一、TRAF——调节细胞生存和死亡的衔接蛋白（论文文献综述）
金争[1]（2021）在《TRIM59调节巨噬细胞吞噬和细胞因子表达及其在脓毒血症中的作用研究》文中提出脓毒血症是由宿主对感染的反应失调引起的危及生命的疾病,影响着数百万患者的健康,尤其是住院患者。脓毒血症的死亡率高达25%,其高发病率和高死亡率无疑给全球带来了巨大的卫生成本,因此,全面了解脓毒血症的发病机制及其缓解因素至关重要。脓毒血症患者死亡原因主要是微血管功能障碍,其特征是血管屏障功能受损、免疫细胞浸润、过度炎症、过度凝血和缺血,最终导致多器官衰竭。当固有免疫系统细胞上的TLRs识别出病原微生物时,固有免疫细胞被激活,通过转录因子NF-κB等触发多种细胞因子表达,如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8等,可引起中性粒细胞与血管内皮细胞粘附,激活补体,促进凝血,导致微血栓的产生。并且,当病原体入侵时,一些固有免疫细胞如中性粒细胞、巨噬细胞也会通过吞噬作用而减少入侵的病原体,从而减轻脓毒血症。因此,固有免疫应答在脓毒血症中发挥重要作用。巨噬细胞是固有免疫应答的重要组成部分,在许多疾病中起关键作用。巨噬细胞具有多种功能,包括:（1）分泌细胞因子,如IL-1、IL-6和TNF-α;（2）吞噬病原体;（3）抗原呈递。在固有免疫系统对感染产生的初始反应中,IL-1β、IL-6和TNF-α发挥重要作用。TNF-α和IL-1β能激活内皮细胞,并将循环中的多形核白细胞吸引到感染部位,然而,这些细胞因子也进入血液,引起发热和其他全身症状。IL-6刺激肝脏产生急性期反应物以刺激炎症反应,加剧炎症,因此,在脓毒血症早期,巨噬细胞产生的大量促炎细胞因子能加剧疾病的进展。巨噬细胞可通过表面多种受体介导吞噬并消化凋亡细胞和入侵的病原体,减少凋亡细胞释放内含物和机体的细菌载量,控制炎症进一步加重。以往的研究表明,脓毒血症患者巨噬细胞表面MHCII蛋白表达减少,抗原呈递功能减弱,导致T细胞不能有效激活,加重脓毒血症。因此,巨噬细胞通过抗原呈递、吞噬和产生多种细胞因子等多种功能在脓毒血症的进展中起着重要作用。TRIM59蛋白是TRIM家族的一员,它由一个RING结构域、一个B-Box结构域（B-Box2）、一个卷曲螺旋结构域和C端的跨膜结构域构成,TRIM蛋白家族的结构类似,呈高度保守状态,也被称为RBCC蛋白家族。TRIM蛋白参与固有免疫应答,近年来研究证实TRIM家族蛋白可以抑制逆转录病毒感染,影响IFN信号通路和NF-κB信号通路等多种信号通路。TRIM59在多种肿瘤中高表达,并促进肿瘤的发展。也有研究证明,TRIM59在LPS刺激的单核细胞系及巨噬细胞系中低表达,且TRIM59影响LPS刺激的巨噬细胞的活化水平。还有研究发现,TRIM59可与ECSIT结合并相互作用,进而通过NF-κB和IRF3/7介导的信号通路调节固有免疫应答。我们之前的研究也发现,TRIM59可以促进巨噬细胞的吞噬作用。因此,TRIM59可能通过调控巨噬细胞在炎症相关疾病中发挥重要作用。TRIM59通过与ECSIT相互作用,调控NF-κB和IRF3/7介导的信号通路进而影响固有免疫免疫应答,且TRIM59影响LPS刺激的巨噬细胞的活化水平,增强巨噬细胞的吞噬作用。巨噬细胞可通过其抗原呈递、吞噬、分泌多种细胞因子等多种功能在脓毒血症的发生发展中起重要作用,然而,巨噬细胞上的TRIM59在脓毒血症的作用尚未被探讨。因此,为探究巨噬细胞上TRIM59在脓毒血症中的作用及机制,我们从以下三个方面开展研究:1.巨噬细胞缺失TRIM59蛋白对小鼠脓毒血症的影响为明确TRIM59在LPS刺激的巨噬细胞中的表达情况,我们取C57BL/6N小鼠的骨髓干细胞诱导成BMDMs,用LPS对BMDMs和小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行时间梯度和浓度梯度刺激,结果显示经LPS刺激后,TRIM59的表达明显降低,且LPS在低浓度和短时间的刺激条件下即可降低TRIM59的表达。为明确巨噬细胞缺失TRIM59蛋白对小鼠脓毒血症的影响,我们采用Loxp-Cre系统成功构建出骨髓来源巨噬细胞条件性敲除Trim59基因的Trim59-c KO小鼠及其对照小鼠Trim59flox/flox小鼠,通过CLP手术对Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠构建了经典的小鼠脓毒血症模型,观察了小鼠7天的生存率;在CLP术后24h经麻醉后处死小鼠,取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑,检测小鼠主要器官的损伤及炎性细胞浸润情况;同时在术后24h取小鼠外周血、脾脏和肠系膜淋巴结,用流式细胞术检测了这些组织中巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的百分比和绝对数。结果显示,Trim59-c KO脓毒血症小鼠的生存率下降,血清ALT和AST均升高,肝脏出血增多,损伤加重;Trim59-c KO脓毒血症小鼠肺的结构破坏加重,炎性细胞浸润增多,外周血浸润的中性粒细胞也增多。这些结果提示,巨噬细胞缺失TRIM59蛋白后,小鼠脓毒血症加重。2.脓毒血症中TRIM59调控巨噬细胞吞噬作用的相关研究为探究脓毒血症中TRIM59是否调控巨噬细胞吞噬作用,我们在CLP术后24h收集Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠的外周血和腹腔液进行菌培养,并用LPS刺激Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠的BMDMs后,再加入Ig G预处理的表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌,用流式细胞仪和荧光显微镜检测经上述处理后的BMDMs吞噬能力的变化。结果发现,Trim59-c KO脓毒血症小鼠外周血和腹腔液中的细菌含量均增加,且Trim59敲除后,BMDMs的吞噬能力明显降低,Ig G介导的调理性吞噬也明显下降。巨噬细胞的调理性吞噬是巨噬细胞发挥吞噬作用的重要的一环。上述研究结果表明,TRIM59调控了巨噬细胞Ig G介导的调理性吞噬。为探索TRIM59调控巨噬细胞吞噬功能的深层机制,我们用流式细胞术检测了Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠BMDMs的Fcγ受体CD16/32、CD64的表达,当LPS刺激时,Trim59缺失的BMDMs Fcγ受体的表达明显下调。这些结果表明,在炎性环境中,巨噬细胞中Trim59的缺失与Fcγ受体表达下降有关。巨噬细胞的抗原呈递功能在脓毒血症中也发挥作用。为探究BMDMs缺失Trim59后其抗原呈递相关受体的表达情况,我们用流式细胞术检测了Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠BMDMs上抗原呈递相关分子MHCII、CD80和CD86的表达情况,结果发现,在LPS刺激下两种BMDMs上MHCII、CD80和CD86的表达无显着差异,表明巨噬细胞缺失Trim59不影响其抗原呈递相关受体的表达,提示在小鼠脓毒血症中,TRIM59可能不调控巨噬细胞抗原呈递功能。3.脓毒血症中TRIM59调控巨噬细胞表达细胞因子的相关研究除吞噬功能外,巨噬细胞也可分泌大量的细胞因子影响脓毒血症进展。在上述结果中,我们观察到Trim59-c KO脓毒血症小鼠外周血中性粒细胞浸润增多,重要器官损伤和炎性细胞浸润也增多,提示脓毒血症中,TRIM59可能影响巨噬细胞表达炎性细胞因子。为明确脓毒血症中TRIM59是否通过影响巨噬细胞表达炎性细胞因子,我们取Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠CLP术后24h的血清和支气管肺泡灌洗液,检测细胞因子的含量,发现Trim59-c KO脓毒血症小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量显着增加,支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β表达上调,且在假手术组中,Trim59-c KO小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量也增加,支气管肺泡灌洗液中IL-1β表达也上调。取Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠的BMDMs,并用LPS刺激后,发现在基因水平,Tnf-α、Il-6、Il-1β和Nos2的表达增加,在蛋白水平,TNF-α、和IL-1β表达增加,且未经LPS刺激的Trim59-c KO小鼠的BMDMs中IL-1β表达也增加。用LPS刺激Trim59敲低的RAW264.7细胞系及其对照细胞系,发现Trim59敲低后RAW264.7细胞不论是在基因水平还是蛋白水平,其表达的TNF-α、IL-6、IL-1β均增加。这些结果表明,不论是在体内实验和体外实验中,巨噬细胞缺失TRIM59促进其表达促炎细胞因子,且在正常状态下,TRIM59具有一定的抑炎作用。已有研究表明,TRIM59可以改变LPS介导的炎症反应,LPS可通过NF-κB信号通路诱导巨噬细胞产生多种促炎细胞因子,参与炎症反应。为明确TRIM59对NF-κB通路的影响,我们用LPS刺激Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠的BMDMs,发现在TRIM59缺失的BMDMs中,IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化水平上调,TRIM59缺失的BMDMs细胞核中p65的表达也增加,提示在巨噬细胞中,TRIM59通过NF-κB途径增强了LPS诱导的炎症反应。已有研究表明TRIM59可通过ECSIT调控NF-κB信号通路,并通过PI3K/AKT信号通路调控多种细胞的增殖,PI3K/AKT信号通路通过IKKα激活NF-κB信号通路。为明确TRIM59是否通过ECSIT/MAP3K1蛋白及PI3K/AKT信号通路调控LPS激活的NF-κB信号通路,我们用LPS刺激Trim59flox/flox小鼠和Trim59-c KO小鼠的BMDMs,发现ECSIT和MAP3K1的表达及PI3K/AKT信号通路没有显着变化,提示TRIM59可以通过NF-κB信号通路调节LPS诱导的炎症反应,但其作用的相关分子和特异性结合位点尚需进一步研究。我们的研究首次证明巨噬细胞缺失TRIM59蛋白可促进小鼠脓毒血症的进展,Trim59-c KO小鼠CLP手术后,生存率下降,肝和肺损伤增加,细菌负荷增加,促炎细胞因子表达也增加;LPS刺激Trim59敲除的BMDMs时,Fcγ受体的表达下调,吞噬功能减弱,促炎细胞因子的分泌增加,NF-κB信号通路异常激活。本研究为脓毒血症相关研究拓宽了思路,为TRIM蛋白在炎症相关疾病中作用提供了新的证据。
