.2.4 HIV感染人群血浆的病毒群落组成 |
| 2.2.5 HIV感染人群血浆病毒群落按宿主分类 |
| 2.2.6 检出病载组与未检出病载组的比较 |
| 2.2.7 主要潜在致病性病毒比较 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 未知病毒的鉴定和遗传特征分析 |
| 3.1 HIV感染人群血浆样本中指环病毒的研究 |
| 3.1.1 材料和方法 |
| 3.1.2 实验结果 |
| 3.1.3 讨论 |
| 3.2 HIV感染人群血浆样本中细小病毒的研究 |
| 3.2.1 材料和方法 |
| 3.2.2 实验结果 |
| 3.2.3 讨论 |
| 第四章 主要结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）两株猪细环病毒的全基因组测序及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪细环病毒的研究进展 |
| 1.2 猪细环病毒病原学特点 |
| 1.3 猪细环病毒的基因组结构功能 |
| 1.4 猪细环病毒流行病学特点 |
| 1.5 猪细环病毒的理化特性 |
| 1.6 猪细环病毒致病特性 |
| 1.7 猪细环病毒含量分布 |
| 1.8 猪细环病毒的潜在应用价值 |
| 1.9 猪细环病毒细胞培养特性 |
| 1.10 生物学诊断 |
| 1.10.1 病原学检测 |
| 1.10.2 血清学检测 |
| 1.11 全基因组研究 |
| 1.12 研究目的及意义 |
| 第二章 猪细环病毒全基因组克隆测序及分析 |
| 2.1 主要实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验室常用溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 临床病料与处理 |
| 2.3.2 病毒总基因组提取 |
| 2.3.3 引物设计及合成 |
| 2.3.4 猪细环病毒RT-PCR检测 |
| 2.4 猪细环病毒全基因组序列扩增 |
| 2.4.1 全基因组引物设计与合成 |
| 2.4.2 猪细环病毒阳性样品基因组提取 |
| 2.4.3 猪细环病毒全基因组序列扩增 |
| 2.4.4 阳性PCR产物回收纯化 |
| 2.4.5 目的片段的连接 |
| 2.4.6 目的基因转化 |
| 2.4.7 重组菌株PCR鉴定 |
| 2.4.8 猪细环病毒全基因组序列分析 |
| 2.4.9 ORF1 序列生物信息学分析 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 样品检测结果 |
| 2.5.2 TTSuV全基因组扩增结果 |
| 2.5.3 优化克隆转化过程 |
| 2.5.4 TTSuV全基因组序列拼接 |
| 2.5.5 TTSuV全基因组相似性分析 |
| 2.5.6 基因重组分析 |
| 2.5.7 ORF1 蛋白理化性质预测分析 |
| 2.5.8 ORF1 蛋白二级结构预测 |
| 2.6 结论与讨论 |
| 第三章 猪细环病毒分离及仔猪致病性试验 |
| 3.1 主要实验试剂 |
| 3.2 主要试验仪器 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.4 猪细环病毒分离培养 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 细胞复苏 |
| 3.4.3 细胞传代培养 |
| 3.4.4 细胞冻存 |
| 3.4.5 6 孔板培养细胞 |
| 3.4.6 病毒分离 |
| 3.4.7 96 孔板培养细胞 |
| 3.4.8 半数组织感染量(TCID_(50))的测定 |
| 3.4.9 动物致病性试验 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 病毒分离培养 |
| 3.5.2 分离株毒价测定 |
| 3.5.3 动物致病性试验 |
| 3.6 结论与讨论 |
| 第四章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 本研究涉及所有参考毒株信息 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）水稻CRISPR-Cas基因组编辑新系统构建及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基因组编辑技术概述 |
| 1.1.1 突变体创制概述 |
| 1.1.2 基因组编辑工具研发进展 |
| 1.2 CRISPR-Cas基因组编辑工具概述 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas系统的发现 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas系统基因组结构特征 |
| 1.2.3 CRISPR-Cas基因组编辑工具创制 |
| 1.2.4 不同CRISPR-Cas成员的基因组编辑工具 |
| 1.2.5 CRISPR-Cas基因组编辑工具优化策略 |
| 1.3 植物CRISPR-Cas基因组编辑系统开发 |
| 1.3.1 主要植物CRISPR-Cas基因组编辑工具 |
| 1.3.2 植物CRISPR-Cas基因组编辑系统的递送 |
| 1.3.3 CRISPR-Cas植物基因组编辑的应用 |
| 1.3.4 植物CRISPR-Cas基因组编辑系统关键问题 |
