一、新型细菌内毒素竞争性受体拮抗剂Lipid A结构类似物的研究现状（论文文献综述）
朱立猛[1]（2021）在《壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探》文中研究说明阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种起病隐匿的进行性发展的中枢神经系统退行性疾病,临床表现主要为认知和记忆障碍。从被发现至今,人们对AD的相关研究已经取得了巨大的进展,众多研究数据表明,AD的发病可能由多种因素共同参与,导致其病程漫长,病理机制十分复杂,且尚未有根治的方法。现有药物主要是缓解症状,不能阻止或者逆转疾病的发展。由于病理机制不明确,导致传统的治疗策略很难有效控制或治愈包括AD在内的多种复杂疾病。近年来,AD的治疗策略也逐渐发生变化,从单一治疗策略到多环节整体观的治疗策略。相对于单一的治疗策略,多环节整体观的治疗可针对疾病的不同生理环节发挥作用并且具有不良反应少、疗效显着等优点。天然产物及其衍生物由于生物利用度高、毒副作用小且大多具有多功能的特性而备受关注。因此,将具有良好生物活性的天然产物用于AD相关的治疗或许可以成为一种有效可行的策略。壳寡糖（Chitosan oligosaccharide,COS）是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖,具有多种生物活性,在生物医药和功能食品领域表现出了良好的应用前景,且COS在过去的许多研究中都被证明具有良好的神经保护作用。本论文通过细胞和动物实验,评价了 COS对于AD的改善作用,并探究了其相关作用机制,为合理地将COS用于AD的治疗提供一定理论依据。论文具体开展的工作如下:1)COS在过去的许多研究中都被证明具有良好的神经保护作用,然而相关的研究存在许多不足。绝大多数的研究仅利用体外细胞模型进行相关实验验证,但是关于COS是否可以穿透血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）进入大脑发挥其神经保护作用依然是个未知数。针对该问题,本研究构建了两种由单层微血管内皮细胞组成的体外BBB模型:静态Transwell模型和动态微流控芯片模型,并利用以上两种模型探究了 COS能否透过单层微血管内皮细胞构成的BBB。初步证明COS具有良好的BBB透过性,且葡萄糖转运蛋白1（Glucose transporterl,GLUT-1）是其通过BBB的转运载体之一。此外,利用荧光标记与活体成像联用的技术,在活体动物上验证了 COS可以透过BBB进入大脑。2)β淀粉样蛋白（Amyloid β-protein,Aβ）自聚集生成富含β-sheet结构的有序聚集体,是导致AD的罪魁祸首。因此,通过影响Aβ的聚集来降低Aβ诱导产生的神经毒性可能是治疗AD的一种有效途径。本研究发现COS可以通过影响Aβ42的聚集来降低其诱导产生的细胞凋亡、氧化应激和炎症因子的释放。其作用机制为:COS能够通过静电作用和疏水相互作用结合在Aβ42寡聚体上,结合后会进一步破坏β-sheet结构,并使其转变为β-turn和Coil结构。该变化会扰乱Aβ42自身所具有的分子内结合作用,破坏Aβ42寡聚体的固有结构,使其稳定性降低,进而促进已经聚集的Aβ42纤维体解聚。除此之外,COS的结合占据了 Aβ42聚集体表面的某些特定位点,导致Aβ42聚集过程中无法向正常方向延长,从而有效地抑制Aβ42的聚集。以上作用能够显着降低Aβ42诱导产生的神经毒性。此外,COS的该作用与其剂量、聚合度和脱乙酰度成正比,-NH2基团在二者相互作用的过程中发挥了重要的作用。3)肠道菌群在AD的发生和发展有中发挥着重要的作用。通过个性化益生元干预来调节肠道微生物群可能成为治疗AD的新方法。本研究通过动物实验,探究了 COS能否通过调节肠道菌群和其代谢产物改善AD相关病理症状。结果表明,COS可以显着改善AD小鼠的认知和记忆功能损伤,降低Aβ引起的神经元凋亡和突触功能障碍。此外,COS治疗还可以重塑紊乱的肠道菌群,改善失衡的菌群代谢,修复受损的肠屏障,减轻外周慢性炎症。通过伪无菌小鼠和粪便菌群移植实验,我们发现COS或可以通过多种途径,整体协同改善AD小鼠的认知功能障碍。综上所述,本研究为将COS用于AD的治疗提供了一定的理论基础。
李毅[2]（2019）在《NADPH氧化酶2及右美沙芬在内毒素诱导的病态行为中的作用研究》文中研究指明目的:我们已知右美沙芬是一种临床使用十分广泛而安全的止咳剂,结构上属于吗啡类药物,鉴于其右旋结构,故右美沙芬与阿片类受体亲和力弱,很难形成成瘾性。而既往的研究已经证实通过抑制NOX2活性,减少ROS及其他促炎因子的合成,减少LPS引起的小胶质细胞的活化,右美沙芬具有对抗神经系统炎症反应,预防神经退行性变的作用。同时还可以减轻脓毒症模型下,急性肝衰竭的死亡率但上述研究目标是观察长期神经元的保护效应。而关于右美沙芬在LPS引起的感染急性期病态行为的作用,以及NOX2-/-模型中,观察短期病态行为的研究目前罕有报道。所以我们提出假设右美沙芬是否在LPS诱导的病态行为中通过抑制炎症反应（中枢）,达到缓解病态行为的目的。材料与方法:1.（1）分组:野生型（C57BL/6J）小鼠随机分为2组（A组,B组）;NOX2基因敲除（Cybb）小鼠随机分为2组（C组,D组）。（2）处理方式:A组.野生型对照组（WT-saline）。B组.野生型内毒素组（WT-LPS）。C组.NOX2基因敲除对照组（Cybb-saline）。D组.NOX2基因敲除内毒素组（Cybb-LPS）。PBS（100ul/20g）及内毒素（2.5mg/kg）均为腹腔内注射。2.病态行为的观察及旷场实验:实验小鼠分别在注射内毒素后每3小时观察一次病态行为学评分,并测量体重变化。主要观测指标:触碰反应,触碰后移动距离,竖毛,眼睑下坠,眼睛分泌物。实验小鼠注射PBS或LPS后9小时,给予病态行为评分后立即进行旷场实验,测量时间20分钟。3.实验小鼠在注射内毒素溶液/PBS溶液后第6,9,12,24小时予以灌流取脑组织,并行免疫组织化学染色（DAB法）。4.ELISA方法测量脑组织的炎症因子蛋白表达水平（IL-1β,IL-6）;Real-time PCR测量脑组织的炎症因子基因表达水平（IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,iNOS,NOX2,CD-11b）。5.（1）分组:野生型（C57BL/6J）小鼠随机分为4组（A组,B组,C组,D组）。（2）处理方式:A组.野生型对照组（WT-Saline）。B组.野生型内毒素组（WT-LPS）。C组.野生型内毒素联合右美沙芬组（WT-LPS/DM）。D组.野生型右美沙芬组（WT-DM）。PBS（100ul/20g）及内毒素（2.5mg/kg）均为腹腔内注射。DM皮下注射（12.5mg/kg、100uL/20g）。6.病态行为的观察及旷场实验:实验小鼠分别在注射内毒素后每3小时观察一次病态行为学评分,并测量体重变化。主要观测指标:触碰反应,触碰后移动距离,竖毛,眼睑下坠,眼睛分泌物。实验小鼠注射PBS或LPS后9小时,给予病态行为评分后立即进行旷场实验,测量时间20分钟。7.实验小鼠在注射内毒素溶液/PBS溶液后第6,9,12,24小时予以灌流取脑组织,并行免疫组织化学染色（DAB法）。ELISA方法测量脑组织的炎症因子蛋白表达水平（IL-1β,IL-6,TNF-α）;Real-time PCR测量脑组织的炎症因子基因表达水平（IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,iNOS,NOX2,CD-11b）。结果:1.野生型小鼠及NOX2-/-小鼠均接受LPS的腹腔注射后,分别从3小时开始到24小时结束每3小时观察一次,两组小鼠都可观察到病态行为,而且均是从3小时开始逐渐加重,直至15小时,病态行为达到最严重的程度。随后病态行为逐渐减轻,但直至24小时,两组小鼠仍存留不同程度的病态行为。其中NOX2-/-小鼠表现出的病态行为较野生型小鼠的病态行为轻微,而在注射LPS后的第9,12,15小时,NOX2-/-小鼠的病态行为评分低于WT小鼠的病态行为,两组差异有统计学意义（p<0.05）。而旷场实验中,NOX2-/-小鼠在第9小时的各项指标高于WT小鼠在第9小时的各项指标（总活动次数506.6±206.7 vs 293.5±183.6;走动次数437.8±184.2 vs 313±210.8;总活动时间138.3±56.6s vs 71.9±43.5s;移动距离681.2±237.2cm vs 252.4±170.3cm）,两组差异有统计学意义（p<0.05）。2.野生型小鼠及NOX2-/-小鼠均接受LPS的腹腔注射后,前者黑质纹状体部位的小胶质细胞出现可活化的迹象,通过CD11b的染色可以观察到,小胶质细胞形状体积的增大,触角的增多,染色深染;对比野生型小鼠,NOX2-/-小鼠黑质纹状体部位的小胶质细胞活化不甚明显,细胞体积较WT-LPS组明显缩小,细胞分叉减少,染色较WT-LPS浅淡,同时与NOX2-/-注射生理盐水组对比,NOX2-/-注射LPS的小鼠的小胶质细胞并且显示出激活的迹象。同时我们还分析了两组小鼠分别给LPS后脑内炎症介质（IL-1β及IL-6）的时间变化规律,发现NOX2-/-小鼠注射LPS后中枢神经系统产生的IL-1β及IL-6均较野生型小鼠注射LPS后中枢神经系统产生的IL-1β及IL-6水平降低（IL-1β:29.58±4.9 pg/ml vs 40.17±3.22pg/ml;IL-6:19.2±2.1 pg/ml vs 25.93±2.61 pg/ml）（p<0.05）。3.腹腔注射LPS后,分次皮下注射右美沙芬后（LPS注射后3小时,6小时,9小时）,每3小时观察一次病态行为。单纯注射LPS组的小鼠,其病态行为评分从第3小时开始,随时间的推移逐渐增加,直至注射LPS后的第15小时,病态行为评分达到最高,此后逐渐下降,至24小时,仍存在一定程度的病态行为。与之相比,注射LPS及右美沙芬组的小鼠,其病态行为随时间推移,其升高的程度较单纯注射LPS组小鼠,表现轻微;尤其是在第6小时,第9小时及第15小时三个时间点,两组之间的病态行为评分差异具有统计学意义（p<0.05）。而旷场实验中,LPS联合DM组小鼠在第9小时的各项指标高于单纯LPS处理组小鼠在第9小时的各项指标（总活动次数785±194 vs 340±91;走动次数711±168vs 294±78;总活动时间194±39.8s vs 60±10.7s;移动距离833±179cm vs332±96.4cm）,两组差异有统计学意义（p<0.05）。4.我们通过ELISA方法连续测定（注射LPS后的第3小时,第6小时及第9小时）小鼠脑组织内的IL-1β,IL-6及TNF-α的含量。发现在腹腔注射LPS后的第9小时（即第三次皮下注射右美沙芬时间点）,测定两组小鼠脑组织内的IL-1β及IL-6的含量（单纯LPS组及LPS联合右美沙芬组）有差异。联合注射LPS及右美沙芬组的小鼠脑组织内第9小时的IL-1β及IL-6水平比单纯注射LPS小鼠脑组织内第9小时的IL-1β,IL-6水平降低（IL-1β:39.41±4.3pg/ml vs 50.73±1.82pg/ml;IL-6:17.9±2.67pg/ml vs 24.7±2.20pg/ml）（p<0.05）;同时我们通过免疫组化染色还发现,腹腔注射LPS后的第24小时,单纯腹腔注射LPS的小鼠,脑组织内黑质纹状体处的小胶质细胞活化程度明显,呈现出体积增大,伪足增多,胞内染色深染（CD11b）的表现;而联合注射LPS及右美沙芬组的小鼠,在第24小时,脑组织内黑质纹状体处的小胶质细胞染色发现,小胶质细胞体积增大较前者减弱,伪足数量较单纯注射LPS组小鼠减少,同时CD11b的染色较单纯注射LPS组小鼠轻微。结论:NOX2-/-模型中,腹腔注射LPS后引起的短期病态行为比野生型小鼠的病态行为轻微,提示NOX2-/-可以减轻腹腔注射LPS引起的小鼠的病态行为;同时使用NOX2的抑制剂右美沙芬,可以通过减轻中枢炎症反应（降低IL-1β,IL-6水平）,达到缓解病态行为的作用。