谭国婷[2]（2021）在《肿瘤坏死因子受体相关因子1在晚期肺癌患者外周血中的表达及其临床意义》文中指出目的:肿瘤坏死因子受体相关因子1（tumor necrosis factor receptor related factor 1,TRAF1）通过调节依赖TRAF1的信号通路参与各种重要的细胞生物学过程。研究发现TRAF1在非小细胞肺癌组织中的表达上调,并在肿瘤的浸润、进展及远处转移过程中有着重大作用。然而,TRAF1在肺癌患者血清中的表达水平尚不清楚。本研究通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者化疗前后及健康人群血清中TRAF1的表达水平,探讨血清TRAF1在Ⅲ～Ⅳ期肺癌中的临床意义。方法:本研究采用ELISA法检测60例Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者及同期体检的60例健康者血清中TRAF1的表达水平,比较肺癌患者与健康对照组血清中TRAF1表达水平的差异。分析肺癌患者血清TRAF1水平在性别、年龄、吸烟状况、病理类型、肿瘤位置、TNM分期等不同临床病理特征上是否存在差异。60例肺癌患者均接受常规化疗方案化疗2个周期,检测其化疗后血清TRAF1水平,并与化疗前相比是否有差异。应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）计算曲线下面积（area under the curve,AUC）用于评估血清TRAF1对肺癌的诊断价值。结果:（1）肺癌患者血清中TRAF1的表达水平明显高于健康对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）血清TRAF1在不同性别、年龄、吸烟状况、病理类型、有无骨转移、有无脑转移和不同肿瘤位置（左肺或右肺）中的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。（3）Ⅳ期肺癌患者血清TRAF1水平明显高于Ⅲ期肺癌患者,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）肺癌患者化疗2周期后血清TRAF1水平较化疗前明显下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;肺腺癌组化疗后血清TRAF1明显低于化疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）;肺鳞癌组化疗后血清TRAF1显着低于化疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）;小细胞肺癌组化疗后血清TRAF1水平较化疗前无显着改变,差异无统计学意义（P>0.05）。（6）血清TRAF1诊断肺癌的ROC曲线的AUC为0.893,血清TRAF1的最佳截断值为113.68pg/ml,灵敏度为90%,特异度为78.57%。血清TRAF1用于诊断肺腺癌的AUC为0.893,灵敏度为86.96%,特异度为87.69%;诊断肺鳞癌的AUC为0.886,灵敏度为70.83%,特异度为94.64%;诊断小细胞肺癌的AUC为0.906,灵敏度为50%,特异度为98%;其诊断肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌的最佳截断值分别为130.78pg/ml、98.62pg/ml、74.68pg/ml。结论:（1）血清TRAF1可能与肺癌的发病有关,且与肺癌的严重程度有关。（2）动态监测血清TRAF1水平可能有利于肺癌患者病情评估。（3）血清TRAF1可能对肺癌具有潜在的诊断价值,可以作为一种诊断肺癌的生物标志物。
农安娜[3]（2021）在《TLR9乙酰化修饰在脓毒血症中的免疫调节及其机制研究》文中指出目的:探究乙酰化修饰对天然免疫toll like receptor 9（TLR9）信号通路的调节机制,评估TLR9乙酰化修饰与脓毒血症进展之间的关系,阐明TLR9乙酰化修饰影响脓毒血症的作用机制,为脓毒血症的诊断和防治提供一个新的靶点。方法:（1）用乙酰化抗体结合质谱确定TLR9乙酰化修饰位点:在小鼠单核巨噬细胞Raw264.7中,用免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）结合免疫印迹（western blot,WB）技术证明TLR9发生乙酰化修饰。在人胚肾细胞293T中,将HA-TLR9质粒与乙酰化转移酶HA-CBP质粒共转染,用IP结合WB（应用泛乙酰化抗体）技术验证TLR9乙酰化修饰,并用质谱鉴定TLR9的乙酰化修饰位点;（2）在Raw264.7细胞中下调CBP表达后用TLR9配体ODN处理与不处理,再用免疫荧光（immunofluorescence,IF）技术检测TLR9乙酰化修饰对转录因子NF-κB进入细胞核的影响;（3）在293T细胞中过表达TLR9和TIRAP,分别加去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）、尼克酰胺（又名烟酰胺,niconictinamide,NAM）刺激细胞,经免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co IP）后做WB分析两者的相互作用;（4）在293T细胞中过表达TLR9和CBP后分别用ODN处理与不处理,应用报告基因技术检测NF-κB的反应元件活性,用酶联免疫吸附测定技术（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生;（5）用ODN处理BALB/c小鼠构建脓毒血症模型,应用免疫组化技术（immunocytochemistry,IHC）检测以上小鼠肺组织TLR9乙酰化及炎症因子水平,并进行分析比较。结果:（1）质谱鉴定结果表明TLR9分子上存在7个赖氨酸（Lysine,K）乙酰化位点;（2）ODN刺激可促进CBP出核并与TLR9相互作用;（3）下调CBP表达后,TLR9乙酰化水平显着降低;（4）CBP介导TLR9发生乙酰化修饰;（5）ODN诱导CBP和TLR9发生相互作用;（6）TSA或NAM促进TLR9和TIRAP发生相互作用;（7）下调CBP表达后,ODN诱导NF-κB进入细胞核减少;（8）过表达CBP增强NF-κB反应元件活性;（9）过表达CBP增加TLR9信号通路终产物TNF-α、IL-6、IL-1β的产生;（10）动物实验证实TLR9乙酰化修饰增加炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生。结论:（1）ODN诱导CBP出细胞核与TLR9发生相互作用,并介导TLR9在第348、361、381、472、475、489及657位K发生乙酰化修饰;（2）乙酰化修饰增强TLR9信号通路,增加炎症因子的产生,促进脓毒血症的进展。
李欢[4]（2020）在《肿瘤坏死因子α上调朊蛋白的水平促进肿瘤细胞迁移的分子机制》文中提出肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNFα）是一种重要的前炎症因子,在免疫,炎症,细胞的增殖,分化和凋亡的过程中具有重要的意义,可以调节肿瘤微环境,但是炎症促进癌症细胞迁移和转移的具体机制尚不清楚。因此从细胞分子水平探究上述机理对于癌症的治疗具有重要意义。第一章为研究背景的介绍。我们首先对黑色素瘤和肺癌相关情况进行说明,其次阐述了炎症因子TNFα的功能以及与癌症发生发展的关系,随后介绍了细胞中主要存在的两种降解系统,最后阐述文中涉及的叉头型转录因子3（Forkhead box protein P3,FOXP3）,突触相关蛋白29（Synaptosomal-associated protein 29,SNAP29）,朊蛋白（prion protein,Pr P）等相关蛋白的结构,功能以及在癌症中的作用。第二章为论文的主要研究内容,在黑色素瘤细胞系M2以及肺腺癌细胞系A549中,加入TNFα刺激后,肿瘤细胞迁移加快,Pr P表达升高。但是在敲除或敲降Pr P的细胞系中,癌症细胞的迁移速度不变,此现象是可回补的,所以Pr P是炎症促进癌症细胞迁移的重要分子。同时在迁移加快的细胞中发现Pr P的表达升高。但是在TNFα刺激下,Pr P的转录水平并没有发生变化,所以TNFα很可能改变了细胞降解水平,在M2和A549细胞系中,Pr P的降解主要通过自噬途径,那么TNFα是否改变癌症细胞的降解途径导致Pr P的表达升高?在TNFα作用下,自噬标志性蛋白微管相关蛋白1A/1B轻链3B（Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3B）和死骨片蛋白1（Sequestosome-1,SQSTM1/P62）升高,说明自噬体和溶酶体的融合受到抑制,双荧光质粒m Cherry-GFP-LC3转染这两种肿瘤细胞,黄色点状明显增加,同时证明此结论。TNFα使得自噬体和溶酶体过程的关键性蛋白SNAP29降低,主要机制为抑制此蛋白的转录水平。在M2和A549细胞系中敲除或敲降SNAP29,TNFα刺激不改变癌症细胞的迁移速度。FOXP3是重要的转录因子,维持免疫系统的内环境稳态方面具有重要的作用。启动子结合实验证明FOXP3是SNAP29的潜在转录因子,TNFα刺激激活核转录因子kappa b（nuclear factor kappa B,NF-κb）信号,降低FOXP3的表达,使得SNAP29蛋白表达减少。依据上述结论本文得出TNFα刺激抑制自噬体与溶酶体的融合,增加Pr P的表达,促进癌症细胞的迁移,因此干扰下述信号途径:TNFα-NF-κb-FOXP3-SNAP29可能提供一种抑制肿瘤细胞迁移的有效方法。第三章是对论文内容的总结以及讨论,TNFα刺激肿瘤细胞降低FOXP3的表达,抑制Pr P的降解,加快肿瘤细胞的迁移,但TNFα调控FOXP3的具体机制以及Pr P如何调控癌症细胞迁移的机制有待进一步的探究。