| 1.4 立题依据及研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 主要酶及生化试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒DNA提取 |
| 2.2.2 DNA凝胶回收 |
| 2.2.3 载体构建 |
| 2.2.4 根癌农杆菌质粒转化 |
| 2.2.5 原生质体制备与转化 |
| 2.2.6 水稻稳定遗传转化 |
| 2.2.7 基因组DNA提取 |
| 2.2.8 扩增子测序及数据分析 |
| 2.2.9 水稻再生植株转基因阳性鉴定 |
| 2.2.10 编辑事件鉴定 |
| 2.2.11 基因表达水平的qPCR分析 |
| 2.2.12 iSTU系统内含子剪接检测 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 基于xCas9 核酸酶变体的植物基因组编辑系统构建 |
| 3.1.1 植物xCas9 基因组编辑系统设计及验证 |
| 3.1.2 基于xCas9 核酸酶变体的编辑特征分析 |
| 3.1.3 基于水稻稳定转化的xCas9 核酸酶变体编辑活性评价 |
| 3.1.4 xCas9 植物基因组单碱基编辑系统构建 |
| 3.1.5 xCas9 植物基因组编辑系统特异性分析 |
| 3.2 基于SpCas9-NG核酸酶变体的植物基因组编辑系统构建 |
| 3.2.1 基于SpCas9-NG核酸酶变体的编辑特征分析 |
| 3.2.2 基于水稻稳定转化的SpCas9-NG核酸酶变体编辑活性评价 |
| 3.2.3 SpCas9-NG植物基因组单碱基编辑系统构建 |
| 3.2.4 SpCas9-NG植物基因组编辑系统特异性分析 |
| 3.3 水稻FnCas12a基因组编辑系统构建 |
| 3.3.1 水稻FnCas12a基因组编辑系统设计及验证 |
| 3.3.2 基于水稻原生质体瞬时转化的FnCas12a编辑特征分析 |
| 3.3.3 基于水稻稳定转化的FnCas12a编辑活性评价 |
| 3.3.4 FnCas12a植物基因组编辑系统PAM识别偏好性分析 |
| 3.3.5 FnCas12a植物基因组编辑系统特异性分析 |
| 3.4 基于Cas12a核酸酶变体的水稻基因组编辑系统构建 |
| 3.4.1 基于水稻原生质体瞬时转化的Cas12a核酸酶变体编辑特征分析 |
| 3.4.2 基于水稻稳定转化的Cas12a核酸酶变体编辑活性评价 |
| 3.5 基于内含子剪切加工的CRISPR-Cas植物基因组编辑新系统构建 |
| 3.5.1 iSTU-CRISPR/Cas基因组编辑系统设计 |
| 3.5.2 基于水稻原生质体瞬时转化的iSTU-CRISPR/Cas编辑系统活性评价 |
| 3.5.3 基于水稻稳定转化的iSTU-CRISPR/Cas编辑系统活性评价 |
| 3.5.4 基于iSTU-CRISPR/Cas编辑系统的共编辑活性评价 |
| 3.6 基于CRISPR-Cas新成员挖掘的植物基因组编辑新系统构建 |
| 3.6.1 基于数据挖掘的LacCas9 鉴定、特征分析及系统构建 |
| 3.6.2 基于原生质体瞬时转化的LacCas9 编辑特征分析 |
| 3.6.3 基于水稻原生质体瞬时转化的LacCas9 系统的特异性及温度敏感性分析 |
| 3.6.4 基于水稻稳定转化的LacCas9 编辑系统活性评价 |
| 3.6.5 基于LacCas9 核酸酶的植物基因组单碱基编辑系统 |
| 3.6.6 基于LacCas9 核酸酶的植物内源功能基因定向表达调控 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 基于SpCas9 核酸酶变体的植物基因组可编辑范围拓展及特异性分析 |
| 4.2 CRISPR-Cas12a及其变体的高效植物基因组编辑系统构建及应用 |
| 4.3 iSTU-CRISPR/Cas植物基因组编辑系统构建及应用 |
| 4.4 植物新CRISPR-Cas9 基因组编辑工具开发 |
| 第五章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（5）广西和新疆地区蝙蝠病毒组及小型环状DNA病毒遗传多样性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 指环病毒 |
| 1.2 圆环病毒 |
| 1.3 Gemycircularvirus |
| 第二章 桂越边境地区蝙蝠病毒组的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 蝙蝠样品 |
| 2.1.2 试剂及材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 生物信息学软件及数据库 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蝙蝠样品的处理 |
| 2.2.2 蝙蝠样品的病毒宏基因组处理 |
| 2.2.3 Illumina高通量测序 |
| 2.2.4 病毒核酸提取和反转录 |
| 2.2.5 病毒检测的引物设计 |
| 2.2.6 病毒检测的PCR反应体系 |
| 2.2.7 电泳、胶回收、连接、转化和测序 |
| 2.2.8 病毒的检测与进化分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 蝙蝠种类鉴定及样品采集信息 |
| 2.3.2 高通量测序结果 |
| 2.3.3 Contigs分析 |