陈曦[3]（2019）在《放射性核素68Ga标记的示踪剂68Ga-DOTA-TMTP1和68Ga-NOTA-（TMVP1）2在肿瘤靶向分子显像中的研究》文中认为研究目的分子成像技术能够对影响肿瘤行为的生物学过程进行可视化、表征以及监测。TMTP1（NVVRQ）是我们实验室利用细菌鞭毛展示随机肽库筛选出的一种多肽,能够特异性靶向高转移潜能的肿瘤和隐匿性转移灶。在本研究中,我们设计并合成了新型放射性示踪剂68Ga-DOTA-TMTP1,由正电子金属核素68Ga标记环状TMTP1形成,用于宫颈癌的PET成像。该研究的目的是探究其生物学性质及其对肿瘤靶向显像的应用潜力。研究方法采用Fmoc固相合成法合成DOTA-TMTP1,用手动方法或利用半自动化模块标记68Ga,Sep-pak C18 Light固相萃取柱进行纯化并对产品进行质量控制。测定68Ga-DOTA-TMTP1的辛醇水分配系数以及在生理盐水和正常人新鲜血清中的稳定性。体外实验探究68Ga-DOTA-TMTP1在高转移和低转移宫颈癌细胞系Hela和C-33A以及正常宫颈上皮细胞系End1的摄取和排出规律,用细胞阻断实验验证68Ga-DOTA-TMTP1结合的特异性。对正常裸鼠进行1 h动态microPET扫描,观察68Ga-DOTA-TMTP1的体内生物分布及药物代谢动力学。对Hela和C-33A荷瘤小鼠注射68Ga-DOTA-TMTP1后进行静态microPET显像,观察肿瘤和主要脏器对68Ga-DOTA-TMTP1的摄取情况,体内阻断实验验证68Ga-DOTA-TMTP1的特异性。Hela荷瘤小鼠注射68Ga-DOTA-TMTP1后进行离体生物分布研究。研究结果TMTP1与双功能螯合剂1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）连接,并成功标记了68Ga。68Ga-DOTA-TMTP1的放射性产率高,经过Sep-pak C18 Light固相萃取柱纯化后放射性化学纯度大于95%。68Ga-DOTA-TMTP1安全无毒,细菌培养和内毒素检查符合要求。68Ga-DOTA-TMTP1的辛醇水分配系数为-2.76±0.08,表明其亲水性好。68Ga-DOTA-TMTP1在生理盐水和血清中显示出良好的稳定性。68Ga-DOTA-TMTP1在Hela细胞中表现出比在C-33A细胞中更高的摄取,过量TMTP1可阻断与Hela和C-33A细胞的结合。正常裸鼠的体内分布结果显示,68Ga-DOTA-TMTP1经泌尿系统排泄,血液中代谢速度快,肌肉组织的摄取很低。在microPET图像上,Hela肿瘤在60分钟内清晰可见,Hela肿瘤中放射性示踪剂的摄取高于C-33A肿瘤。用TMTP1阻断后,Hela肿瘤的摄取显着降低,因此验证了68Ga-DOTA-TMTP1的特异性。结论本研究合成了一种新型显像剂68Ga-DOTA-TMTP1,合成方法简单快速,放射性产率和纯度高,表现出优异的稳定性、特异性和良好的药代动力学性质,是一种有前景的靶向高转移性肿瘤的分子显像剂。研究目的VEGFR-3在肿瘤淋巴管生成和转移中起关键作用,有望成为实体瘤的诊断指标和治疗靶点。TMVP1是本课题组采用细菌鞭毛随机肽库技术筛选出来的多肽,特异性靶向VEGFR-3,可用于表达VEGFR-3肿瘤的成像和靶向治疗。肽的二聚体的显示出比单体更高的受体亲和力,因此我们设计并合成了基于TMVP1同源二聚体的新型放射性示踪剂68Ga-NOTA-（TMVP1）2。本研究的目的是探讨68Ga-NOTA-（TMVP1）2的生物学性质及其在肿瘤靶向分子成像中的临床应用价值。研究方法将TMVP1同源二聚体与环状螯合剂1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）连接,通过正电子核素68Ga标记合成68Ga-NOTA-（TMVP1）2,并对产品进行质量控制。测定产品的稳定性和酯水分配系数。利用肿瘤异种移植模型对68Ga-NOTA-（TMVP1）2进行micro PET成像和体内生物分布研究。通过临床试验机构伦理委员会审查批准后,进行临床试验研究。本研究共招募5名健康志愿者进行临床试验以评估68Ga-NOTA-（TMVP1）2的安全性以及体内分布特点。纳入22名肿瘤患者行68Ga-NOTA-（TMVP1）2 PET/CT显像及18F-FDG PET/CT显像。采用视觉分析法观察记录病灶的摄取程度,通过测量病灶部位及正常肌肉组织的SUVmax和SUVmean,分析68Ga-NOTA-（TMVP1）2的摄取情况。对术后病灶组织进行免疫组化染色检测VEGFR-3表达水平,分析68Ga-NOTA-（TMVP1）2的成像结果与受体表达水平之间的相关性。研究结果本研究成功合成了68Ga-NOTA-（TMVP1）2,制备方法简单,产率高,产品放射性化学纯度达到97%以上,质量控制符合要求且稳定性好。68Ga-NOTA-（TMVP1）2的分配系数是-2.45±0.43,亲水性好。动物及人体生物分布结果一致显示68Ga-NOTA-（TMVP1）2主要通过肾脏-膀胱途径代谢,部分通过肝-肠途径代谢,在血液中的清除速度快。竞争性结合实验证实68Ga-NOTA-（TMVP1）2显像剂与病灶的特异性结合。所有健康志愿者和肿瘤患者静脉注射68Ga-NOTA-（TMVP1）2后均未出现任何不良反应,注射显像剂后30分钟进行PET/CT采集,结果显示示踪剂主要分布在膀胱、肾脏和肝脏,其次为脾、心和胰腺,示踪剂在脑、肺、肌肉组织和骨髓中的摄取较低。本试验共纳入22名肿瘤患者,均为女性,以18F-FDG PET/CT诊断结果对照,68Ga-NOTA-（TMVP1）2共检出48个阳性病灶（48/70）,病灶对68Ga-NOTA-（TMVP1）2的摄取值SUVmax和SUVmean分别为2.44±1.24和1.66±0.94,与正常肌肉（臀大肌）的SUVmax和SUVmean比值分别为3.13±1.81和3.62±2.32。结论本研究成功合成了一种新型VEGFR-3受体显像剂68Ga-NOTA-（TMVP1）2,合成方法简单,放射性产率和放射性化学纯度高,稳定性和特异性好。通过一系列临床前研究,我们进行了初步的临床转化试验,证实了其良好的肿瘤分子靶向显像的能力,为今后的临床应用提供了可行性。
阳艾珍[4]（2018）在《高分子量激肽原在宿主应答革兰氏阴性细菌感染中的双重作用》文中认为[研究背景和意义]革兰氏阴性（Gram negative,G-）细菌感染是导致脓毒症的主要致病菌。G-细菌释放的内毒素又称脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）是导致脓毒症的重要因素。G-细菌入侵机体后,宿主免疫系统在感染局部感知识别细菌并将其有效清除;但当感染不可控时,机体免疫应答由起初的局部防御作用演变为失控的系统性过度应答,不能恢复到体内的平衡状态,最终形成以持续的过度炎症反应为特征的病理综合征。目前,虽然抗感染治疗和器官功能支持等疗法在一定程度上改善了脓毒症症状,但是脓毒症发病率和死亡率仍居高不下。究其原因,主要是对机体在感染中反应失调的机制,尤其是机体天然免疫系统如何由早期对细菌感染的局部应答和防御,演变为后期的系统性炎症反应的过程仍不清楚。因此深入认识宿主早期对细菌感染的防御识别,及大量细菌物质如LPS释放引发的失控性炎症反应的作用及机制,对阐明细菌感染演变为脓毒症的病理过程,并寻求新的靶向干预措施具有非常重要的临床意义。血浆高分子量激肽原HK（High molecular weight kininogen,HK）是血浆激肽释放酶-激肽系统（Plasma kallikrein-kinin system,KKS）的主要成员。进化分析显示KKS系统与天然免疫系统同源进化,尤其是HK在调控免疫反应中发挥重要作用。且HK可与多种G-细菌结合,与G-细菌感染及脓毒症发病密切相关。但是HK在宿主应答G-细菌感染及其所致脓毒症中的确切作用及相应机制目前仍不清楚。[研究目的]明确HK在感染早期宿主应答识别G-细菌和后期内毒素血症形成及其所致系统性炎症反应中的作用及机制。[研究方法]1.Kng1基因敲除小鼠的制备与鉴定釆用Cre/loxp系统敲除Kng1基因的2-3号外显子,制备全身性Kng1基因敲除小鼠,并分别从基因组DNA水平,肝脏mRNA水平以及血浆蛋白水平进行鉴定。2.在体观察HK在细菌感染所致脓毒症中的作用采用小鼠盲肠结扎穿孔（Cecal ligation and puncture,CLP）和E.coli腹腔感染两种细菌感染模型,观察Kng1+/+与Kng1-/-两组小鼠生存率;E.coli细菌感染后H&E染色组织病理学分析肺组织损伤情况;血平板涂板计数菌落克隆形成数（colony-forming units,CFU）分析小鼠血浆、肝脏和脾脏的载菌量,评价小鼠体内的细菌负载情况;Luminex检测小鼠血浆中主要促炎因子水平。3.体外检测HK对E.coli细菌增殖的影响E.coli细菌分别与野生型大、小鼠和HK缺乏大、小鼠的血浆共培养,运用酶标仪实时记录OD值变化情况,绘制细菌增殖曲线;LB固培涂板计数细菌CFU,综合评价HK对细菌增殖的影响。4.HK与E.coli细菌结合情况（1）体内检测HK与细菌的结合情况。Kng1-/-小鼠耳部皮下接种E.coli后,分别给予静脉注射碘化标记的HK蛋白125I-HK和对照蛋白125I-BSA,2小时后小动物同位素活体成像检测HK是否与E.coli结合。（2）体外流式分析FITC标记的HK蛋白FITC-HK与E.coli细菌的结合能力。5.HK与G-细菌结合的机制分析（1）流式细胞术分析FITC-HK与G-细菌结合是否依赖于标志物分子LPS。（2）HK与LPS结合水平的概况分析。亲和共沉淀检测LPS与人、小鼠血浆中HK是否直接结合;ELISA亲和实验分析HK纯蛋白与LPS的结合情况;表面等离子体共振法定量测定HK与不同G-细菌种属来源的LPS结合水平,并分析HK与LPS组成部份脂质A（Lipid A）的结合能力,以解离平衡常数KD值（KD=结合速率常数Ka/解离速率常数Kd）表示;蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatograpHy,FPLC）分析液相条件下LPS与HK形成复合物的特性并计算LPS与HK结合的分子摩尔比。