江康峰[5]（2020）在《IFN-τ对奶牛子宫内膜损伤的保护作用及其机制研究》文中研究说明由病原微生物感染引起的子宫内膜损伤是导致奶牛不孕的主要原因之一。IFN-τ作为牛、羊等反刍类动物滋养外胚层释放的一种特殊的I型干扰素,在子宫内膜微环境的免疫调控过程中发挥着十分重要的作用。本课题组早期的研究证实,IFN-τ通过经典的I型干扰素信号通路JAK/STAT调控Bo LA-I介导的免疫排斥反应,我们也发现IFN-τ在小鼠炎症模型中可以抑制机体的炎症免疫应答。然而,IFN-τ对炎性损伤的奶牛子宫内膜的调控作用以及抑制炎症免疫应答的分子机制尚未被完全揭露。本研究首先通过使用致病性大肠杆菌来源的脂多糖（LPS）刺激奶牛子宫内膜上皮细胞构建细胞损伤的体外模型,并发现一定浓度的IFN-τ可保护上皮细胞免受炎性损伤;接下来重点探讨了IFN-τ对其非经典通路PI3K/AKT的调节作用,并证实IFN-τ可通过激活PI3K/AKT抑制上皮细胞的炎性应答与凋亡;随后研究了受IFN-τ调节的miR-92b对PI3K/AKT等相关通路的靶向作用以深入探究IFN-τ抗损伤的分子机制,为进一步拓展IFN-τ在奶牛临床的应用价值以及后期筛选治疗子宫炎性损伤的miRNA分子靶点奠定了科学理论基础。本研究的主要内容与结果如下:（1）首先利用酶消化与机械法相结合的方式成功分离培养出原代子宫内膜上皮细胞,并使用不同浓度（0-20μg/m L）的LPS对细胞进行不同时间（0-24 h）的刺激,随后通过CCK-8和流式细胞术对细胞活力和凋亡情况进行检测。结果显示,10μg/m L的LPS刺激24 h后能够显着诱导子宫内膜上皮细胞发生凋亡,并以此条件构建本研究后续的细胞损伤模型。由于IFN-τ具有低细胞毒性的优良特性,本研究随后对IFN-τ的作用浓度进行了筛选,结果发现IFN-τ在20 ng/m L和40 ng/m L的浓度下能够显着缓解LPS过度刺激诱导的细胞损伤。Western blot结果进一步证实IFN-τ以浓度依赖性方式抑制细胞凋亡因子Bax/Bcl-2比值以及炎症信号蛋白TLR4和p-p65表达水平。以上结果表明,IFN-τ可保护子宫内膜上皮细胞免受炎性损伤。（2）PI3K/AKT通路不仅对细胞增殖起到调节作用,也可以抑制炎症反应的过度激活。结果表明,PI3K/AKT在子宫内膜上皮细胞的炎性损伤过程中呈现低表达模式,但IFN-τ可以上调并激活PI3K/AKT,而PI3K/AKT的特异性抑制剂LY294002则显着阻断IFN-τ对PI3K/AKT的激活作用,同时也抑制IFN-τ对TLR4、p-p65以及Bax/Bcl-2的下调作用。为了深入探究IFN-τ对PI3K/AKT通路的调控作用,本研究检测了IFN-τ对PI3K/AKT下游信号分子GSK3β、β-catenin和Foxo1表达的影响。Western blot和免疫荧光试验结果显示,IFN-τ通过激活PI3K/AKT上调p-GSK3β和p-Foxo1的表达水平并阻止β-catenin的降解。进一步分析发现,β-catenin激动剂SB216763在激活β-catenin后可上调p-Foxo1并下调p-p65,而敲减β-catenin则起到相反的作用。这些结果表明,IFN-τ通过PI3K/AKT介导的β-catenin抑制Foxo1和NF-κB p65的激活。此外,为了探索Foxo1在PI3K/AKT抑制TLR4中的关键作用,本试验在敲减Foxo1的同时使用LY294002抑制PI3K/AKT。结果发现,Foxo1的敲减能够阻断LY294002对TLR4的上调作用,同时也进一步加强IFN-τ对TLR4的抑制作用。最后,本研究在体内检验了IFN-τ对小鼠子宫内膜炎性损伤模型的保护作用。免疫荧光试验结果显示,IFN-τ能够抑制小鼠子宫内膜的细胞凋亡以及上调上皮细胞间紧密连接蛋白（TJPs）的表达,而使用LY294002抑制PI3K/AKT后可以阻断IFN-τ对小鼠子宫内膜损伤的保护作用。以上结果表明,IFN-τ通过激活PI3K/AKT/β-catenin通路抑制Foxo1继而阻止TLR4和NF-κB p65的活化。（3）miRNA广泛地参与人和动物体各种疾病的发生过程,例如奶牛子宫内膜炎。同样地,miRNA也参与了IFN-τ的炎症免疫调控过程。因此,本研究从miRNA的角度进一步探索IFN-τ保护细胞免受炎性损伤的分子机制。基于先前的高通量测序结果,本研究首先筛选出5个与奶牛子宫内膜炎密切关联的miRNA,并于牛子宫内膜上皮细胞系（BEND细胞）上验证了IFN-τ对它们的调控作用。RT-q PCR结果显示,IFN-τ显着上调miR-92b的表达。为了探究miR-92b是否参与IFN-τ的抗损伤过程,本试验将miR-92b inhibitor转染进BEND细胞抑制miR-92b后发现,IFN-τ对p-AKT的上调以及对p-p65和TLR4的下调均被显着性阻断。相反地,转染miR-92b mimic过表达miR-92b后可明显抑制LPS刺激诱导的TLR4、p-p65和Bax/Bcl-2的上调。为了揭示miR-92b抑制炎症与凋亡反应的分子机制,本研究对miR-92b的靶基因进行了KEGG通路富集。分析发现,miR-92b主要靶向PI3K/AKT等细胞增殖与炎症反应相关的通路,并进一步确证过表达miR-92b可以激活PI3K/AKT/β-catenin通路。双荧光素酶报告试验证实,miR-92b直接靶向PTEN m RNA 3’-UTR从而抑制胞内PTEN的蛋白水平。PTEN是PI3K/AKT的负调控因子,可通过抑制PI3K/AKT介导细胞的增殖与炎症反应。Western blot和免疫荧光试验结果显示,过表达PTEN可有效地逆转miR-92b对p-AKT的上调和对p-p65的下调,而敲减PTEN后却可上调p-AKT并抑制p-p65表达。β-catenin作为一种重要的共转录因子,据报道可在肿瘤细胞中介导PTEN的转录。为了证实β-catenin在炎症反应过程中对PTEN的调控作用,本试验使用β-catenin激动剂SB216763处理细胞后发现,上调β-catenin可显着抑制LPS诱导的PTEN表达,并激活p-AKT。以上结果表明miR-92b介导IFN-τ的抗损伤作用;miR-92b通过PTEN/PI3K/AKT/β-catenin信号轴抑制TLR4介导的细胞炎性应答与凋亡,而β-catenin也可负反馈调节PTEN的表达,并进一步加剧上游PI3K/AKT的激活。结论:IFN-τ对LPS介导的奶牛子宫内膜上皮细胞的炎性损伤具有保护作用,其作用机制是通过上调miR-92b靶向PTEN从而激活PI3K/AKT/β-catenin通路,进而抑制TLR4/NF-κB驱动的炎症与凋亡反应,保护细胞免受炎性损伤。
宋煜[6]（2020）在《CUL4B在调控TLR介导的炎症反应中的作用及其机制》文中研究说明固有免疫对于机体抵御致病微生物的侵害是非常重要的。巨噬细胞作为固有免疫反应中发挥关键作用的效应细胞,负责对感染的快速识别以及对致病微生物进行清除。固有免疫系统主要是通过模式识别受体（Pattern-recognition receptor,PRR）对病原体中广泛存在的特定分子结构即病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern,PAMP）完成特异性的识别。PRR 通过 PAMP进而启动下游级联信号传导程序来清除病原体。Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）是一种进化上保守的PRR,对于识别和消除病原体具有非常重要的作用,TLR可以辨别来自不同病原体的PAMPs。TLRs识别PAMPs后,触发一系列信号激活核转录因子NF-кB促使巨噬细胞等固有免疫细胞分泌趋化因子和炎性因子,启动固有免疫应答进行宿主防御。因此,TLR在固有免疫应答中起着至关重要的作用。然而,异常的TLR信号也会导致炎症反应异常和众多的免疫性疾病,败血症就是其中之一,这是一种以持续过度炎症和免疫抑制为特征的病理综合症,具有很高的发病率和死亡率。尽管目前对败血症中关键的发病机制的了解已大大增加,但在临床上仍缺乏完全有效的治疗方法。为此,探究TLR信号的作用机制,避免TLR信号的异常活化意义重大。Cullin 4B（CUL4B）蛋白是 Cullin-4B Ring E3 连接酶复合物（CRL4B）中的支架蛋白,通过针对特定底物进行泛素依赖性降解或修饰来参与调节各种生理和发育的过程。在人群中,CUL4B突变导致X连锁智力低下综合征,病患除了智力障碍外,还表现出单核细胞数升高等其他缺陷,提示CUL4B可能在单核巨噬细胞功能方面有作用。我们实验室近期的研究结果显示,CRL4B复合物协同转录抑制复合物PRC2促进H3K27三甲基化（H3K27me3）,抑制一系列抑癌基因的转录并促进肿瘤的发生发展,另一方面CRL4B复合物通过协同PRC2及HDAC复合物转录抑制磷酸酶PP2A与PHLPP1/2进而调控AKT/β-catenin信号通路,这些结果说明CUL4B参与表观遗传调控。目前,表观遗传修饰已被证明对于感染和病原体引起的免疫响应具有关键的调节功能。同时,随着TLR信号调控网络的日渐完善,表观遗传修饰在众多TLR诱导基因转录调控过程中的作用逐渐显现。而CUL4B复合物作为一个转录抑制因子是如何参与TLR相关的免疫信号途径的尚不清楚。基于上述事实,本课题通过髓系细胞特异性敲除Cul4b基因小鼠对CUL4B在TLR介导的固有免疫应答中的作用及其机制进行了研究。第一部分CUL4B缺失促进TLR介导的炎症反应本部分主要利用病原体诱导的小鼠疾病模型探究CUL4B在TLR介导的固有免疫应答中的作用,并取得以下结果。1.成功构建了特异性敲除髓系细胞Cul4b的小鼠（Myeloid cell specific KO,MKO）。利用流式检测小鼠的各种髓系细胞组成,发现Cul4b缺失不影响小鼠的脾脏和骨髓中的单核细胞、巨噬细胞、树突细胞以及中性粒细胞的比例与数量。2.LPS诱导BMDM,qRT-PCR分析细胞炎性因子的水平,结果表明在TLR2/3/4的配体诱导以后,MKO的BMDM中Tnfα、Il1β、Il6以及Ifnβ的mRNA表达量高于WT的BMDM,说明CUL4B缺失促进TLR2/3/4配体诱导的炎性因子表达。3.TLR2/3/4的配体诱导后,MKO的BMDM分泌到培养基中的炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6以及IFNβ明显高于WT的BMDM分泌的炎性因子。4.分别给予小鼠脂多糖（LPS）刺激和鼠伤寒沙门氏杆菌（SL1344）感染,模拟革兰氏阴性菌感染造成的败血症休克,并通过检测小鼠血液中TNF-α、IL-1β和IL-6,分析血液细菌容量和小鼠生存率来分析CUL4B敲除对巨噬细胞中TLR信号的影响。我们发现,在LPS以及革兰氏阴性菌造成的小鼠败血症症模型中,MKO小鼠具有更严重的炎症反应和更高的死亡率。5.小鼠体内实验,TLR3的配体poly（I:C）诱导小鼠感染,对小鼠外周血中炎性因子TNF-α、IL-6以及IFNβ的含量进行了检测并且统计分析了两种基因型小鼠的生存率。实验结果表明MKO小鼠血液中TNF-α、IL-6以及IFNβ的含量明显多于WT小鼠,并且MKO小鼠的死亡率也明显高于WT小鼠。综合以上结果,小鼠髓系细胞缺失CUL4B加重了 TLR3/4配体诱导的炎性因子分泌和感染性休克。因此CUL4B负调控TLR2/3/4介导的固有免疫应答。第二部分CUL4B通过抑制GSK3β活性调控TLR2/3/4介导的免疫应答上一部分结果,我们发现CUL4B缺失促进TLR信号诱导的固有免疫反应,那么其发挥调控作用的分子机制又是怎样的呢?研究表明GSK3β是多种TLR信号通路中促炎细胞因子产生的关键调控分子,GSK3β抑制剂可以有效抑制促炎细胞因子的产生,并促进抗炎性因子IL-10的产生。尽管这些研究清楚地证明了 GSK3β在TLR介导的细胞因子产生中的重要性,但是GSK3β活性的调节机制知之甚少。实验室前期结果显示CRL4B可以调控GSK3β活性。那么,CUL4B负调控TLR2/3/4介导的免疫应答是否是通过调控GSK3β实现的呢?为此,我们进行如下分析:1.我们首先检测了 CUL4B缺失对LPS诱导的GSK3β活性的影响,发现CUL4B敲除的巨噬细胞在响应LPS诱导时下调GSK3β的S9位磷酸化水平,提示巨噬细胞CUL4B敲除后GSK3β的激酶活性显着提高。2.与LPS诱导结果一致,CUL4B敲除的BMDM在响应poly（I:C）或者PGN诱导时GSK3β S9位磷酸化水平显着低于WT巨噬细胞,这些结果表明在TLR2/3介导的固有免疫信号中CUL4B缺失增强GSK3β激酶活性。3.