| 2.3.4 PCR检测及进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 我国蝙蝠携带小型环状DNA病毒的遗传多样性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 蝙蝠样品 |
| 3.1.2 病毒检测扩增的实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 生物信息学软件 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 宏基因组处理和高通量测序 |
| 3.2.2 PCR检测 |
| 3.2.3 全基因组的扩增 |
| 3.2.4 基因组结构注释与序列上传 |
| 3.2.5 多序列比较 |
| 3.2.6 进化分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 高通量测序后reads情况 |
| 3.3.2 蝙蝠携带双环病毒的检测和全基因组扩增 |
| 3.3.3 双环病毒遗传进化分析 |
| 3.3.4 蝙蝠携带圆环病毒的检测与全序列扩增 |
| 3.3.5 圆环病毒遗传进化分析 |
| 3.3.6 蝙蝠携带指环病毒的检测与全序列扩增 |
| 3.3.7 指环病毒遗传进化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）鼠源TTV基因组分析与呼吸道HRSV抗病毒药物筛选（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 鼠源TTV基因组分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 主要仪器与试剂 |
| 1.2 主要技术路线 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 病毒基因组的提取 |
| 1.3.2 非序列依赖单引物PCR(SISPA-PCR) |
| 1.3.3 PCR产物的纯化及电泳 |
| 1.3.4 高通量基因组测序及生物信息学分析 |
| 1.3.5 全长扩增引物设计与合成 |
| 1.3.6 RoTTV病毒基因组验证及RoTTV病毒全基因组扩增 |
| 1.3.7 PCR扩增产物纯化、克隆及Sanger测序 |
| 1.3.8 病毒基因组注释及遗传进化分析 |
| 1.3.9 检测方法建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 核酸SISPA扩增结果 |
| 2.2 高通量基因组测序及RoTTV3-HMU1 病毒基因组全长扩增 |
| 2.3 基因组结构分析及遗传进化分析 |
| 2.4 RoTTV3 病毒real-time PCR检测方法建立 |
| 2.4.1 标准品的制备 |
| 2.4.2 引物灵敏度检测 |
| 2.4.3 Real-time PCR标准曲线的建立及溶解曲线分析 |
| 2.5 RoTTV3 病毒感染的家鼠肝组织中病毒的定量检测 |
| 3 讨论 |
| 4.小结 |
| 第二章 呼吸道HRSV抗病毒药物筛选 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 细胞与病毒株 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 主要技术路线 |
| 1.4 细胞培养基及药物配制 |
| 1.5 HRSV-A的扩增、PCR验证及病毒TCID_(50)的测定 |
| 1.5.1 病毒扩增 |
| 1.5.2 HRSV-A PCR验证 |
| 1.5.3 病毒TCID_(50)的测定 |
| 1.6 药物细胞毒性评价 |
| 1.6.1 CPE观察法测定药物细胞毒性 |
| 1.6.2 CCK-8 法测定药物细胞毒性 |
| 1.7 药物抗病毒效果评价 |
| 1.7.1 CPE法测定药物半数有效浓度(EC_(50))及药物的治疗指数(TI) |
| 1.7.2 CCK-8 法测定药物半数有效浓度(EC_(50))及药物的治疗指数(TI) |
| 1.7.3 药物抗病毒实验 |
| 1.8 天然药品库的初筛 |
| 1.9 EGCG药物半数致死率(TC_(50))测定 |
| 1.10 EGCG药物半数有效率(EC_(50))测定及抗病毒实验 |
| 1.11 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗病毒实验 |
| 1.12 统计学处理 |
| 2.结果 |
| 2.1 HRSV-A病毒扩增、PCR验证及病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.1.1 HRSV-A扩增: |
| 2.1.2 HRSV-A PCR验证 |
| 2.1.3 病毒TCID50的测定 |
| 2.2 药物的细胞毒性测定 |
| 2.2.1 CPE法测定药物的细胞毒性 |
| 2.2.2 CCK-8 法测定药物的细胞毒性 |
| 2.3 药物抗HRSV-A病毒药效实验 |
| 2.3.1 CPE法 |
| 2.3.2 CCK-8法 |
| 2.3.3 药物的细胞上清病毒滴度测定 |
| 2.4 CPE和 CCK-8 两种方法实验结果比较 |
| 2.5 EGCG药物半数致死率(TC_(50))测定结果 |
| 2.6 EGCG药物半数有效率(EC_(50))测定及抗病毒实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）我国啮齿目动物携带的指环病毒基因组学特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 前言 |