（3）解析HK轻链第五结构域中与LPS结合的功能序列合成8条30个氨基酸长度的重叠肽,每条多肽序列依次以15个氨基酸重复递进,覆盖第五结构氨基酸序列全长（402V-520G）。采用亲和共沉淀法检测各多肽序列是否竞争性抑制HK与LPS的结合。（4）HK与细菌结合是否被活化裂解建立E.coli细菌腹腔感染模型,ELISA检测血浆中BK含量;制备特异性识别HK的LPS结合位点（即DHGHKHKHGHGHGKH,DHG15）的单克隆抗体6C9G4,通过蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测G-细菌感染脓毒症患者和E.coli细菌感染小鼠血浆中是否含有DHG15序列抗原表位的HK活化裂解片段。6.HK在宿主抵抗G-细菌感染所致脓毒症中的作用机制（1）ExPASy网站软件（Compute pI/Mw）分析DHG15序列的等电点,电荷等理化特性。（2）流式细胞术检测FITC标记的DHG15多肽序列（FITC-DHG15）与E.coli细菌的结合情况。（3）梯度浓度的DHG15多肽与E.coli细菌共孵育后,流式细胞术分析碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）阳性细菌百分比（PI阳性定义为细菌胞膜发生溶解的细菌）,LB固培涂板计数细菌CFU,综合评价DHG15多肽的杀菌效应。（4）DHG15多肽序列的毒理分析CCK-8法检测DHG15多肽对哺乳动物细胞RAW264.7的细胞毒性;红细胞溶血实验检测DHG15多肽对小鼠红细胞的溶血活性。（5）DHG15肽在体内的抗菌效应。建立E.coli细菌腹腔感染模型,静脉给予DHG15多肽,16小时后取材血平板涂板计数细菌CFU（包括血液及肝脏、脾脏、肾脏组织研磨液）,分析小鼠体内载菌量情况。7.判定HK在LPS诱导的内毒素血症中的作用采用腹腔注射LPS建立小鼠内毒素诱导的脓毒症模型,观察Kng1+/+与Kng1-/-两组小鼠生存率;Luminex检测血浆中促炎因子TNF-α,IL-1β,IL-6和HMGB-1的水平;制作肺组织病理切片,H&E染色检测肺组织病理变化。8.HK对LPS代谢清除的影响（1）应用显色基质鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate,LAL）测定小鼠、大鼠内毒素血症模型中血浆循环LPS含量。进一步运用高效液相色谱-质谱-质谱联用法（HPLC/MC/MC）分析LPS萃取物3-羟基十四烷酸（3-hydroxytetradecanoic acid,3-HM）含量,测定大鼠内毒素血症模型中血浆LPS浓度。（2）将碘化标记的LPS(125I-LPS)静脉注射30分钟后收集外周血血浆和肝脏,检测血浆和肝脏组织中的的放射性含量。（3）DHG15序列在HK维持LPS血浆浓度的作用应用哺乳动物细胞表达体系制备缺失DHG15序列的HK蛋白:HK/Δ492-506,将HK/Δ492-506蛋白静脉注射入Kng1-/-小鼠后再给小鼠腹腔注射LPS,LAL法检测蛋白注射前后小鼠血浆中LPS含量。9.HK裂解产物HKa（双链HK）及其功能域LC对LPS活性的影响（1）应用酶标仪检测BODIPY FL-LPS荧光动态变化,分析HK及其活化产物HKa,HC以及LC对LPS的解聚情况。LPS解聚程度与BODIPY的荧光强度呈正比。（2）ELISA法检测HKa和LC对LPS诱导RAW264.7单核细胞产生炎症因子的生物学活性影响。10.运用6C9G4单克隆抗体抑制LPS与HK的结合在治疗LPS诱导的内毒素血症中的作用观察6C9G4抗体治疗后是否缓解LPS所致小鼠死亡率,系统炎症性反应以及肺组织病理损伤程度;分析支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中总蛋白量,白细胞总数和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）含量评价肺组织炎症程度。11.人与小鼠HKa调节LPS生物学活性的差异（1）应用酶标仪检测人源HKa（hHKa）和鼠源HKa（mHKa）对LPS的解聚效率和解聚程度。（2）ELISA法分析hHKa和mHKa对LPS诱导RAW264.7单核细胞产生炎症因子的活性影响。（3）Western blotting法检测人与小鼠血浆中单链HK的含量。[研究结果]1.Kng1基因敲除小鼠制备成功鼠尾基因组PCR鉴定可见Kng1基因2号和3号外显子被成功敲除;RT-PCR结果显示Kng1基因敲除小鼠(Kng1-/-)肝脏组织中Kng1 mRNA无表达,但不影响Kng2 mRNA的正常表达;免疫印迹结果进一步显示Kng1-/-小鼠血浆中无HK蛋白表达,表明Kng1基因敲除小鼠构建成功。2.HK在细菌感染所致脓毒症中发挥宿主抵抗的保护作用。在CLP和大肠杆菌E.coli细菌腹腔感染两个脓毒症模型中,HK缺乏的Kng1-/-小鼠生存率较野生型Kng1+/+小鼠显着降低,与此相应地可见HK缺乏显着加重E.coli细菌感染小鼠肺组织损伤,增强系统炎症反应并增加脏器和血液的载菌量。3.体外细菌增殖实验发现血浆HK的缺乏促进E.coli细菌增殖,表明HK具有杀菌或抑制细菌生长的作用。4.HK与E.coli细菌直接结合（1）小动物同位素活体成像显示HK在体内可快速募集至E.coli细菌感染灶处。（2）体外流式结果可见HK与E.coli细菌呈浓度依赖性结合,在约100nM HK时到达饱和。5.HK通过位于轻链第五结构域的DHG15序列与LPS结合识别G-细菌并被活化（1）当EDTA提前处理E.coli使LPS解体后,HK与E.coli细菌的结合几乎完全消失,表明HK通过LPS与E.coli细菌结合。（2）LPS微球特异性与血浆中HK蛋白结合而将其亲和沉降出来,而对照微球未见相应HK条带;亲和ELISA检测可见HK与LPS呈浓度依赖性结合;HK通过LPS糖链结构与G-细菌不同种属来源的LPS（K.pneumoniae,P.aeruginosa,S.minnesota）呈高亲和性结合,解离平衡常数为皮摩尔水平。FPLC结果显示HK与LPS结合后形成HK/LPS复合物,平均每个LPS分子结合1-2个HK分子。（3）免疫印迹结果显示只有第6条和第7条多肽可竞争性抑制HK与LPS的结合。分析多肽6和多肽7的序列可得两者的共有序列是DHGHKHKHGHGHGKH,将其命名为DHG15。提示位于HK第五结构域中的DHG15序列是HK与LPS结合的功能性位点。（4）G-细菌脓毒症患者和E.coli细菌感染小鼠的血浆中可见HK活化裂解暴露出DHG15序列表位的降解片段。6.DHG15多肽是宿主防御性多肽DHG15序列表现出和天然抗菌肽类似的特性,如表面带正电荷。DHG15多肽呈浓度依赖性与E.coli细菌直接结合,对E.coli细菌具有与LL-37相当的杀菌效应,但对哺乳动物细胞无溶血活性并表现出低毒性,是一种安全的抗菌肽。DHG15多肽显着降低小鼠感染E.coli细菌后血液和脏器中的载菌量。7.HK的缺乏对LPS所致死亡具有保护作用Kng1+/+小鼠和Kng1-/-小鼠腹腔注射致死剂量的LPS后,约90%的Kng1+/+小鼠在50小时内死亡,而Kng1-/-小鼠全存活,相应地可见HK缺乏显着缓解了LPS导致的急性肺损伤,抑制了系统性炎症反应。8.（1）HK缺乏降低内毒素血症血液循环中LPS水平HK缺乏的小鼠和大鼠血液循环中LPS水平显着降低,促进LPS向肝脏代谢清除。（2）DHG15序列是HK维持LPS血浆浓度的关键位点Kng1-/-小鼠在补偿HK/Δ492-506重组蛋白后未见血浆LPS水平升高至与野生型小鼠相当的水平,证实HK中与LPS结合的DHG15氨基酸序列是HK维持LPS血浆浓度的关键序列。9.HK通过轻链LC促进LPS生物学活性HKa及其功能域轻链LC,直接解聚LPS形成单体,且具有促进LPS促炎效应的生物学活性。10.特异性识别DHG15序列的单克隆抗体6C9G4缓解LPS诱导的内毒素血症通过抑制LPS与HK的结合,6C9G4抗体有效缓解LPS诱导的小鼠死亡及急性肺损伤,显着降低循环LPS浓度和系统性炎症因子水平,同时可见显着降低了BALF中的白细胞总数,总蛋白量以及肺组织裂解液中MPO水平。11.人与小鼠HKa对LPS具有同等的生物学活性人源HKa（hHKa）和鼠源HKa（mHKa）与LPS的结合力相当,表现为等同的LPS解聚能力及对LPS促炎效应的促进作用,即hHKa与mHKa两者本身具有相等的LPS生物学活性调控作用。但人血浆中与LPS结合的含DHG15序列的全长单链HK的浓度是小鼠血浆中的2倍。[结论]1.HK是新的针对LPS的模式识别分子（Pattern recognition molecules,PRMs）。HK通过识别LPS与G-细菌结合,感知入侵细菌的存在,并被裂解暴露出DHG15序列发挥杀菌效应,从而作为“监视预警”分子,在宿主早期抵抗G-细菌感染中起重要的防御保护作用。2.HK是新的关键LPS载体,具有持续性维持血液循环LPS水平的特异性作用,从而加强宿主对LPS的系统性炎症反应,可能是G-细菌感染后期形成内毒素血症的重要机制。3.HK在宿主应答G-细菌感染的过程中具有“双刃剑”效应。G-细菌感染早期,HK识别G-细菌LPS而感知入侵细菌,并发挥杀菌效应;当G-细菌破坏释放大量LPS时,HK作为LPS载体维持LPS血浆浓度,促进系统性炎症反应,从有利的宿主防御转向有害的促炎效应。4.HK是治疗内毒素血症的新的有效靶点。
贾晓晓[5]（2015）在《三个LipidA合成酶基因的克隆、原核表达及B-LPS刺激条件下RAW264.7细胞Casp4的表达研究》文中指出布鲁氏菌脂多糖（B.melitensis LPS, B-LPS）是布鲁氏菌细胞壁的主要成分,它主要由O-抗原、核心多糖和类脂A （LipidA）三部分组成。LipidA是B-LPS的疏水基团,可以将亲水性的核心多糖和O-抗原黏附在细菌的外表面构成完整的细胞壁；同时LipidA也是内毒素的活性成分,对B-LPS结构和功能完整性是必不可少的。LipidA的合成是在一系列酶的催化作用下完成的,参与LipidA合成的9种酶及其编码基因在大部分的革兰氏阴性细菌中都存在。Caspase-4（Casp4）属于炎性Caspases家族的一员,在炎症反应的发生上扮演重要角色,它是B-LPS的胞内天然免疫受体,在大多数正常的组织中表达水平很低。本研究第二章对B-LPS LipidA合成有关的三个重要催化酶的基因LpxC、LpxK和KdtA进行了克隆、原核表达、生物信息学分析及序列比对。结果表明：成功对这三个基因进行了克隆和原核表达,通过生物信息学分析,初步了解了这三个催化酶的二级结构和疏水区；对不同brucella种属的这三个基因进行了同源性分析,发现这三个基因序列相对保守,在各种属间同源性较高。通过这部分的研究,能帮助我们更好的了解B-LPS LipidA的合成过程,由于LipidA是B-LPS的活性成分,因此为进一步研究B-LPS的功能奠定了基础。本研究第三章用不同刺激浓度和刺激时间的B-LPS刺激RAW264.7细胞,对Casp4蛋白表达以及对IL-1β、TNF-a的分泌情况进行了分析。结果表明：B-LPS刺激能引起RAW264.7细胞Casp4蛋白表达上调,同时还能引起IL-1β、TNF-α分泌增加。本研究第四章应用小干扰RNA（Small interfering RNA, siRNA）抑制B-LPS刺激条件下Casp4蛋白的表达,应用Western blot方法检测基因沉默效果,通过对转染条件的反复筛选,确定了最适合的转染条件；应用酶联免疫吸附法检测转染后细胞因子分泌水平的变化。结果表明,在B-LPS刺激条件下,siRNA能有效抑制Casp4蛋白的表达；B-LPS刺激条件下,通过siRNA使Casp4knockdown, RAW2647细胞对IL-1β和TNF-α分泌量减少。这些试验结果为研究通过抑制上游的炎症通路从而减弱损伤性炎症反应的实验设想提供了可能,同时为探究布鲁氏菌的致病机理提供了重要依据。