为了验证上述观点,我们利用GSK3β抑制剂对LPS或poly（I:C）诱导的小鼠进行拯救实验,发现GSK3β抑制剂能明显缓解休克模型中MKO小鼠的症状、降低死亡率。4.研究显示GSK3β可以增强NF-кB转录活性而抑制CREB的转录活性。因此,我们采用报告基因和Western分析方法检测了缺失CUL4B对巨噬细胞NF-кB和CREB转录活性的影响。发现敲除髓系细胞CUL4B导致NF-кB的转录活性增强,而CREB的转录活性降低,进而减少了抑炎因子IL-10表达。综上所述,CUL4B通过抑制GSK3β活性进而调控TLR2/3/4介导的固有免疫应答反应。第三部分CUL4B通过抑制Pten转录负调控TLR2/3/4介导的免疫应答第二部分我们发现CUL4B通过抑制GSK3β活性调控TLR2/3/4诱导的固有免疫反应,那么CUL4B是如何调控GSK3β活性的呢?为此,我们进行了以下分析:1.GSK3β（S9）的磷酸化受AKT催化,我们首先检测了缺失CUL4B对AKT活性的影响。发现AKT的两个活性位点Thr308、Ser473的磷酸化水平在TLR2/3/4配体刺激下MKO巨噬细胞中都显着低于对照小鼠巨噬细胞;2.分析催化AKT磷酸化和去磷酸化的激酶和磷酸酶发现,敲除CUL4B并不影响巨噬细胞这些酶的表达水平;3.进一步分析发现CUL4B敲除后AKT的负调控因子PTEN显着升高,而且CUL4B对PTEN的调控发生在转录水平;4.利用染色质免疫共沉淀实验（ChIP）确定了 CUL4B在Pten启动子区域的结合位点,而且发现TLR2/3/4刺激导致CUL4B在Pten启动子区域的结合减少。qChIP分析显示CUL4B缺失导致PRC2复合物的主要成分EZH2在Pten启动子区域的结合减弱,H2AK119ub1和H3K27me3富集程度显着降低,而激活转录的H3K4me3显着增加。提示CRL4B协同PRC2复合物抑制Pten转录。上述结果在机制上解释了 CUL4B复合物通过抑制Pten转录进而限制GSK3β的活性,避免了 TLR介导的固有免疫反应持续活化,保持免疫稳态。同时这一研究将表观遗传修饰与固有免疫相互联系,进一步丰富了对固有免疫应答信号的认识,为败血症等病原体引起的免疫系统疾病的预防和治疗提供了一个新的潜在靶点。
殷岳杉[7]（2020）在《电针治疗膝关节骨性关节炎临床疗效观察及对滑膜Toll样受体表达的机制研究》文中研究指明研究背景随着老龄化社会的到来,膝关节骨性关节炎（KOA）的发病率呈逐渐升高趋势,对KOA患者早期干预,降低关节置换类手术的发生率显得尤为重要。电针治疗KOA具有镇痛作用好、操作简便的优势,但其作用机理尚需从多角度进行探究。本研究从临床研究和实验研究两个方面探讨电针治疗KOA的临床疗效和作用机理。研究目的1.以经筋理论为指导确定穴位,观察电针对KOA患者疼痛、功能活动和生活质量的改善情况,同时测定膝关节周围屈伸肌肌力,综合分析电针对KOA的治疗效果。2.选择电针对兔KOA模型进行干预,观察各取材组织中细胞因子及基质金属蛋白酶含量及Toll样受体及其信号通路上主要元件的mRNA和蛋白表达情况,探讨电针对Toll受体信号通路上的主要元件在不同阶段KOA滑膜及软骨中表达的干预作用。研究方法1.临床研究1.1 治疗方案纳入轻中度KOA患者40例。随机分为电针组和硫酸氨基葡萄糖胶囊组。电针组:选取内膝眼、犊鼻、梁丘、血海、阳陵泉、阴陵泉、阿足穴。诸穴常规针刺,内膝眼、犊鼻穴斜刺,其余各穴直刺。得气后,选取内膝眼和犊鼻组,梁丘和血海一组,连接英迪牌电针仪,采用疏密波,留针25分钟。每周治疗3次,连续治疗4周为1个疗程。对照组:采用口服硫酸氨基葡萄糖胶囊治疗,每次0.628g,每日3次,连续服用4周。1.2 观察指标及评价时点主要疗效指标:膝关节疼痛VAS评分,膝关节骨关节炎指数评分（WOMAC评分）;等速肌力测试指标:峰力矩（PT）、总做功（TW）以及平均功率（AP）;次要疗效指标:生活质量健康调查表评分（SF-36）。评价时点:以上疗效指标分别于治疗前、治疗2周后、治疗4周后三个时间节点进行记录。2.实验研究2.1 实验方案选取兔44只,随机分成6组,其中空白组4只,假手术组、模型1组、模型2组、电针1组、电针2组每组8只。用改良的Hulth法建立兔左膝关节KOA模型,采用电针对KOA模型兔进行干预。取穴:阳陵泉、阴陵泉、内膝眼、犊鼻、梁丘、血海,其中内膝眼、犊鼻斜刺,其余各穴直刺。内膝眼和犊鼻一组,梁丘和血海一组连接电针,每次20分钟,以模型动物患肢微微抖动为度,每周治疗3次,共治疗4周。干预结束后取材,模型1组、电针1组于造模后6周取材,空白组、假手术组、模型2组、电针2 组造模后8周取材。其中空白组双膝取材,其余各组左侧膝关节取材。2.2 检测指标实验一:通过对各组实验兔血清、关节液中IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP1、MMP3、MMP13的含量检测,观察KOA兔血清及关节液中细胞因子及基质金属蛋白酶表达情况;通过HE染色在光学显微镜下观察各组KOA兔滑膜及软骨的形态学变化。实验二:采用Real-timePCR和Western blot检测法,检测各组兔滑膜及软骨样品中TLR4、TLR2、NF-κB、MyD88、TRAF6的mRNA和蛋白表达情况,并对各组结果进行对比研究。研究结果1.临床研究1.1 膝关节疼痛VAS评分组内比较:电针组治疗2周后、治疗4周后VAS评分均低于治疗前（P<0.05）。组间比较:电针组在治疗2周后与治疗4周后VAS评分均低于对照组CP<0.05),说明电针有较好的止痛作用。1.2 WOMAC指数评分组内比较:治疗2周后、治疗4周后与同组治疗前相比差异均具有统计学意义（P<0.05）;治疗4周后与治疗2周后比较差异具有统计学意义（P<0.05）。组间比较:治疗前两组相比差异无统计学意义（P>0.05）,在治疗2周后、4周后不同时间节点两组评分相比差异均具有统计学意义（P<0.05）。从疼痛、僵硬、躯体功能等不同维度进行比较,电针组均优于对照组。1.3 SF-36生活质量量表评分躯体健康:组内比较,治疗2周后、治疗4周后与同组治疗前比较（P<0.05）;治疗4周后与治疗2周后相比（P<0.05）。组间比较:两组治疗前评分比较（P>0.05）,具有可比性;治疗2周后、治疗4周后与相同时间节点对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。心理健康:组内比较,治疗2周后、治疗4周后与治疗前比较（P<0.05）;治疗4周后与治疗2周后相比（P<0.05）,差异有统计学意义。组间比较,治疗前两组评分比较（P>0.05）具有可比性,治疗2周后、治疗4周后两组之间比较电针组均较对照组改善明显（P<0.05）。1.4 等速肌力检测PT值比较:组内比较:电针组治疗2周后、治疗4周后屈伸肌群PT值分别与治疗前比较（P<0.05）;对照组治疗2周后与治疗前比较（P<0.05）,治疗4周后与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05）。组间比较:两组治疗前屈伸肌群PT值比较（P>0.05）;治疗2周后、治疗4周后电针组伸肌群及屈肌群PT值均优于相同时间节点的对照组（P<0.05）。TW值比较:组内比较:电针组治疗2周后、治疗4周后屈伸肌群TW值与治疗前比较（P<0.05）;对照组治疗2周后与治疗前比（P<0.05）,治疗4周后与治疗前比（P<0.05）,差异有统计学意义。组间比较:两组治疗前屈伸肌群TW值比较（P>0.05）,差异无统计学意义;治疗2周后、治疗4周后电针组屈伸肌群TW值均优于相同时间节点的对照组（P<0.05）。AP值比较:组内比较:电针组治疗2周后、治疗4周后屈伸肌群AP值较治疗前均有不同程度的改善（P<0.05）;对照组治疗2周后与治疗前比（P<0.05）,治疗4周后与治疗前比（P<0.05）,差异有统计学意义。组间比较:两组治疗前屈伸肌群AP值比较（P>0.05）,差异无统计学意义;治疗2周后、治疗4周后电针组屈伸肌群AP值均优于相同时间节点的对照组（P<0.05）。2.实验研究实验一:Elisa检测结果:与空白组比较,假手术组KOA兔血清及关节液中IL-1β、TNF-α、及IL-6及MMP1、MMP3及MMP13水平比较（P>0.05）,可以排除手术干扰因素。两模型组血清及关节液中IL-1β、TNF-α及IL-6及MMP1、MMP3及MMP13水平明显高于两电针治疗组及假手术组（P<0.05）。滑膜病理变化:与空白组和假手术组相比两模型组滑膜组织充血,局灶性淋巴、单核和浆细胞炎性浸润明显;模型2组甚至出现滑膜增生、纤维化,毛细血管硬化受累。电针1组及电针2组滑膜增生及淋巴细胞浸润明显少于两模型组。关节软骨病理变化:与空白组及假手术组比较,两模型组软骨表面欠光滑,细胞排列欠规则,潮线完整性欠佳。模型2组甚至出现浅表溃疡,软骨厚度变薄,潮线前移、紊乱的现象;两电针组镜下观察轮廓欠清晰,细胞排列欠规则,潮线略紊乱,分层欠清,但总体表现优于模型组。实验二:Real Time PCR检测结果:滑膜中TLR4、NF-κB、MyD88、TLR2及TRAF6的mRNA表达水平比较:模型1组与模型2组mRNA表达水平显着高于假手术组及空白对照组（P<0.05）;两电针组mRNA表达水平分别低于两模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。软骨中TLR4、NF-κB、MyD88、TLR2及TRAF6的mRNA表达水平比较:模型1组与模型2组mRNA表达水平显着高于假手术组及空白对照组（P<0.05）;两电针组mRNA表达水平分别低于两模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。Western Blot检测结果显示:滑膜中的TLR4、NF-κB、MyD88、TLR2及TRAF6的蛋白表达比较:模型1组与模型2组的蛋白表达明显高于空白组及假手术组（P<0.05）;两电针治疗组的蛋白表达水平比值均明显低于两模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。软骨中的TLR4、NF-κB、MyD88、TLR2及TRAF6的蛋白表达比较:模型1组与模型2组的蛋白表达明显高于空白组及假手术组（P<0.05）;两电针治疗组的蛋白表达水平比值均明显低于两模型组（P<0.05）,差异有统计学意义。研究结论1.以经筋理论为指导选穴,电针治疗早中期膝关节骨性关节炎可有效缓解关节疼痛,改善关节功能,并有助于增强膝关节周围的屈伸肌肌力,提高患者生存质量。2.细胞因子水平及基质金属蛋白酶含量与KOA严重程度呈相关性,电针可以有效抑制血清及关节液中细胞因子及基质金属蛋白酶的水平,有助于控制关节炎症。3.Toll样受体的表达与KOA的严重程度存在相关性。电针可有效抑制TLRs/MyD88/NF-κB信号通路相关元件的mRNA及蛋白表达,提示针灸可能通过抑制这一炎症反应信号通路达到缓解关节炎症的作用。