| 一、啮齿类动物—病毒重要的自然宿主 |
| 二、指环病毒科研究进展 |
| 2.1 TTVs的发现和分类 |
| 2.2 TTVs的病原学特征 |
| 2.3 TTVs的遗传变异性 |
| 2.4 流行病学 |
| 2.5 疾病相关性 |
| 2.6 动物的TTVs |
| 三、高通量测序检测病毒感染中的应用 |
| 四、本研究的立题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 主要实验设备 |
| 1.2 主要实验试剂耗材 |
| 1.3 溶液配制 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 样品的采集 |
| 2.2 建立核酸文库 |
| 2.3 Hiseq文库构建及Hiseq测序准备实验 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 病毒鉴定及保守区域扩增 |
| 2.6 病毒全基因组扩增 |
| 2.7 数据分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 一、啮齿目动物携带指环病毒的高通量检测及宏基因组分析 |
| 1.1 啮齿目动物样本文库的种类组成及地域分布 |
| 1.2 啮齿目动物病毒组cDNA文库构建 |
| 1.3 Hiseq高通量测序结果 |
| 1.4 生物信息分析结果 |
| 1.5 啮齿动物中指环病毒科的病毒载量情况 |
| 二、啮齿目动物指环病毒的全基因组特征 |
| 2.1 指环病毒筛查及全基因组扩增 |
| 2.2 指环病毒基因组特点 |
| 三、遗传进化分析 |
| 3.1 啮齿目动物指环病毒的ORF1的系统发育分析 |
| 3.2 啮齿目动物指环病毒的ORF2的系统发育分析 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 发表文章 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）猪细环病毒的序列分析及抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.1 猪细环病毒 |
| 1.1.1 TTV的分类 |
| 1.1.2 TTSuV的病原学特点 |
| 1.1.3 TTSuV的流行病学特点 |
| 1.1.4 TTSuV的感染方式 |
| 1.1.5 TTSuV的致病性特点 |
| 1.2 病毒检测的生物学诊断 |
| 1.2.1 病原学诊断方法 |
| 1.2.2 血清免疫学法 |
| 1.2.3 原位杂交法 |
| 1.3 TTV与人类的关系 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要实验仪器及材料 |
| 2.1.2 载体、病毒和细胞 |
| 2.1.3 主要商品化试剂盒 |
| 2.1.4 常用试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 TTSuV病毒基因组的提取 |
| 2.2.2 TTSuV基因的克隆 |
| 2.2.3 酶切和连接 |
| 2.2.4 Top10感受态的制备 |
| 2.2.5 转化连接产物 |
| 2.2.6 质粒的小量提取 |
| 2.2.7 重组质粒的酶切检测及测序鉴定 |
| 2.2.8 细胞培养及细胞转染技术 |
| 2.2.9 细胞涂片（以一孔为例） |
| 2.2.10 间接免疫荧光处理流程 |
| 2.2.11 序列测序 |
| 2.2.12 进化树分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 TTSuV进化树分析 |
| 3.2 TTSuV间接免疫荧光检测方法的建立 |
| 3.2.1 TTSuV1 Cap基因的PCR扩增 |
| 3.2.2 TTSuV基因载体的构建 |
| 3.2.3 间接免疫荧光抗体检测方法的建立 |
| 3.2.4 间接免疫荧光抗体检测方法的临床应用 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（9）PRRSV与PCV2的分子流行病学调查及其重组腺病毒疫苗实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写对照表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 |
| 1.1 基因分型 |
| 1.2 基因结构和复制 |
| 1.3 PRRSV感染 |
| 1.4 抗感染免疫反应 |
| 1.5 PRRSV感染对宿主免疫的影响 |
| 1.6 PRRSV疫苗的研究现状 |
| 第二章 猪圆环病毒研究进展 |
| 2.1 PCV2基因组结构 |
| 2.2 PCV2基因分型 |
| 2.3 PCV2感染与流行状况 |
| 2.4 PCV2感染后与免疫细胞因子间的相互作用 |
| 2.5 免疫保护 |