黄利兴[6]（2014）在《脂氧素对鼠源性巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路的影响及其作用机制》文中提出研究背景和目的：炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一组病因和发病机制不明确、以慢性炎症为特征的肠道炎性疾病。目前认为可能与基因易感性宿主对肠道微生物及其代谢产物产生异常的免疫应答有关，并且免疫异常在IBD肠道炎症的发生发展中起重要的作用。近年来有关治疗IBD的新制剂多从调节免疫和炎症反应入手，因此，阐明IBD发病过程的炎症反应及其调控机制，对于寻找IBD治疗新靶点、开辟IBD治疗新途径是极为重要的。迄今为止，传统药物治疗包括抗生素类、5-氨基水杨酸类、肾上腺糖皮质激素以及免疫抑制剂，但疗效不理想、副作用大、患者依从性差；新型药物主要为生物制剂如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）的单抗，但价格昂贵、长期使用的安全性问题尚存争议。因此，我们设想是否可寻找一种内源性的抗炎、促消退调节介质，从而为IBD的治疗提供新的思路？脂氧素（Lipoxins，LXs）是花生四烯酸的重要代谢产物，它在各种炎症相关性疾病组织中广泛表达，能够调节多种炎症相关基因的表达和多种炎性细胞的功能，对炎症反应的及时消退具有重要的作用，被誉为是中性粒细胞介导的组织损伤的“停止信号”或“刹车信号”，在维持机体内环境稳态中起重要的作用。TLRs/NF-κB信号通路与固有免疫及获得性免疫密切相关，既参与机体防御病原体的入侵，又是炎症反应的启动闸门，大量研究表明TLRs/NF-κB信号通路的异常激活在IBD发病中起重要作用。目前，在许多动物及细胞模型中发现LXs能够抑制NF-κB的活化，从而减轻炎症反应，但在IBD中其具体机制又是如何呢，目前尚不清楚，为此，我们进行了本项目的研究。本文旨在体外观察脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对LPS作用的鼠源性巨噬细胞株RAW264.7，明确脂氧素对巨噬细胞中TLR4/NF-κB信号通路的影响及其可能机制，以期为IBD的药物治疗开辟新的思路。研究方法：㈠LPS对巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路的影响取对数生长期的小鼠巨噬细胞株RAW264.7，用不同浓度的LPS分别作用2h、4h、6h后提取细胞蛋白（重复3次），免疫印迹方法检测TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的表达，以确定LPS作用的最佳浓度和时间点。实验分为以下五组：①对照组：不加任何药物处理巨噬细胞；②实验组1：用10ng/ml LPS处理巨噬细胞；③实验组2：用100ng/ml LPS处理巨噬细胞；④实验组3：用1000ng/ml LPS处理巨噬细胞；⑤实验组4：用10000ng/ml LPS处理巨噬细胞；㈡脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对LPS作用巨噬细胞存活的影响实验分组：①对照组：不加任何药物处理巨噬细胞；②脂氧素（LXA4）组：用300nM LXA4处理巨噬细胞；③脂氧素受体激动剂（BML-111）组：用10μM BML-111处理巨噬细胞；④脂氧素受体拮抗剂（BOC-2）组：用10μM BOC-2处理巨噬细胞；以上四组再分为LPS作用与无LPS作用两组，CCK-8检测LPS的细胞毒性及脂氧素的作用。㈢脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路、SOCS2及炎症细胞因子分泌的影响⑴实验分组：①对照组：不加任何药物处理巨噬细胞；②脂氧素（LXA4）组：用300nM LXA4处理巨噬细胞；③脂氧素受体激动剂（BML-111）组：用10μM BML-111处理巨噬细胞；④脂氧素受体拮抗剂（BOC-2）组：用10μM BOC-2处理巨噬细胞；上述四组再分为LPS作用与无LPS作用两组，根据第一部分结果取LPS作用的最佳浓度和时间点（1000ng/ml作用6h）,6h后提取细胞蛋白并收集细胞培养上清（重复3次）。⑵检测方法：①实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测巨噬细胞内TLR4、TRAF6、SOCS2mRNA的表达。②蛋白印迹法（Western blot）检测细胞内TLR4、TRAF6、SOCS2及pNF-κBp65蛋白的表达。③酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中细胞因子IL-6、IL-10的含量。研究结果：㈠LPS对巨噬细胞中TLR4/NF-κB信号通路的影响：①不同浓度LPS作用巨噬细胞2h，各组TLR4蛋白表达均低于对照组（P<0.05），而1000ng/ml LPS组pNF-κB p65蛋白的表达高于其余各组（P<0.05）；作用4h，在0-1000ng/ml浓度范围内，1000ng/ml LPS组TLR4、pNF-κB p65蛋白的表达显着高于其它浓度组（P<0.05）；作用6h，在一定浓度范围内，巨噬细胞内TLR4及pNF-κB p65蛋白表达随着LPS浓度增加而增加，其中1000ng/ml LPS组显着高于其余各组（P<0.05）。②相同浓度LPS作用巨噬细胞不同时间，100ng/ml LPS作用6h后TLR4和pNF-κB p65蛋白表达均高于2h、4h组，差异有统计学意义（P<0.001, P<0.05）；1000ng/ml LPS组作用4h、6h TLR4蛋白表达显着高于2h（P<0.01），同时6h显着高于4h（P<0.05）。㈡脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对LPS作用巨噬细胞存活的影响在无LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞的存活率无影响（P>0.05）；而在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂组细胞存活率显着高于对照组及拮抗剂组（P<0.05,P<0.01）。而同时在对照组及拮抗剂组，LPS作用后巨噬细胞的存活率显着低于相应的无LPS组（P<0.01,P<0.05）。㈢脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内SOCS2的影响无论有无LPS作用，脂氧素及其受体激动剂组巨噬细胞内SOCS2mRNA及蛋白的表达显着高于对照组和拮抗剂组（P<0.05），而对照组和拮抗剂组无差别（P>0.05）；各LPS组巨噬细胞内SOCS2mRNA及蛋白的表达与其相对应无LPS组无差别（P>0.05）。㈣脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞中TLR4/NF-κB信号通路和炎症细胞因子分泌的影响①各组细胞中TLR4mRNA及蛋白的表达：无论有无LPS作用，巨噬细胞的TLR4mRNA及蛋白表达在各组之间无差异（P>0.05）；而在LPS作用下，巨噬细胞的TLR4mRNA及蛋白表达显着高于相对应的无LPS组（P<0.05）。②各组细胞中TRAF6mRNA及蛋白的表达：无论有无LPS作用，各组巨噬细胞内的TRAF6mRNA的表达无差异（P>0.05）；各LPS组巨噬细胞内的TRAF6mRNA的表达高于相对应的无LPS组，但仅在对照组有差别（P<0.05）；在无LPS作用下，各组巨噬细胞内的TRAF6蛋白的表达无差异（P>0.05）；在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂组TRAF6蛋白的表达低于对照组及拮抗剂组（P<0.05）；在LPS作用后TRAF6蛋白的表达在对照组及拮抗剂组高于相对应的无LPS组（P<0.05）；而在脂氧素及其受体激动剂组，无论有无LPS作用TRAF6蛋白的表达无差异（P>0.05）。③各组细胞pNF-κB p65蛋白的表达：在无LPS作用下，各组巨噬细胞内的pNF-κB p65蛋白的表达无差异（P>0.05）；在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂组pNF-κB p65蛋白的表达低于对照组及拮抗剂组（P<0.05）；在LPS作用下，拮抗剂组pNF-κB p65蛋白的表达高于其余各组（P<0.05），同时在对照组及拮抗剂组高于相对应的无LPS组（P<0.05）；而在脂氧素及激动剂组，无论有无LPS作用pNF-κB p65蛋白的表达无差异（P>0.05）。④各组细胞培养上清中IL-6、IL-10的含量变化a在无LPS作用下，各组巨噬细胞培养上清中IL-6的含量无差异（P>0.05）；在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂组IL-6的含量低于对照组及拮抗剂组（P<0.05）；无论有无脂氧素处理，LPS作用组IL-6的含量显着高于相应的无LPS组（P<0.05）。b在无LPS作用下，各组巨噬细胞培养上清中IL-10的含量无差异（P>0.05）；在LPS作用下，脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂组IL-10的含量低于对照组（P<0.05）；在对照组中无论有无LPS作用，巨噬细胞培养上清中IL-10的含量无差异（P>0.05）；而在脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂组中，LPS作用后巨噬细胞培养上清中IL-10的含量显着高于相应的无LPS组（P<0.05，P<0.01）。结论：1、LPS能够激活鼠源性巨噬细胞TLR4/NF-κB信号通路，并在一定范围内呈浓度依赖性。2、脂氧素能够逆转LPS对巨噬细胞的毒性作用。3、脂氧素能够通过上调小鼠巨噬细胞TLR4/NF-κB信号通路的负性调控因子SOCS2的表达，促进TRAF6的降解，抑制NF-κB的核转位及促炎细胞因子的分泌，促进抗炎细胞因子的分泌，从而减轻炎症反应。