陈学秋[8]（2020）在《金黄色葡萄球菌蛋白A调控慢性骨髓炎成骨细胞自噬信号的机制研究》文中提出[目 的]探讨金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcus aureus protein A,SpA）对慢性骨髓炎成骨细胞自噬信号的调控机制,通过体外研究明确SpA对MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化的影响,以及对凋亡和自噬信号的调控作用机制。体内研究用WT S.aureus菌株和ΔSpA S.aureus菌株构建SD大鼠慢性骨髓炎模型研究对成骨细胞自噬信号的影响,以探讨SpA对成骨细胞凋亡和自噬信号的调控作用机制。[方 法]1.用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TNFR1-/-MC3T3-E1细胞培养和鉴定。首先,分别用MOI值为0,5,10,20,40的HBLV-Cas9-PURO慢病毒感染MC3T3-E1细胞,用10μg/mL嘌呤霉素（Puromycin,PURO）进行筛选挑取单克隆细胞株培养鉴定,成功构建稳转Cas9+/+MC3T3-E1细胞。其次用 HBLV-BSD-RFP NC,HBLV-m-Tnfrsf1a-gRNA1-BSD-RFP,HBLV-m-Tnfrsf1a-gRNA2-BSD-RFP 和 HBLV-m-Tnfrsf1a-gRNA3-BSD-RFP 慢病毒感染 Cas9+/+MC3T3-E1细胞,感染后72 h后用10μg/mL杀稻瘟菌素（Blasticidin,BSD）进行筛选,荧光显微镜下观察计算各组细胞转染效率,挑取单克隆细胞株培养鉴定,成功构建稳转TNFR1-/-MC3T3-E1细胞株。2.体外实验不同时间用不同浓度SpA诱导WT和TNFR1-/-MC3T3-E1细胞,用MTS检测对细胞的增殖和毒性作用,流式细胞术检测细胞凋亡率,茜素红染色观察计数钙化结节形成,蛋白质印迹（Western blotting,WB）和免疫细胞荧光（Immunocytofluorescence,ICF）检测不同条件下SpA诱导MC3T3-E1细胞凋亡和自噬相关蛋白表达水平。3.体内实验用5%鱼肝油酸钠溶液和1 × 108CFU/mL 50 μL WT S.aureus和ΔSpA S.aureus构建SD大鼠慢性骨髓炎模型,分别在感染2w、3w和4w后取材、固定、脱钙、石蜡包埋和切片,HE染色进行慢性骨髓炎评价;免疫组织荧光（Immunohistofluorescence,IHF）检测各组动物模型中凋亡和自噬相关蛋白的表达情况。[结 果]1.用MOI:10的HBLV-Cas9-PURO慢病毒感染MC3T3-E1细胞,10 μg/mL PURO进行筛选、鉴定和挑取单克隆培养,成功构建Cas9+/+MC3T3-E1 细胞。用 MOI:10 的 HBLV-m-Tnfrsf1a-gRNA-BSD-RFP 慢病毒感染MC3T3-E1细胞,用10 μg/mLBSD筛选,该组细胞在荧光显微镜可见稳定表达的红色荧光转染效率最高,挑取单克隆细胞株培养鉴定,成功构建稳转TNFR1-/-MC3T3-E1 细胞。2.用 10、30、60、90、120μg/mL SpA 诱导 WT 和 TNFR1-/-MC3T3-E1细胞1～7 d,用MTS检测细胞活力呈剂量和时间依赖性下降。120μg/mL SpA诱导WT和TNFR1-/-MC3T3-E1细胞3 d、5 d和7 d,流式细胞术检测细胞凋亡则呈剂量和时间依赖性增加;120 μg/mL SpA诱导WT组与TNFR1-/-组MC3T3-E1细胞相比7 d、14 d和28 d茜素红染色钙化结节数呈剂量依赖性减少;WB 和 ICF 检测 WT 组 Pro-Caspase-3 表达下调,而 Cleaved-Caspase-3 和Bcl-2则表达上调;自噬相关蛋白Beclin-1、ATG5、ATG7和LC3-Ⅱ表达下调,而 LAMP-2 和 SQSTM1/p62 则表达上调。3.用 WT S.aureus和ΔSpA S.aureus感染SD大鼠慢性骨髓炎模型的构建及验证。SD大鼠慢性骨髓炎模型制模成功后饲养2w、3 w和4 w。取材、固定、脱钙、石蜡包埋和切片。进行常规HE染色WT S.aureus组和ΔSpA S.aureus组相比,骨小梁破坏明显增加、有大量的坏死骨形成。免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）和 IHF 检测 WT S.aureus组和ΔSpA S.aureus组相比,病灶周围骨组织成骨细胞自噬相关蛋白Beclin-1、ATG5和LC3-Ⅱ表达显着下调,而LAMP-2则表达上调。[结 论]体外研究证实SpA可通过TNFR1介导上调Cleaved-Caspase-3和Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达而诱导MC3T3-E1细胞凋亡。体内外研究表明SpA还可通过TNFR1介导抑制自噬相关蛋白Beclin-1、ATG5、ATG7和LC3-II等的表达,直接或间接抑制自噬体的生成而抑制成骨细胞自噬,而上调LAMP-2和SQSTM1/p62的表达表明,SpA并不影响自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,以及随后的自噬溶酶体降解过程即并不抑制自噬通量或自噬流。本研究结果表明S.aureus主要致病性毒力因子SpA抑制慢性骨髓炎中成骨细胞自噬信号的分子机制,为更有效的治疗该疾病,调控成骨细胞自噬信号可能是一个可选择的治疗靶点奠定基础。
常晓博[9]（2020）在《HSP60和IFI16抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制机制的研究》文中研究表明猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是全球最具破坏性的动物病毒性疫病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus,PRRSV）是PRRS的病原体。PRRSV是属于动脉炎病毒家族的有囊膜包裹的单股、正链RNA病毒。PRRSV具有遗传多样性,且病毒感染后能够引起免疫抑制,并造成持续性感染,因此给防治PRRS带来了巨大的负担和挑战。Ⅰ型干扰素（typeⅠinterferons,Ⅰ-IFNs）,干扰素刺激基因（IFN-stimulated genes,ISGs）以及一些宿主蛋白具有抑制PRRSV复制的能力。本研究通过miR-382-5p筛选了具有抑制PRRSV复制功能的宿主蛋白HSP60（heat shock protein 60）和IFI16（interferonγ-inducible protein 16）,并围绕HSP60和IFI16抑制PRRSV复制的作用机制展开研究。研究内容主要包括以下三个方面:1.基于miR-382-5p抗PRRSV基因的筛选miR-382-5p是前期通过高通量测序获得的PRRSV感染MARC-145细胞后差异性表达的宿主micro RNA（miRNA）。MiRNAs是一类广泛存在于真核细胞中保守的非编码RNAs,且作为转录后调控因子参与调控细胞增殖、分化、凋亡和免疫应答等重要的细胞过程。本研究首先发现miR-382-5p可以促进PRRSV的复制,且miR-382-5p可以负向调控poly I:C诱导的Ⅰ型干扰素的产生。此外,miRNAs在转录后水平可以通过与靶基因m RNA的不完全互补配对,造成靶m RNA降解或抑制其翻译从而调控基因表达以及细胞内的生物过程。因此,通过靶基因的预测和初步验证,发现DDX3X、HSP60、IFI16、USP8、FADD和SKP1是miR-382-5p的候选靶基因。随后,通过研究候选靶基因对PRRSV复制的影响,发现HSP60和IFI16具有抑制PRRSV复制的能力。2.HSP60抑制PRRSV复制机制的研究HSP60是细胞内的伴侣蛋白,同时也是免疫系统网络中的一个节点,能够参与调控免疫应答反应以及病毒复制。本研究发现沉默MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage,PAM）中的HSP60后,PRRSV ORF7的m RNA水平,病毒滴度以及N蛋白的表达水平与对照组相比显着升高;而过表达HSP60后PRRSV的复制能力下降,表明HSP60是抑制PRRSV复制的抗病毒蛋白。随后,双荧光素酶报告基因检测试验和q PCR分析表明HSP60能够促进poly I:C诱导的IFN-β的产生。进一步的研究发现HSP60可以显着增强MAVS诱导的IFN-β的启动子活性,IFN-β以及干扰素刺激基因ISG15和ISG56的m RNA水平,而且随着HSP60剂量的增加,IFN-β、ISG15和ISG56的转录水平也随之增强。此外,沉默细胞中的MAVS后,HSP60不能促进poly I:C诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β的m RNA水平;而在对照组中,HSP60可以显着增强poly I:C诱导的IFN-β的启动子活性和IFN-β的m RNA水平,表明HSP60促进Ⅰ-IFN应答具有MAVS依赖性。免疫共沉淀和激光共聚焦试验结果表明HSP60能够特异性地结合MAVS,并与MAVS共定位;而且,MAVS的N端CARD、PRO结构域和C端TM结构域是MAVS绑定HSP60所必需的。更重要的是,沉默MARC-145细胞中的MAVS后,HSP60不能抑制PRRSV的复制,表明HSP60拮抗PRRSV复制需要MAVS的参与。3.IFI16抑制PRRSV复制机制的研究IFI16是干扰素γ诱导的蛋白,其在调控Ⅰ-IFN应答DNA和RNA病毒的抗病毒免疫中具有广泛的作用。在本研究中通过过表达和siRNA干扰IFI16,从RNA水平和蛋白水平证明了IFI16具有抑制PRRSV复制的能力,是PRRSV的抗病毒蛋白。另外,IFN-β和PRRSV可以诱导IFI16的表达,且IFI16可以促进PRRSV或poly I:C诱导的IFN-β的产生。进一步的研究发现IFI16能够显着增强MAVS诱导的IFN-β的启动子活性,IFN-β的m RNA水平以及干扰素刺激基因ISG15和ISG56的转录水平。而且,MAVS诱导的IFN-β启动子活性以及IFN-β、ISG15和ISG56的m RNA水平随着IFI16剂量的增加而升高。随后发现,沉默细胞中的MAVS后,IFI16不能促进poly I:C诱导的IFN-β的转录。这些结果表明IFI16能够正向调控MAVS介导的Ⅰ-IFN应答。此外,免疫共沉淀结果显示IFI16可以特异性地结合MAVS,且MAVS的N端CARD、PRO结构域和C端TM结构域对于IFI16-MAVS的相互作用是至关重要的。更重要的是,IFI16发挥抗病毒功能具有MAVS依赖性。综上所述,本研究筛选并证明了HSP60和IFI16是抑制PRRSV复制的抗病毒蛋白。此外,HSP60和IFI16能够正向调控MAVS介导的Ⅰ-IFN应答,且HSP60和IFI16发挥抗PRRSV功能具有MAVS依赖性。本研究阐述了HSP60和IFI16在MAVS介导的信号通路中的作用,且揭示了宿主蛋白HSP60和IFI16拮抗PRRSV复制的作用机制,这有助于了解宿主蛋白HSP60和IFI16在RLR信号通路以及病毒调控中的作用,并为病毒防控提供新的思路。