| 2.6 PCV2疫苗研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新发猪病毒病流行病学调查及检测方法的建立 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 PRRSV和PCV2流行病学调查研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PRRSV-PCV2重组腺病毒候选疫苗构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PRRSV-PCV2重组腺病毒候选疫苗小鼠免疫实验 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 PRRSV-PCV2重组腺病毒候选疫苗猪体免疫实验 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（10）严重急性呼吸道感染儿童呼吸道样品病毒组学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 严重急性呼吸道感染概述 |
| 1.2 儿童呼吸道感染的病原和检测 |
| 1.3 病毒宏基因组学研究进展 |
| 1.4 深度测序在病毒组学中的应用 |
| 1.5 病毒组学分析的内容和流程 |
| 1.6 病毒基因组的生物信息学分析 |
| 1.6.1 序列比对 |
| 1.6.2 系统发育分析 |
| 1.6.3 基因重组分析 |
| 1.6.4 选择压力分析 |
| 1.6.5 时间、地理相关进化分析 |
| 1.6.6 蛋白空间结构分析 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 呼吸道样品深度测序方法的初步摸索 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 样品的前期优化处理 |
| 2.2.2 核酸扩增方法的优化选择 |
| 2.2.3 人冠状病毒特异性扩增方法摸索 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 样品前期优化处理组与非处理组比较分析 |
| 2.3.2 SISPA与MDA扩增方法比较分析 |
| 2.3.3 冠状病毒特异性扩增测序分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 严重急性呼吸道感染儿童呼吸道样品深度测序 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试剂和仪器 |
| 3.1.2 常用软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 样品的采集 |
| 3.2.2 样品的分组 |
| 3.2.3 样品的预处理和核酸扩增 |
| 3.2.4 高通量测序 |
| 3.2.5 数据分析和上传 |
| 3.2.6 病原验证和进化分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 初步数据分析 |
| 3.3.2 病原种类分析 |
| 3.3.3 比较分析确定儿童SARI主要致病原 |
| 3.3.4 指环病毒科分析 |
| 3.3.5 动物源性病毒 |
| 3.3.6 噬菌体和细菌等其它病原 |
| 3.3.7 测序深度和测序覆盖度 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 二种呼吸道病毒全基因组测序与生物信息分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试剂与仪器 |
| 4.1.2 使用软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 一株C型腺病毒全基因组测序与分析 |
| 4.2.2 人博卡病毒全基因组测序与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 HAdV全基因组扩增与进化分析 |
| 4.3.2 HBoV全基因组扩增与进化分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 本论文主要结论 |
| 5.2 本论文创新点 |
| 5.3 尚待进一步解决的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表综述 急性呼吸道感染相关病毒组学研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、TTV基因组的克隆与进化分析（论文参考文献）
- [1]云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究[D]. 王倩. 山东大学, 2021(10)
- [2]江苏某地区HIV感染人群血液病毒宏基因组学研究[D]. 窦安华. 扬州大学, 2021(08)
- [3]两株猪细环病毒的全基因组测序及分析[D]. 陈柯. 南阳师范学院, 2021(11)
- [4]水稻CRISPR-Cas基因组编辑新系统构建及应用[D]. 仲昭辉. 电子科技大学, 2021(01)
- [5]广西和新疆地区蝙蝠病毒组及小型环状DNA病毒遗传多样性研究[D]. 燕超. 宁夏大学, 2019(02)
- [6]鼠源TTV基因组分析与呼吸道HRSV抗病毒药物筛选[D]. 吴悦. 海南医学院, 2019(02)
- [7]我国啮齿目动物携带的指环病毒基因组学特征分析[D]. 李玉晖. 北京协和医学院, 2018(02)
- [8]猪细环病毒的序列分析及抗体检测方法的建立[D]. 王玲. 南阳师范学院, 2018(08)
- [9]PRRSV与PCV2的分子流行病学调查及其重组腺病毒疫苗实验免疫研究[D]. 孙文超. 广西大学, 2017(12)
- [10]严重急性呼吸道感染儿童呼吸道样品病毒组学研究[D]. 王延群. 中国疾病预防控制中心, 2016(03)
标签：基因组论文; 全基因组关联分析论文; 高通量测序论文; 全基因组测序论文; 基因合成论文;