张中晓[7]（2014）在《柴胡毒素毒性代谢组学及毒性机制研究》文中研究表明柴胡属植物复伞形花序，高150cm左右，叶子细长交替生长，花为双性，微黄或略带紫色，含有二百个种，主要生长在北半球，在东北亚以及北非，人类很早就利用该属的天然药物治疗疾病。2010版《中国药典》收载狭叶柴胡（B. scorzonerifoliumWilld.）和北柴胡（Bupleurum chinense DC.）的干燥根为中药柴胡的植物来源。柴胡在很多中药复方中都有入药，例如柴胡口服液、小柴胡汤、柴胡舒肝丸等,用于治疗感冒，发炎，发热，肝炎等。2010版《中国药典》收载狭叶柴胡（B. scorzonerifoliumWilld.）和北柴胡（Bupleurum chinense DC.）的干燥根为中药柴胡的植物来源。但是，各种柴胡属植物不易区分，分布广泛，各种之间易混用，导致非正品柴胡被误用为正品柴胡。在中国东北地区曾经发生过误用有毒植物大叶柴胡作为柴胡药材，人服用后导致死亡的严重事件，会出现恶心，呕吐，抽搐，呼吸急促等症状。经过系统的植物化学以及现代药理研究证实，柴胡属中具有神经毒性作用的为多炔烯类化合物，这类化合物广泛存在于伞形科，五加科和紫莞目中，在食物中药材中分布广泛。该类化合物具有很好的药理活性，但也具有潜在的神经毒性，因此需要对其毒性进行深入的研究，对人类健康及指导中药安全应用具有重大的意义。迄今为止，对该有毒植物毒性机制研究较为薄弱，对该类化合物的报道只表明其具有神经毒性作用，作用的靶器官，靶部位，均未见报道，除了具有神经毒性之外是否还有其它方面的毒性，神经毒性又是一个怎样的作用机制，人类对它们还知之甚少。传统的药物毒性研究已经非常成熟，往往选择特定的生化指标来表征特定的生理毒性，根据相关的组织病理切片来研究某一方面的毒性，这种方法存在一定的局限性，无法从整体揭示药物毒性作用特点，因此，新型毒性研究方法需要建立。鉴于此，本研究选取柴胡属大叶柴胡中植物中的毒性成分柴胡毒素进行毒性代谢组学研究，发现该类化和毒性作用的生物标志物，阐明机体对该类化合物的整体反应；并建立运用代谢组学研究该类化合物毒性的方法。并由代谢组学的研究发现为基础，设计了进一步的验证实验，深入的阐明了该类化合物的毒性机制。本研究以大叶柴胡毒性成分柴胡毒素为研究对象，分别进行急性毒性研究，代谢组学研究，以及毒性机制研究，力图阐明柴胡毒素的毒性作用特点，作用部位，作用机制。最终为该类化合物的毒性研究提供有力的数据支持，这就是本课题的研究目的。本课题研究采用传统毒理试验与代谢组学研究方法相结合的方法，从局部到整体，层层推进，逐步阐明柴胡毒素的毒性作用特点以及毒性作用机制。研究发现柴胡毒素半数致死量达到3mg/kg，病变部位在大脑海马区，代谢组学实验鉴定了血清17个标志物，尿液11个标志物，这些生物标志物主要与色氨酸代谢、嘌呤代谢，炎症相关，表明柴胡毒素毒性发作与犬尿氨酸途径，氧化应激，炎症反应密切相关。进一步毒性机制研究发现，柴胡毒素通过抑制神经受体GABA的活性，导致神经兴奋性的产生，神经细胞过度放电，钙离子大量内流，导致神经细胞的死亡，而GABA受体就是柴胡毒素最初的效应靶点，之后才引起了一系列的毒性反应。由此本研究阐明了柴胡毒素的毒性作用的靶部位，毒性机制，由此也揭示了多炔烯类化合物神经毒性作用的特点，为该类化合物的毒性机制研究提供了有利的数据支持。本论文包括五个方面的内容，具体的内容如下：第二章：急性毒性研究。本研究对大叶柴胡植物总提物，利用各种色谱分离手段以及光谱手段分离鉴定所需要的化合物柴胡毒素。之后将小鼠腹腔注射给药，观察记录小鼠的生理反应，统计死亡动物数，采用bliss法测算半数致死量，并对死亡小鼠的脏器进行组织病理学检查，确定病变部位。第三章：柴胡毒素毒性的代谢组学研究。在代谢组学部分，我们首先采用腹腔注射给要的方式注射柴胡毒素，小鼠出现明显的中毒症状。之后我们采用反相液相色谱串联四级杆飞行时间质谱方法对对照组小鼠和给药组小鼠血清进行代谢组学研究并鉴定相关毒性生物标志物。采用PLS-DA进行判别分析，在小鼠血清中鉴定了17个生物标志物。这些生物标志物主要与色氨酸代谢、嘌呤代谢，炎症相关，表明柴胡毒素毒性发作与犬尿氨酸途径，氧化应激，炎症反应密切相关。通过血清中鉴定的生物标志物进行网络构建表明，标志物与兴奋性神经受体具有相关性，这可能提示我们柴胡毒素可能直接作用于受体引起神经兴奋，为我们以后机制研究提供了一定的依据。另一方面，我们还对小鼠尿液进行了代谢组学研究基础，在小鼠尿液中鉴定了11个生物标志物。这些生物标志物主要与脂质过氧化、氧化应激，炎症反应相关。为我们以后机制研究提供了思路。第四章：TH1与TH2免疫失衡与柴胡毒素神经毒性的关系。研究发现TH1/TH2免疫失衡与柴胡毒素的神经毒性有极大的关系，在中毒小鼠体内血清中检测到几种细胞因子明显高于正常组，这说明了柴胡毒素扰乱了TH1/TH2免疫平衡，体内出现炎症反应，而炎症因子的出现是诱发色氨酸代谢紊乱的重要原因。第五章：柴胡毒素神经毒性与相关受体的研究。研究发现柴胡毒素能有效抑制神经受体GABA的活性，导致神经兴奋性的产生，神经细胞过度放电，钙离子大量内流，导致神经细胞的死亡，而GABA受体就是柴胡毒素最初的效应靶点，之后才引起了一系列的生物级联反应。
韩政岚[8]（2014）在《低副作用的大麻类镇痛药物研究：内源肽类激动剂的鉴定和药物联用新策略》文中研究指明疼痛是人类所经受的最常见的症状之一,传统的镇痛药物由于存在不同程度的不良反应,导致其在临床应用中具有很大的局限性。近年来,大量的研究表明大麻类药物在高效、低副作用的新型镇痛药物的研发方面具有广泛的应用前景。但是,大麻作为镇痛药物使用时仍需克服一些中枢副作用,如抑制运动、便秘、降低体温、药物耐受及成瘾等。本论文中主要探讨了两种降低大麻类镇痛药物副作用的新途径:1)系统地评价了新型大麻肽类激动剂的镇痛活性及其中枢副作用,以期为新型肽类大麻镇痛药物的研究提供全新的化学模板分子;2)基于大麻和神经肽FF （NPFF）系统相互作用的研究,探讨了大麻与NPFF系统的配体联用介导低副作用的镇痛活性的新策略。近年来,研究人员利用分子的不同特性构建的新型大麻配体分子,有效地降低或减少了大麻类药物的一些副作用。最近,在机体内又发现了一类内源性大麻肽类配体,其分子理化性质和药代动力学特性不同于传统的大麻类配体,在体外实验中表现为大麻样激动活性,系统地鉴定该类激动剂的镇痛作用及中枢活性,有望为低副作用的大麻类镇痛药物的设计和发现提供全新的化学模板分子。因此,本文系统地评价了源于小鼠血红蛋白α链的CB1受体新型肽类激动剂（m）VD-Hpα的在体活性。在小鼠光热甩尾实验中,脊髓以上及脊髓水平注射的（m）VD-Hpα均表现出较强的镇痛活性,其镇痛EC50值分别为6.69和2.88 nmol。受体拮抗实验结果表明,（m）VD-Hpα在中枢引起的镇痛作用是CB1受体介导的。此外,侧脑室注射的（m）VD-Hpα只有在较高的有效镇痛剂量下才表现出降低体温和抑制运动的活性,但在高剂量时对胃肠运动也无显着的调节作用。另外,（m）VD-Hpα并不诱导奖赏作用;虽然,在较高的有效镇痛剂量（2×EC50和3×EC50）下,（m）VD-Hpα也会产生镇痛耐受,但其耐受程度要低于传统大麻激动剂WIN55,212-2的。此外,中枢注射的（m）VD-Hpα还能诱导增强摄食的作用。因此,与传统的大麻激动剂相比,大麻肽类激动剂（m）VD-Hpα在中枢能介导显着的镇痛活性且伴随较少的中枢副作用。在药物联用策略中,大量的报道指出大麻与阿片等其它药物联用能有效降低大麻镇痛药物的给药剂量,从而降低或避免其副作用的产生。本研究系统地探讨了 NPFF与大麻系统之间的相互作用,并基于此研究提出了 NPFF与大麻系统的配体联合给药的新策略。本文的研究结果表明,NPFF及相关肽能通过自身受体对大麻受体非选择性激动剂WIIN55,212-2的中枢（CB1受体介导）和外周（（B2受体介导）镇痛表现出显着的调节作用。侧脑室注射的NPFF受体非选择性激动剂NPFF能显着减弱WIN55,212-2的中枢和外周镇痛,而NPFF1和NPFF2受体选择性激动剂NPVF和dNPA则增强了大麻的中枢和外周镇痛,且NPVF的增强效果更显着。基于以上NPVF对WIN55,212-2中枢镇痛的增强作用,本文进一步评价了NPVF与WIN55,212-2联用的新策略介导的镇痛和中枢副作用。在小鼠光热甩尾实验中,WIN55,212-2和NPVF联合注射引起的镇痛显着强WIN55,212-2单独的作用,镇痛EC50值从大麻单独的3.51 nmol降低到与NPVF联合注射的0.69 nmol。而且,3 nmol WIN55,212-2 和 30 nmol NPVF 联用与 9 nmol WIN55,212-2 诱导相当程度的镇痛作用。进一步的受体拮抗实验表明,WIN55,212-2的中枢镇痛是通过CB1受体介导的。同时,NPVF增强CB1受体介导的大麻中枢镇痛是通过特异性激活NPFF受体实现的。虽然,3 nmol WIN55,212-2与NPVF联用也会引起与9nmolWIN55,212-2相当的降低体温和抑制运动的作用,但是,联合注射对胃肠运动的抑制显着减少,尤其是联合注射能介导无耐受的镇痛作用。这些数据表明,由大麻CB1和NPFF受体共同介导的WIN55,212-2与NPVF联合产生的增强的镇痛伴随的副作用要显着小于高剂量WIN55,212-2介导的,且两种药物的联用能避免高剂量大麻镇痛耐受的出现。综上所述,本文通过一系列的在体实验探讨了降低大麻镇痛药物副作用的两种新策略:1）大麻CB1受体的内源性肽类激动剂（m）VD-Hpα能介导高效的镇痛活性,且只有在较高的镇痛剂量下才表现出抑制运动、降低体温和镇痛耐受等中枢副作用。另外,（m）VD-Hpα在高的镇痛剂量下也未表现出抑制胃肠运动和奖赏的作用。因此,该肽类大麻激动剂可以作为新的有价值的先导化合物,通过进一步结构改造构建低副作用的大麻类镇痛新药;2)大麻激动剂和NPVF联用的新策略有效地降低了大麻镇痛药物的剂量,从而减少或减弱了大麻的部分中枢副作用。因此,本文通过对新的大麻配体镇痛活性的鉴定和药物联用的研究为高效、低副作用的大麻类镇痛药物的研发提供了新的思路和理论依据。