邓建昭[10]（2019）在《MyD88基因在实验性病毒性爆发性肝炎中的作用研究》文中提出目的病毒性爆发性肝炎（Viral fulminant hepatitis,简称FH）是一种严重的肝脏疾病,由于肝脏组织炎症反应过度,死亡率较高。对FH疾病中的炎症信号通路缺乏认识严重阻碍了临床疾病干预措施的实施。髓系分化原反应基因88（MyD88）是大多数TLR、IL-1R和IL-18R依赖性炎症信号通路的关键受体蛋白,在介导宿主对病原菌入侵的原反应中发挥重要作用。这种信号通路的过度激活会加剧某些疾病,而这些疾病在本质上是致命的。但MyD88信号通路是否及如何参与病毒性爆发性肝炎（viral fulminant hepatitis,FH）的发病机制尚不清楚。本研究旨在通过揭示MyD88介导的信号通路与病毒性爆发性肝炎的关系,为FH疾病的治疗策略提供新的线索和实验依据。方法构建小鼠病毒性爆发性肝炎模型,监测C57BL/6、Rag-1-/-、Trif-/-、Myd88-/-小鼠20天内的存活情况;感染MHV3病毒0h、48h和72h后,收集MyD88-/-和WT小鼠的肝脏组织,用HE染色检测两组小鼠肝脏损伤差异;用Tunel技术检测小鼠肝细胞凋亡情况;采用Western-Blot检测感染48h和72h后小鼠肝脏内MHV-3受体Bgp-1的表达情况;采用斑块法分析感染72h后肝脏病毒滴度。感染MHV3病毒0h、24h、48h和72h后,收集MyD88-/-和WT小鼠的肝脏组织,用RT-qPCR、Western-Blot、ELISA检测FGL2的mRNA和蛋白表达水平;免疫组化检测FGL2和Fibrinogen的表达情况。监测FGL2-/-和C57BL/6小鼠感染MHV3病毒20天内的生存差异。用RT-qPCR、Western-Blot、免疫组化检测小鼠IFN-γ、TNF-α、IL-6和proIL-1β的mRNA和蛋白表达水平;监测TNF-α-/-、IL-1R-/-和C57BL/6小鼠感染MHV3病毒20天内的生存差异。相同周龄的C57BL/6（WT）和MyD88-/-小鼠感染MHV-3（100 PFU）后,从感染的肝脏中分离细胞,用流式细胞术检测肝脏中Lin-Thy1.2+ILCs浸润情况;用统计学分析肝脏中Lin-Thy1.2+ILCs和NKp46-Lin-Thy1.2+Roγt+ILC3浸润情况;NKp46-Lin-Thy1.2+Roγt+ILC3细胞分泌的IL-17、TNF-α和IL-1β用流式进行检测。巨噬细胞系Raw264.7细胞经MHV-3感染（MOI=1）,免疫荧光共聚焦显微镜监测未感染或感染24h后HMGB1定位;ELISA检测细胞上清液中HMGB1的浓度。相同周龄的C57BL/6（WT）和MyD88-/-小鼠感染MHV-3（100 PFU）后,分别在不同时间点提取肝组织,用免疫组化和免疫荧光检测HMGB1蛋白在正常和感染MHV-3的肝组织中表达情况;用ELISA检测MyD88-/-和WT小鼠血清中HMGB1的浓度,N=5/组;用Western-Blot检测MyD88-/-和WT小鼠肝脏中HMGB1蛋白水平,N=4/组。结果与WT小鼠相比,MyD88-/-小鼠的生存周期明显延长（P<0.001）。HE和Tunel结果显示MyD88-/-小鼠的肝组织损伤和肝细胞凋亡情况明显减轻。Western-Blot显示MyD88-/-小鼠的MHV3受体Bgp-1蛋白表达明显降低。斑块法分析感染MHV3病毒72h后MyD88-/-小鼠肝脏病毒滴度显着下降（P<0.05）。RT-qPCR、Western-Blot、ELISA检测显示MyD88-/-小鼠肝脏中fgl2的mRNA和蛋白表达水平明显降低,尤其是在72h差异最为明显（P<0.05）。免疫组化显示相比WT小鼠,MyD88-/-小鼠的fgl2和fibrinogen表达显着下降。相比C57BL/6小鼠,fgl2-/-小鼠的生存周期明显延长（P<0.001）。RT-qPCR、Western-Blot和免疫组化检测结果显示MyD88-/-小鼠肝脏中IFN-γ、TNF-α、IL-6和proIL-1β的表达显着下降（P<0.05）。相比C57BL/6小鼠,TNF-α-/-和IL-1R1-/-小鼠的生存期显着延长（P<0.05）。流式细胞仪检测显示,在感染MHV3病毒24h和48h后,WT肝脏中浸润的ILCs（Lin-Thy1.2+）明显高于MyD88-/-小鼠（P<0.05）。此外,统计分析表明,MyD88-/-小鼠感染MHV-3后,肝脏组织中的NKp46-Lin-Thy1.2+Roγt+第三组固有淋巴细胞（ILC3）显着减少。而这些ILC3有能力产生促炎介质,如proIL-1β,TNF-α和IL-17等。巨噬细胞系Raw264.7细胞未感染时,免疫荧光共聚焦显微镜显示HMGB1分布在细胞核内。而当细胞感染MHV-3（MOI=1）后,HMGB1定位于细胞的细胞核和细胞质内。而且,感染72h后,上清液中积累的HMGB1浓度也随时间逐渐增加。在感染MHV3病毒的小鼠肝脏内,发现了同样的现象,HMGB1从细胞核迁移到胞质内,并且相比WT小鼠,MyD88-/-小鼠血清和肝脏中的HMGB1显着下调（P<0.05）。结论成功构建了病毒性爆发性肝炎模型,阐明了MyD88-/-小鼠可以通过减少肝脏中HMGB1的分泌,进而减弱促炎反应;可以通过减少肝脏中NKp46-Lin-Thy1.2+Roγt+第三组固有淋巴细胞（ILC3）的浸润,减少多种促炎细胞因子的分泌,进而减轻肝脏组织的病变和损伤情况,延长感染爆发性肝炎小鼠的生存周期。综上结果所述,MyD88基因会加重实验性病毒性重型肝炎的免疫病理。我们可以通过适当调节MyD88信号通路,并结合阻断其他炎症因子,来达到治疗人类病毒性FH等严重炎症疾病的目的。
二、TRAF——调节细胞生存和死亡的衔接蛋白（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TRAF——调节细胞生存和死亡的衔接蛋白（论文提纲范文）
（1）TRIM59调节巨噬细胞吞噬和细胞因子表达及其在脓毒血症中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TRIM蛋白家族研究进展 |
| 1.1.1 TRIM蛋白的RBCC结构域 |
| 1.1.2 TRIM蛋白C端结构域及其分类 |
| 1.1.3 TRIM蛋白的表达和亚细胞定位 |
| 1.1.4 TRIM蛋白与泛素化 |
| 1.1.5 TRIM蛋白与病毒 |
| 1.1.6 TRIM蛋白与PRRs相关信号通路 |
| 1.2 TRIM59 蛋白研究进展 |
| 1.2.1 TRIM59 蛋白的结构 |
| 1.2.2 TRIM59 蛋白的表达和亚细胞定位 |
| 1.2.3 TRIM59 蛋白的功能 |
| 1.3 巨噬细胞的研究现状 |
| 1.3.1 巨噬细胞的来源和分布 |
| 1.3.2 巨噬细胞的极化 |
| 1.3.3 巨噬细胞的作用 |
| 1.3.4 巨噬细胞在炎症反应中的作用 |
| 1.4 脓毒血症的研究现状 |
| 1.4.1 脓毒血症的定义及影响因素 |
| 1.4.2 脓毒血症与免疫应答 |
| 1.4.3 巨噬细胞在脓毒血症中的作用 |
| 1.5 本研究的立题依据、研究目的与研究内容 |
| 第2章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 其他主要试剂的配制 |
| 2.4 主要仪器 |
| 2.5 实验方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 巨噬细胞缺失TRIM59 蛋白加重小鼠脓毒血症 |
| 3.1.1 LPS刺激巨噬细胞后TRIM59 低表达 |
| 3.1.2 Trim59~(flox/flox)及Trim59-cKO小鼠的繁育及鉴定 |
| 3.1.3 巨噬细胞缺失TRIM59 蛋白加重小鼠脓毒血症 |
| 3.1.4 Trim59-cKO脓毒血症小鼠外周血中性粒细胞浸润增多 |
| 3.2 脓毒血症中巨噬细胞缺失TRIM59 抑制其吞噬作用 |
| 3.2.1 Trim59-cKO脓毒血症小鼠的细菌载量增加 |
| 3.2.2 巨噬细胞缺失TRIM59 后吞噬功能下降 |
| 3.2.3 巨噬细胞缺失TRIM59 后其Fcγ受体表达下降 |
| 3.2.4 巨噬细胞缺失TRIM59 不影响其抗原呈递相关受体的表达 |
| 3.3 脓毒血症中巨噬细胞缺失TRIM59 促进其表达炎性细胞因子 |
| 3.3.1 Trim59-cKO脓毒血症小鼠炎性细胞因子均增加 |
| 3.3.2 巨噬细胞缺失TRIM59 促进其表达促炎细胞因子 |
| 3.3.3 巨噬细胞缺失TRIM59 增强NF-κB信号通路 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）肿瘤坏死因子受体相关因子1在晚期肺癌患者外周血中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 一般临床资料收集 |
| 1.3 实验仪器及试剂 |
| 1.4 血清标本采集及保存 |
| 1.5 血清TRAF1 检测方法 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般临床资料分析及比较 |
| 2.2 肺癌化疗前组与健康对照组血清TRAF1 水平的比较分析 |
| 2.3 血清TARF1 水平与肺癌患者不同临床病理特征的关系 |
| 2.4 比较不同分期肺癌患者血清TRAF1 表达水平的差异 |
| 2.5 比较肺癌患者化疗前后血清TRAF1 表达水平的差异 |
| 2.6 比较化疗前不同病理类型肺癌患者血清TRAF1 表达水平的差异 |
| 2.7 比较化疗后不同病理类型肺癌患者血清TRAF1 表达水平的差异 |
| 2.8 比较不同病理类型肺癌患者化疗前后血清TRAF1 表达水平的差异 |
| 2.9 血清TRAF1 水平对晚期肺癌的诊断价值评价 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤坏死因子受体相关因子 1 在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（3）TLR9乙酰化修饰在脓毒血症中的免疫调节及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TLR9 发生乙酰化修饰 |
| 2.2 CBP和TLR9发生相互作用 |
| 2.3 TLR9和TIRAP发生相互作用 |
| 2.4 CBP增加NF-κB的反应元件活性 |
| 2.5 乙酰化修饰促进炎症反应中的TLR9信号通路的传递,增加炎症因子的产生 |
| 2.6 通过动物实验探讨TLR9乙酰化修饰在脓毒血症疾病发展中的作用 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TLR9蛋白发生乙酰化修饰 |
| 3.2 乙酰化修饰正向调节TLR9与多个接头蛋白的相互作用 |
| 3.3 TLR9 乙酰化修饰正向调控NF-κB核转移 |
| 3.4 TLR9 乙酰化修饰对脓毒血症的调节 |