范丽霞[9]（2013）在《几株放线菌发酵液抑菌活性成分的研究》文中研究说明微生物是活性先导化合物及新药最重要的来源之一。放线菌与人类的生活关系极为密切，是一类比其他微生物更为丰富的生物活性物质资源。本文在原有工作的基础上，进一步研究了添加前体物质对放线菌Streptomycesalboflavus313菌株发酵液活性及代谢产物中各成分含量的影响，并对其发酵液中的活性成分进行了进一步的分离和结构鉴定；本文还以菌株SC11、11D2-9和GXWl作为材料，分别从菌株发酵产物的生物活性测定、主要活性代谢产物的分离纯化和结构鉴定、菌株的分类鉴定方面进行了系统的研究，主要研究结果如下：1.研究了添加前体物质对Streptomyces alboflavus313菌株发酵液的抑菌活性及其代谢产物中各成分含量的影响，结果表明发酵液中添加0.5g/L L-谷氨酸钠时，代谢产物m/z750、723、860和743的含量分别比对照提高了10.50倍、22.48倍、16.73倍和12.59倍。2.采用活性追踪的方法，从添加0.5g/L L-谷氨酸钠的S. alboflavus313菌株发酵液中分离得到一个抗菌活性成分，鉴定为一种新颖的环六肽化合物NW-G12。与NW-G01的区别是NW-G12的色氨酸没有被氯化。通过抗菌谱和抑菌活性的比较，发现NW-G01和NW-G12并没有明显的差异。这说明色氨酸上氯原子的有无并不是抑菌活性的决定性因素。同时，从该菌株发酵液中还分离得到了1个活性化合物F2，鉴定为沙漠霉素A。3.研究了化合物NW-G01对番茄灰霉病菌的作用机理。100μg/mL NW-G01处理12h后，菌丝的还原糖、壳聚糖、可溶性蛋白和丙酮酸含量、几丁质酶活性均呈现降低的趋势。4.采用活性追踪的方法，从SC11菌株发酵液中分离得到了1个活性化合物F5。室内生测结果表明，F5对革兰氏阳性菌蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑菌活性，其MIC值分别为3.9μg/mL、7.8μg/mL和7.8μg/mL；而对革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌没有明显的抑菌活性，其MIC值均大于250μg/mL。对苹果炭疽病菌、茄子黄萎病菌、小麦赤霉病菌、烟草赤星病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌等主要农作物病原真菌的菌丝生长均有一定程度的抑制作用。根据MS、1H NMR、13C NMR等波谱数据分析，将其鉴定为沙漠霉素A。5.建立了沙漠霉素类化合物的液-质联用分析方法，可以用于抗生素筛选研究中沙漠霉素类化合物的早期识别、排重。6.室内生测结果表明，11D2-9菌株发酵液对革兰氏阳性细菌有较好的抑制作用；对革兰氏阴性细菌无明显的抑制作用；对苹果炭疽病菌、茄子黄萎病菌、小麦赤霉病菌、烟草赤星病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌的菌丝生长无明显的抑制作用；对小麦白粉病菌的保护和治疗效果分别为69.33%和61.93%。采用活性追踪的方法，从11D2-9发酵液中分离得到1个活性化合物F1。根据MS、1H NMR、13C NMR等波谱数据分析，将其鉴定为白利辛霉素。7.室内生测结果表明，GXWl菌株发酵液对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、植物病原真菌均有一定的抑制作用。采用活性追踪的方法，从GXWl菌株发酵液中分离得到抗菌蛋白条带3-1、3-2，依赖LC-MS/MS技术，将3-1和3-2鉴定为磷酸盐结合蛋白前体。8.采用多相分类法，通过菌株形态特征和培养特征的观察、生理生化指标的测定和16S rDNA序列分析，结果表明，SC11、11D2-9菌株与模式菌株Streptomyces alboflavusNBRC-13196T具有高度的相似性（99%）， GXWl菌株与模式菌株Streptomycesrubiginosohelvolus NBRC12912T的同源相似性也为99%。三株菌株与模式菌株的生理生化指标不完全相同，但大多数指标大体一致。因此建议将菌株SC11、11D2-9和GXWl分别命名为Streptomyces alboflavus SC11、Streptomyces alboflavus11D2-9和Streptomycesrubiginosohelvolus GXWl。
徐小明[10]（2012）在《内毒素结合肽突变体（mEBP9）的聚乙二醇定点修饰及其稳定性和拮抗内毒素效应研究》文中提出革兰氏阴性杆菌外膜的主要成分内毒素（lipopolysaccharide, LPS）是临床上导致全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）和脓毒症（sepsis）的主要原因。目前SIRS或者脓毒症仍然具有较高的发病率和死亡率，现阶段防治革兰氏阴性杆菌引起的SIRS或者脓毒症主要依赖于抗生素控制感染，但对内毒素血症（Endotoxemia）的疗效并不理想。脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein,LBP）具有放大LPS毒性的作用。LBP的氨基端含有特异性LPS结合位点；LBP的第91-108位氨基酸序列是已知的结合LPS能力很强的氨基酸序列（Endotoxin binding peptide，EBP）。在本课题组前期工作中，为增强EBP的拮抗LPS生物活性，通过对EBP的结构进行改建，从11条内毒素结合肽突变体（mutant of EBP，mEBP）中筛选出拮抗LPS作用较强的第9条内毒素结合肽突变体（mEBP9）。鉴于普通多肽在体内容易被降解，生物半衰期较短，而经聚乙二醇修饰的多肽在体内比未经修饰的多肽可能具有较高的稳定性和较好的保护效应；本研究在mEBP9的氨基端或者羧基端引入一个半胱氨酸（mEBP9-SH），通过mEBP9-SH上的巯基加成到mPEG-MAL（甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺）的双键上，实现对mEBP9进行聚乙二醇定点修饰。我们课题组通过生物合成途径已经获得mEBP9、 PEG-NH-mEBP9以及PEG-COOH-mEBP9，观察PEG-NH-mEBP9和PEG-COOH-mEBP9的拮抗LPS活性并筛选出拮抗LPS效应更强的PEG-NH-mEBP9；在此基础上比较PEG-NH-mEBP9与mEBP9的体内外拮抗LPS活性。主要研究结果如下：1. CCK-8法检测结果显示1、5、10、20μmol/L的mEBP9、PEG-NH-mEBP9和PEG-COOH-mEBP9对RAW264.7细胞均无可见的细胞毒性。2. PEG-NH-mEBP9抑制LPS诱导的TAL活化效应明显强于同浓度的PEG-COOH-mEBP9（P＜0.01）；PEG-NH-mEBP9抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6作用优于等浓度的PEG-COOH-mEBP9。3.10μmol/L的PEG-NH-mEBP9或mEBP9在-20℃放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化能力大于在37℃放置30天后的PEG-NH-mEBP9或mEBP9；10μmol/L的mEBP9在-20℃环境放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化能力大于等浓度的PEG-NH-mEBP9；10μmol/L的PEG-NH-mEBP9在37℃环境放置30天后抑制LPS诱导的TAL活化作用明显强于同浓度的mEBP9（P＜0.05）。LPS诱导RAW264.7细胞3h、6h、12h后，5μmol/L的mEBP9抑制RAW264.7细胞分泌TNF-α效应均强于同一时相点同浓度的PEG-NH-mEBP9；LPS刺激RAW264.7细胞24h、36h、48h后，5μmol/L的PEG-NH-mEBP9的抑制RAW264.7细胞分泌TNF-α能力反而都强于同一时相点等浓度的mEBP9。4. PEG-NH-mEBP9与mEBP9体外拮抗LPS生物活性比较：mEBP9抑制LPS诱导的TAL活化效应强于同浓度的PEG-NH-mEBP9；mEBP9抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6作用明显优于等浓度的PEG-NH-mEBP9（P＜0.05）。5. PEG-NH-mEBP9和mEBP9体内拮抗LPS效应比较：（1）提高模型小鼠生存率：“LPS/D-GalN”组48h内全部死亡，“mEBP9+LPS/D-GalN”组和“PEG-NH-mEBP9+LPS/D-GalN”组48h生存率分别为为40%和60%。（2）减少血浆TNF-α和IL-6水平：LPS/D-GalN处理后90min，PEG-NH-mEBP9和mEBP9都可以明显抑制小鼠体内血浆TNF-α/IL-6分泌（P＜0.01），且PEG-NH-mEBP9拮抗LPS的效应显着强于mEBP9（P＜0.05）。（3）减少血清ALT和AST水平：LPS/D-GalN处理后6h，PEG-NH-mEBP9和mEBP9都可以明显抑制小鼠体内血清ALT/AST活性（P＜0.01），且PEG-NH-mEBP9拮抗LPS活性明显强于mEBP9（P＜0.05）。（4）减轻小鼠肝脏病理组织学改变：“LPS/D-GalN”组肝脏有明显的病理学改变，包括肝细胞坏死，充血，肝组织结构的破坏，肝窦内大量的炎症细胞聚集；“LPS/D-GalN+mEBP9”组肝脏组织坏死的区域和坏死程度均降低，而且炎症细胞浸润减少；“LPS/D-GalN+PEG-NH-mEBP9”组肝脏病理组织学改变程度比“LPS/D-GalN+mEBP9”组轻。主要研究结论：PEG-NH-mEBP9拮抗LPS效应优于PEG-COOH-mEBP9；PEG-NH-mEBP9拮抗LPS的生物活性稍逊于mEBP9，而PEG-NH-mEBP9的体外稳定性优于mEBP9；PEG-NH-mEBP9和mEBP9均可保护D-氨基半乳糖增敏的内毒素血症模型小鼠，且PEG-NH-mEBP9对模型小鼠的保护作用优于mEBP9。
二、新型细菌内毒素竞争性受体拮抗剂Lipid A结构类似物的研究现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新型细菌内毒素竞争性受体拮抗剂Lipid A结构类似物的研究现状（论文提纲范文）
（1）壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 阿尔茨海默病概述 |
| 1.2 阿尔茨海默病的发病机制 |
| 1.2.1 Aβ级联假说 |
| 1.2.2 Tau蛋白假说 |
| 1.2.3 胆碱能假说 |
| 1.2.4 氧化应激假说 |
| 1.2.5 微生物感染性假说 |
| 1.2.6 微生物-肠-脑轴假说 |
| 1.3 阿尔茨海默病的治疗现状 |
| 1.3.1 胆碱酯酶抑制剂 |
| 1.3.2 NMDA受体拮抗剂 |
| 1.3.3 靶向Aβ的治疗 |
| 1.3.4 靶向tau蛋白的治疗 |
| 1.3.5 针对神经炎症的治疗 |
| 1.3.6 靶向肠脑轴的治疗 |
| 1.3.7 天然产物在AD治疗上的应用 |
| 1.4 壳寡糖概述 |
| 1.4.1 COS的制备和分离纯化 |
| 1.4.2 COS及其衍生物在神经保护中的潜在应用及机制 |
| 1.4.3 COS的吸收和代谢 |
| 1.5 立题依据和研究思路 |
| 1.5.1 立题依据 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第2章 壳寡糖的血脑屏障透过性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 COS的制备 |
| 2.3.2 微流控芯片的制造与组装 |
| 2.3.3 基于微流控芯片的血脑屏障微系统建立 |
| 2.3.4 Transwell血脑屏障模型构建 |
| 2.3.5 表观渗透率检测 |
| 2.3.6 免疫荧光染色 |
| 2.3.7 体外模型探究COS能否透过血脑屏障 |
| 2.3.8 COS的荧光标记 |
| 2.3.9 动物活体成像验证COS能否透过血脑屏障 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 COS的脱乙酰度 |
| 2.4.2 COS的聚合度分布 |
| 2.4.3 Transwell血脑屏障模型 |
| 2.4.4 微流控芯片血脑屏障模型 |
| 2.4.5 动物活体成像 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第3章 壳寡糖通过影响Aβ聚集减轻其介导的神经毒性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 单一聚合度的壳寡糖的制备 |
| 3.3.2 Aβ42蛋白预处理 |
| 3.3.3 Aβ42样品制备 |
| 3.3.4 COS影响Aβ聚集的体系设置 |
| 3.3.5 ThT荧光实验 |
| 3.3.6 刚果红染色实验 |
| 3.3.7 圆二色光谱实验 |
| 3.3.8 透射电镜观察Aβ的聚集形态 |
| 3.3.9 微量热涌动仪检测COS与Aβ的互作 |
| 3.3.10 分子动力学模拟模型和参数 |
| 3.3.11 细胞培养 |
| 3.3.12 MTT检测细胞活力 |
| 3.3.13 细胞凋亡检测 |
| 3.3.14 氧化应激水平检测 |
| 3.3.15 细胞RNA提取 |
| 3.3.16 实时荧光定量PCR |
| 3.3.17 荧光染色定量分析方法 |
| 3.3.18 数据统计和分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 COS对Aβ42的聚集抑制效果 |
| 3.4.2 COS对Aβ42纤维状聚体的分解作用 |
| 3.4.3 TEM观察COS对Aβ42聚集体形貌的影响 |
| 3.4.4 COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
| 3.4.5 不同DP的COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
| 3.4.6 不同DDA的COS对Aβ42二级结构转化的影响 |
| 3.4.7 COS与Aβ42的相互作用研究 |
| 3.4.8 不同DP的COS与Aβ42的相互作用 |
| 3.4.9 不同DDA的COS与Aβ42的相互作用 |
| 3.4.10 分子动力学模拟探究COS影响Aβ42聚集的分子机制 |
| 3.4.11 COS对Aβ42聚集引起的细胞毒性的影响 |
| 3.4.12 COS对Aβ42诱导产生的小胶质细胞功能紊乱的影响 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 第4章 壳寡糖对AD模型小鼠认知功能的改善及其相关机制探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 实验设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Aβ42寡聚体制备 |
| 4.3.2 AD小鼠模型构建 |
| 4.3.3 Morris水迷宫实验 |
| 4.3.4 旷场实验 |
| 4.3.5 新物体识别实验 |
| 4.3.6 抗生素混合剂处理获得伪无菌小鼠 |
| 4.3.7 粪便菌群移植 |
| 4.3.8 组织样品的采集与储存 |
| 4.3.9 血清中和脑组织匀浆中的炎症因子检测 |
| 4.3.10 免疫组织化学分析 |
| 4.3.11 免疫荧光染色 |
| 4.3.12 免疫荧光染色定量分析方法 |
| 4.3.13 结肠组织的RNA提取 |
| 4.3.14 实时荧光定量PCR |
| 4.3.15 16S rRNA V3和V4区扩增子测序 |
| 4.3.16 生物信息学分析 |
| 4.3.17 非靶代谢组分析 |
| 4.3.18 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 AD小鼠模型构建 |
| 4.4.2 COS对AD小鼠行为学的影响 |
| 4.4.3 COS对AD小鼠脑内反应性胶质细胞增生的影响 |
| 4.4.4 COS对AD小鼠海马区神经元的影响 |
| 4.4.5 COS对AD小鼠突触功能损伤的影响 |
| 4.4.6 COS对AD小鼠肠道屏障完整性的影响 |
| 4.4.7 COS对AD小鼠肠道炎症的影响 |
| 4.4.8 COS对AD小鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 4.4.9 COS对AD小鼠肠道菌群物种组成的影响 |
| 4.4.10 COS对AD小鼠肠道菌群代谢产物的影响 |
| 4.4.11 肠道菌群在COS治疗中的作用 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 研究结论 |
| 5.3 本论文创新点 |
| 5.4 工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）NADPH氧化酶2及右美沙芬在内毒素诱导的病态行为中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、NOX在内毒素诱导的小鼠病态行为中的作用 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验设备及材料 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 病态行为 |
| 1.2.2 旷场实验 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 疾病状态下的行为学的变化 |
| 1.3.2 疾病状态下的情绪变化 |
| 1.3.3 病态行为是一种机体对感染及炎症反应的适应性反应 |
| 1.3.4 病态行为反映的是动机状态 |
| 1.4 小结 |
| 二、NOX2 在内毒素诱导的中枢系统炎症中的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验设备及材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 免疫组化染色 |
| 2.2.2 炎症因子蛋白测定 |
| 2.2.3 炎症因子mRNA |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NOX酶的亚细胞结构分布 |
| 2.3.2 ROS在中枢神经系统细胞中信号传导的作用 |
| 2.3.3 NOX2 在小胶质细胞活化的作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、右美沙芬在内毒素诱导的小鼠病态行为中的作用 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验设备及材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 病态行为 |
| 3.2.2旷场实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 右美沙芬的神经系统保护性作用 |
| 3.3.2 DM的神经系统保护性机制——抑制谷氨酰胺/NMDA及电压门控钙离子通道 |
| 3.3.3 DM的神经系统保护性机制——Sigma-1 受体拮抗剂 |
| 3.4 小结 |
| 四、右美沙芬在内毒素诱导的中枢神经系统炎症中的作用 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验设备及材料 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫组化染色 |
| 4.2.2 炎症因子蛋白测定 |
| 4.2.3 炎症因子mRNA测定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 NOX2 抑制剂与中枢神经系统炎症 |
| 4.3.2 右美沙芬与中枢神经系统炎症反应 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 病态行为的研究进展——从细胞因子,前列腺素以及补体系统向神经元功能展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）放射性核素68Ga标记的示踪剂68Ga-DOTA-TMTP1和68Ga-NOTA-（TMVP1）2在肿瘤靶向分子显像中的研究（论文提纲范文）
| 创新点概述 |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 新型示踪剂~(68)Ga-DOTA-TMTP1的合成及体内外实验研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 新型示踪剂~(68)Ga-NOTA-(TMVP1)_2的基础及临床转化研究 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 放射性核素标记多肽的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录1:攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
（4）高分子量激肽原在宿主应答革兰氏阴性细菌感染中的双重作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 HK在宿主抵抗G~-细菌感染中的作用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1 Kng1基因敲除小鼠的制备与鉴定 |
| 2 HK在G~-细菌感染所致脓毒症中发挥宿主抵抗的保护作用 |
| 3 HK与E.coli细菌特异性结合 |
| 4 HK通过位于轻链第五结构域的DHG15序列与LPS结合,识别G~-细菌并被裂解 |
| 5 G~-细菌感染裂解HK暴露出含DHG15抗原表位的降解片段 |
| 6 DHG15多肽序列与G~-细菌结合并具有杀菌效应 |
| 7 DHG15多肽对哺乳动物细胞具有低毒性 |
| 8 DHG15多肽在体内的抗菌效应 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 HK在LPS诱导的系统性炎症反应中的作用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1 Kng1缺陷缓解致死性内毒素血症小鼠的死亡率 |