| 4 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 蛋白质翻译后修饰对TLRs信号通路调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（4）肿瘤坏死因子α上调朊蛋白的水平促进肿瘤细胞迁移的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 黑色素瘤概述 |
| 1.2 肺癌概述 |
| 1.3 炎症因子TNFα概述 |
| 1.3.1 炎症简介 |
| 1.3.2 TNFα的信号转导 |
| 1.3.3 TNFR1信号 |
| 1.3.4 TNFR2信号 |
| 1.3.5 TNFα与癌症的关系 |
| 1.4 细胞中的蛋白降解体系 |
| 1.4.1 自噬分类与分子机制 |
| 1.4.2 泛素蛋白酶体系统的组成以及分子机制 |
| 1.4.3 自噬信号通路 |
| 1.4.4 自噬与癌症治疗 |
| 1.4.5 TNFα与自噬的关系 |
| 1.5 SNAP29的结构与功能 |
| 1.6 FOXP3的结构、表达调控以及功能 |
| 1.7 细胞型朊蛋白的概述 |
| 1.7.1 细胞型朊蛋白结构 |
| 1.7.2 PrP在癌症细胞中的生理功能 |
| 1.7.3 PrP的降解途径 |
| 1.8 细胞迁移 |
| 1.8.1 细胞骨架动力学 |
| 1.8.2 细胞迁移的调控因子 |
| 第二章 TNFα抑制SNAP29依赖的自噬溶酶体的形成增加朊蛋白的表达促进癌症细胞的迁移 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒和抗体 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 培养基配方 |
| 2.1.4 试剂及配方 |
| 2.1.5 重组质粒构建及试剂 |
| 2.1.6 细胞实验试剂制备 |
| 2.1.7 免疫印迹实验试剂 |
| 2.1.8 免疫荧光试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 RNA提取,反转录以及QPCR实验 |
| 2.2.3 稳定表达细胞株构建 |
| 2.2.4 蛋白质表达检测 |
| 2.2.5 数据统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 敲降PRNP影响癌细胞迁移 |
| 2.3.2 TNFα刺激增加肿瘤细胞的迁移速度与侵袭能力并且依赖于Pr P的表达 |
| 2.3.3 TNFα刺激增加肿瘤细胞PrP的表达,但是不改变Pr P的 m RNA水平。 |
| 2.3.4 TNFα激活NF-κb信号通路增加PrP的表达。 |
| 2.3.5 TNFα抑制肿瘤细胞中自噬溶酶体的形成。 |
| 2.3.6 TNFα刺激肿瘤细胞降低SNAP29蛋白的表达。 |
| 2.3.7 在肿瘤细胞中,敲除 SNAP29,影响自噬体与溶酶体的融合,增加细胞的迁移速度 |
| 2.3.8 TNFα刺激降低FOXP3的表达,增加肿瘤细胞的迁移能力。 |
| 第三章 结论与讨论 |
| 3.1 本文结论 |
| 3.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩写表 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）IFN-τ对奶牛子宫内膜损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 IFN-τ及其生物学作用 |
| 1.1 IFN-τ的发现 |
| 1.2 IFN-τ与妊娠识别 |
| 1.3 IFN-τ的其他作用 |
| 1.4 I型干扰素信号转导通路 |
| 2 奶牛子宫内膜炎 |
| 2.1 子宫内膜炎及其危害 |
| 2.2 子宫内膜炎发病机制 |
| 2.3 子宫内膜的天然免疫反应 |
| 2.3.1 依赖MyD88的信号通路 |
| 2.3.2 不依赖MyD88的信号通路 |
| 3 MicroRNA(miRNA)及其生物学作用 |
| 3.1 miRNA的发现 |
| 3.2 miRNA的生物合成及其作用机制 |
| 3.3 miRNA与炎性免疫应答 |
| 4 PI3K/AKT与 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 4.1 PI3K/AKT通路及其生物学作用 |
| 4.2 Wnt/β-catenin通路及其生物学作用 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 IFN-τ对奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的保护作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 原代奶牛子宫内膜上皮细胞培养 |
| 2.2.2 免疫荧光染色技术 |
| 2.2.3 细胞增殖检测 |
| 2.2.4 细胞凋亡检测 |
| 2.2.5 细胞周期检测 |
| 2.2.6 RT-qPCR技术 |
| 2.2.7 Western blot技术 |
| 2.3 试验数据统计与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 原代子宫内膜上皮细胞的培养和鉴定 |
| 3.2 子宫内膜上皮细胞炎性损伤模型的构建 |
| 3.3 IFN-τ作用浓度的筛选及对细胞损伤的保护作用 |
| 3.4 IFN-τ抑制细胞炎症和凋亡反应相关蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 第三章 IFN-τ对 PI3K/AKT信号通路的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 原代奶牛子宫内膜上皮细胞培养 |
| 2.2.2 奶牛子宫内膜上皮细胞的分组处理 |
| 2.2.3 细胞转染试验 |
| 2.2.4 小鼠子宫内膜损伤模型的构建 |
| 2.2.5 流式细胞术试验 |
| 2.2.6 RT-qPCR技术 |
| 2.2.7 Western blot技术 |
| 2.2.8 免疫荧光染色技术 |
| 2.3 试验数据统计与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 IFN-τ激活PI3K/AKT信号通路 |
| 3.2 IFN-τ通过PI3K/AKT抑制子宫内膜上皮细胞的炎性应答与凋亡 |
| 3.3 IFN-τ对 PI3K/AKT下游信号分子表达的作用 |
| 3.4 IFN-τ通过PI3K/AKT/β-catenin抑制TLR4/NF-κB信号通路 |
| 3.4.1 β-catenin抑制下游Foxo1和NF-κB的激活 |
| 3.4.2 Foxo1 促进TLR4/NF-κB的激活 |
| 3.5 IFN-τ对小鼠子宫内膜炎性损伤的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 第四章 IFN-τ通过miR-92b调控PI3K/AKT通路 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂与药品 |
| 2.1.3 主要溶液的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 奶牛子宫样本的采集 |
| 2.2.2 子宫组织病理学检测 |
| 2.2.3 奶牛子宫内膜上皮细胞系的培养及处理 |
| 2.2.4 RT-qPCR技术 |
| 2.2.5 细胞转染试验 |
| 2.2.6 miR-92b靶基因的预测和验证 |
| 2.2.7 Western blot技术 |
| 2.2.8 流式细胞术试验 |
| 2.2.9 免疫荧光染色技术 |
| 2.2.10 免疫组织化学技术 |
| 2.3 试验数据统计与分析 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 IFN-τ调控的miRNA的筛选及验证 |
| 3.2 miR-92b介导IFN-τ的抑炎作用 |
| 3.3 miR-92b抑制细胞炎性应答 |
| 3.4 miR-92b抑制细胞凋亡反应 |
| 3.5 miR-92b激活PI3K/AKT/β-catenin通路 |
| 3.6 PTEN作为miR-92b作用靶点的验证 |
| 3.7 miR-92b通过PTEN抑制细胞炎性应答 |
| 3.8 β-catenin抑制PTEN表达 |
| 4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 1 本研究主要结论 |
| 2 本研究的不足之处与改进 |
| 参考文献 |
| 附录:作者简历 |
| 致谢 |
（6）CUL4B在调控TLR介导的炎症反应中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分CUL4B缺失促进TLR介导的炎症反应 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分CUL4B通过抑制GSK3β活性调控TLR2/3/4介导的免疫应答 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分CUL4B通过抑制Pten转录负调控TLR2/3/4介导的免疫应答 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| Western Blot原始数据 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 综述: TLRs介导的免疫信通路 |
| 参考文献 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）电针治疗膝关节骨性关节炎临床疗效观察及对滑膜Toll样受体表达的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 针灸治疗膝关节骨性关节炎研究现状 |
| 1 针灸治疗 |
| 2 选穴规律 |
| 3 针灸治疗KOA机理研究 |
| 4 结语 |
| 参考文献 |
| 综述二 KOA发病机制与Toll样受体信号通路的相关性研究 |
| 1 固有免疫应答与OA |
| 2 Toll样受体概述 |
| 3 Toll样受体在OA中的表达 |
| 4 Tol1样受体信号传导通路与OA治疗 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究电针治疗膝关节骨性关节炎疗效观察 |
| 前言 |
| 1 临床资料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 电针对实验性KOA模型兔细胞因子水平的影响及病理形态学观察 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针对实验性KOA模型兔滑膜Toll样受体mRNA及蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间的主要成果 |
（8）金黄色葡萄球菌蛋白A调控慢性骨髓炎成骨细胞自噬信号的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 用CRISPR/Cas9基因编辑技术慢病毒介导稳定转染TNFR1~(-/-)MC3T3-E1细胞株的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SpA对WT和TNFR1~(-/-)MC3T3-E1增殖、分化、凋亡和自噬的影响实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 用WT S.aureus和ΔSpA S.aureus感染对SD大鼠慢性骨髓炎成骨细胞自噬信号的作用及影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 凋亡与自噬交互调控作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）HSP60和IFI16抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 PRRS概述 |
| 1.1.1 PRRSV生物学特征 |
| 1.1.2 PRRSV与宿主免疫应答 |
| 1.1.3 PRRSV的防控 |
| 1.2 抗病毒先天免疫应答 |
| 1.2.1 TLR信号通路 |
| 1.2.2 RLR信号通路 |
| 1.2.3 干扰素信号通路 |
| 1.2.4 ISGs抗病毒功能 |
| 1.3 miRNAs概述 |
| 1.4 HSP60概述 |
| 1.4.1 HSP60理化特性 |
| 1.4.2 HSP60分布及功能 |
| 1.4.3 HSP60免疫调节功能 |
| 1.4.4 HSP60与细胞凋亡 |
| 1.4.5 HSP60调控病毒复制 |
| 1.5 IFI16概述 |
| 1.5.1 IFI16的免疫调节功能 |
| 1.5.2 IFI16与病毒复制 |
| 第二章 基于miR-382-5p抗PRRSV基因的筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 抗体和试剂 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒繁殖与滴度测定 |
| 2.2.2 miRNA提取、反转录及qPCR |
| 2.2.3 RNA干扰试验 |
| 2.2.4 质粒构建 |
| 2.2.5 质粒提取 |
| 2.2.6 真核表达质粒的转染 |
| 2.2.7 细胞RNA提取、反转录及qPCR |
| 2.2.8 双荧光素酶报告基因检测 |
| 2.2.9 免疫印迹试验(Western Blot) |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PRRSV感染MARC-145细胞后上调miR-382-5p的表达 |
| 2.3.2 miR-382-5p促进PRRSV复制 |
| 2.3.3 miR-382-5p负向调控Ⅰ-IFN的转录 |
| 2.3.4 抗病毒基因的筛选 |
| 2.3.5 抗病毒靶基因的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 HSP60抑制PRRSV复制机制的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞与病毒 |
| 3.1.2 抗体和试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 质粒构建 |
| 3.2.2 siRNA干扰 |
| 3.2.3 RT-qPCR |
| 3.2.4 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.2.5 HSP60与MAVS免疫共沉淀 |
| 3.2.6 HSP60与MAVS激光共聚焦 |
| 3.2.7 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 沉默HSP60促进PRRSV在MARC-145细胞中的复制 |
| 3.3.2 沉默HSP60促进PRRSV在PAM细胞中的复制 |
| 3.3.3 过表达HSP60 抑制PRRSV复制 |
| 3.3.4 HSP60正向调控poly I:C诱导的Ⅰ-IFN的转录 |
| 3.3.5 HSP60促进MAVS诱导的Ⅰ-IFN应答 |
| 3.3.6 HSP60促进Ⅰ-IFN应答具有MAVS依赖性 |
| 3.3.7 HSP60与MAVS相互作用 |
| 3.3.8 HSP60抑制PRRSV复制需要MAVS的参与 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 IFI16抑制PRRSV复制机制的研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞与病毒 |
| 4.1.2 抗体和试剂 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 质粒构建 |
| 4.2.2 siRNA干扰 |
| 4.2.3 双荧光素酶报告基因检测 |
| 4.2.4 IFI16与MAVS免疫共沉淀 |
| 4.2.5 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 过表达IFI16抑制PRRSV的复制 |
| 4.3.2 沉默IFI16促进PRRSV的复制 |
| 4.3.3 IFN-β诱导IFI16的表达 |
| 4.3.4 PRRSV感染上调IFI16的表达 |
| 4.3.5 IFI16促进PRRSV诱导的IFN-β的转录 |
| 4.3.6 IFI16促进poly I:C诱导的Ⅰ-IFN转录 |
| 4.3.7 IFI16促进MAVS诱导的Ⅰ-IFN应答 |
| 4.3.8 IFI16促进Ⅰ-IFN应答具有MAVS依赖性 |
| 4.3.9 IFI16与MAVS相互作用 |
| 4.3.10 IFI16发挥抗病毒功能具有MAVS依赖性 |
| 4.4 讨论 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）MyD88基因在实验性病毒性爆发性肝炎中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器设备 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒性爆发性肝炎小鼠模型的建立 |
| 2.2 细胞的制备 |
| 2.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞(PEMs)的制备 |
| 2.2.2 小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)提取及培养 |
| 2.3 小鼠肝脏组织及细胞的RNA提取和cDNA制备 |
| 2.4 Western-Blot检测相关蛋白表达水平 |
| 2.4.1 提取肝脏组织总蛋白 |
| 2.4.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.4.3 蛋白电泳及转膜 |
| 2.4.4 封闭、一抗、二抗及显影曝光 |
| 2.5 ELISA检测试 |
| 2.6 流式细胞术检测肝脏中各细胞变化情况 |
| 2.7 石蜡切片和HE染色 |
| 2.8 免疫荧光染色 |
| 2.9 免疫组化染色 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 MyD88~(-/-)小鼠感染后肝组织损伤和死亡率变化情况 |
| 1.1 小鼠病毒性爆发性肝炎(FH)模型的构建 |
| 1.2 C57BL/6, Rag-1~(-/-),MyD88~(-/-)和Trif~(-/-)小鼠感染后的生存率 |
| 1.3 肝脏组织损伤以及肝细胞凋亡情况检测 |
| 1.4 检测肝组织中Bgp-1蛋白的表达量 |
| 1.5 感染72h后肝脏病毒滴度 |
| 2 Myd88~(-/-)小鼠肝脏中FGL2和FB表达情况及其影响 |
| 2.1 Myd88~(-/-)小鼠肝脏中FGL2表达及FB沉降变化情况 |
| 2.2 Fg12~(-/-)小鼠感染病毒后的生存曲线图 |
| 3 MyD88~(-/-)小鼠体内炎症因子变化及其影响 |
| 3.1 MyD88~(-/-)小鼠体内炎症因子变化情况 |
| 3.2 C57BL/6、IL- IR~(-/-)和TNF-α~(-/-)小鼠感染后存活率 |
| 4 MyD88~(-/-)小鼠感染后肝脏淋巴细胞浸润情况 |
| 4.1 肝脏中单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞浸润情况 |
| 4.2 肝脏中先天淋巴细胞的变化及其分泌的促炎介质 |
| 5 感染MHV-3后HMGB1的变化情况 |
| 5.1 Raw264.7细胞中HMGB1的定位和浓度变化 |
| 5.2 小鼠肝脏中HMGB1的变化情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、TRAF——调节细胞生存和死亡的衔接蛋白（论文参考文献）
- [1]TRIM59调节巨噬细胞吞噬和细胞因子表达及其在脓毒血症中的作用研究[D]. 金争. 吉林大学, 2021(01)
- [2]肿瘤坏死因子受体相关因子1在晚期肺癌患者外周血中的表达及其临床意义[D]. 谭国婷. 桂林医学院, 2021(01)
- [3]TLR9乙酰化修饰在脓毒血症中的免疫调节及其机制研究[D]. 农安娜. 右江民族医学院, 2021
- [4]肿瘤坏死因子α上调朊蛋白的水平促进肿瘤细胞迁移的分子机制[D]. 李欢. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
- [5]IFN-τ对奶牛子宫内膜损伤的保护作用及其机制研究[D]. 江康峰. 华中农业大学, 2020(02)
- [6]CUL4B在调控TLR介导的炎症反应中的作用及其机制[D]. 宋煜. 山东大学, 2020(01)
- [7]电针治疗膝关节骨性关节炎临床疗效观察及对滑膜Toll样受体表达的机制研究[D]. 殷岳杉. 北京中医药大学, 2020(04)
- [8]金黄色葡萄球菌蛋白A调控慢性骨髓炎成骨细胞自噬信号的机制研究[D]. 陈学秋. 昆明医科大学, 2020
- [9]HSP60和IFI16抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制机制的研究[D]. 常晓博. 西北农林科技大学, 2020
- [10]MyD88基因在实验性病毒性爆发性肝炎中的作用研究[D]. 邓建昭. 青岛大学, 2019(03)