| 2 HK缺乏减轻LPS诱导的小鼠系统炎症和肺损伤 |
| 3 HK缺乏显着降低内毒素血症中循环LPS水平 |
| 4 HK缺乏促进LPS的代谢清除 |
| 5 DHG15是HK维持LPS血浆浓度的关键序列 |
| 6 双链HK(Thetwo-chainformofHK,HKa)及轻链(Lightchain,LC)直接解聚LPS |
| 7 HKa/LC与LPS结合后促进LPS生物学活性 |
| 8 识别DHG15序列的单克隆抗体6C9G4缓解LPS诱导的内毒素血症 |
| 9 人与小鼠HKa对LPS具有同等的生物学活性 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 接触系统在脓毒症发病中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的论文发表、专利申请及课题资助 |
| 致谢 |
（5）三个LipidA合成酶基因的克隆、原核表达及B-LPS刺激条件下RAW264.7细胞Casp4的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 布鲁氏菌病的研究概况 |
| 1.1 布鲁氏菌病病原 |
| 1.2 布鲁氏菌病发病机理的研究 |
| 1.3 布鲁氏菌病诊断方法的研究 |
| 1.4 展望 |
| 2 B-LPS的研究 |
| 2.1 B-LPS结构 |
| 2.2 B-LPS的功能 |
| 3 Caspases与细胞凋亡的研究 |
| 3.1 Caspases的发现 |
| 3.2 Caspases家族及分类 |
| 3.3 Caspases结构 |
| 3.4 Caspases的激活及调控 |
| 3.5 caspases的抑制 |
| 4 RNA干扰(RNAi)技术 |
| 4.1 RNAi作用机制 |
| 4.2 RNAi的发现及应用 |
| 4.3 展望 |
| 5 细胞因子 |
| 5.1 肿瘤坏死因子-α研究进展 |
| 5.2 白细胞介素-1β的研究进展 |
| 5.3 展望 |
| 第二章 三个重要LipidA编码基因的克隆、表达及生物信息学分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 菌株、质粒及感受态细胞 |
| 2.2 主要试剂及配制 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 设计引物 |
| 3.2 基因PCR扩增及纯化 |
| 3.3 目的基因的克隆 |
| 3.4 目的基因的原核表达 |
| 3.5 生物信息学分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 PCR扩增结果 |
| 4.2 重组质粒酶切结果 |
| 4.3 测序结果 |
| 4.4 SDS-PAGE结果 |
| 4.5 Western blot鉴定结果 |
| 4.6 生物信息学分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 布鲁氏菌M5-90株基因组的提取 |
| 5.2 PCR技术的应用 |
| 5.3 LipidA生物合成相关基因 |
| 第三章 B-LPS刺激对RAW264.7细胞Casp4表达及IL-1β、TNF-α分泌的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 主要试剂及试剂配制 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 B.melitensis M5-90的培养及B-LPS的提取和银染鉴定 |
| 3.2 RAW264.7细胞的培养及B-LPS刺激 |
| 3.3 Western blot检测Casp4蛋白的表达 |
| 3.4 ELISA检测IL-1β和TNF-α的分泌情况 |
| 3.5 数据分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 银染结果 |
| 4.2 B-LPS刺激RAW264.7细胞的形态变化 |
| 4.3 B-LPS刺激条件下RAW264.7细胞Casp4蛋白的表达 |
| 4.4 B-LPS刺激条件下RAW264.7细胞IL-1β和TNF-α的分泌情况 |
| 5 讨论 |
| 5.1 LPS的提取 |
| 5.2 细胞因子检测方法的选择 |
| 第四章 B-LPS刺激条件下Casp4 knockdown对RAW264.7细胞IL-1β和TNF-α分泌的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 主要试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 转染条件的优化 |
| 3.2 B-LPS刺激条件下siRNA转染RAW264.7细胞 |
| 3.3 数据分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 siRNA转染条件优化结果 |
| 4.2 B-LPS刺激条件下Casp4 knockdown对IL-1β分泌的影响 |
| 4.3 B-LPS刺激条件下Casp4 knockdown对TNF-α分泌的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 刺激条件的选择 |
| 5.2 B-LPS刺激与转染 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）脂氧素对鼠源性巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 中英文缩略词表 第1章 引言 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 主要溶液的配制 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学处理 第3章 结果 |
| 3.1 LPS 对巨噬细胞内 TLR4/NF-κB 信号通路的影响 |
| 3.1.1 LPS 对巨噬细胞内 TLR4 蛋白表达的影响 |
| 3.1.2 LPS 对巨噬细胞内 pNF-κB p65 蛋白表达的影响 |
| 3.2 脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对 LPS 作用巨噬细胞存活的影响 |
| 3.3 脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对 LPS 作用的巨噬细胞内 SOCS2 的影响 |
| 3.4 脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内 TLR4/NF-κB 信号通路及炎症因子分泌的影响 |
| 3.4.1 脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内 TLR4 mRNA 及蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内 TRAF6 mRNA 及蛋白表达的影响 |
| 3.4.3 脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内 pNF-κB p65 蛋白表达的影响 |
| 3.4.4 脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对巨噬细胞内炎症因子分泌的影响 第4章 讨论 |
| 4.1 LPS 对巨噬细胞内 TLR4/NF-κB 信号通路的影响 |
| 4.2 脂氧素及其受体激动剂、拮抗剂对 LPS 作用巨噬细胞存活的影响 |
| 4.3 脂氧素对巨噬细胞内 SOCS2、TLR4/NF-κB 信号通路和炎症细胞因子分泌的影响 第5章 结论 致谢 参考文献 攻读学位期间的研究成果 综述 |
| 参考文献 |
（7）柴胡毒素毒性代谢组学及毒性机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 缩略词表 第一章 前言 |
| 一、 研究背景 |
| （一） 柴胡属主要活性成分 |
| （二） 柴胡属植物毒性成分研究概述 |
| （三） 代谢组学研究概述 |
| 1、 代谢组学有中药毒性研究 |
| 2、 代谢组学的研究策略 |
| （四） 本课题研究思路及内容 |
| 1、选题指导思想 |
| 2、课题研究内容 |
| 3、课题研究创新点 第二章 柴胡毒素急性毒性研究 |
| 一、 研究概述 |
| 二、 实验部分 |
| （一） 仪器与试剂 |
| （二） 柴胡毒素提取分离与结构鉴定 |
| 1、植物来源 |
| 2、提取分离与纯化 |
| 3、柴胡毒素的结构鉴定 |
| （三） 柴胡毒素的急性毒性试验 |
| 1、实验内容 |
| 2、实验材料 |
| 3、实验步骤 |
| （四） 结果与讨论 |
| 1、LD50计算 |
| 2、组织病理学 |
| 三、 结论 第三章 柴胡毒素神经毒性代谢组学研究 |
| 一、 前言 |
| （一） 研究背景 |
| 1、有毒中药毒性研究的现状及瓶颈 |
| 2、代谢组学研究概述 |
| 3、小结 |
| 第一节 柴胡毒素毒性的血液代谢组学研究 |
| 一、 实验部分 |
| （一） 实验材料 |
| 1、动物 |
| 2、试剂 |
| 3、仪器 |
| （二） 血清样品的制备 |
| （三） 蛋白沉淀 |
| （四） LC条件 |
| （五） MS参数 |
| （六） 数据处理 |
| 二、 结果与讨论 |
| （一） 代谢组学研究结果 |
| 1、标志物发现 |
| 2、标志物鉴定 |
| 3、讨论 |
| （二） 小结 |
| 三、 标志物验证 |
| （一） 仪器与材料 |
| （二） 实验部分 |
| 1、色谱条件 |
| 2、质谱条件 |
| 3、标准溶液的配制 |
| 4、动物实验 |
| 5、给药和样品采集 |
| 6、血清样品预处理 |
| 7、测定结果与讨论 |
| 四、 本节小结 |
| 第二节 柴胡毒素毒性的尿液代谢组学研究 |
| 一、 实验部分 |
| （一） 试剂与仪器 |
| 1、试剂 |
| 2、仪器 |
| （二） 实验动物与样品制备 |
| 1、给药和样品采集 |
| 2、代谢组学样品的准备 |
| 3、LC-Q-TOF-MS 条件 |
| 4、数据处理 |
| 二、 结果和讨论 |
| （一） 标志物鉴定 |
| （二） 讨论 |
| 1、肉碱（Carnitine），甲基巴豆酰甘氨酸(tiglylglycine,TG)与脂肪酸 β-氧化 |
| 2、氧化应激 |
| 3、炎症反应 |
| （三） 小结 |
| 本章小结 第四章 TH1/TH2 与神经毒性 |
| 一、 前言 |
| （一） Thl/Th2 分化 |
| （二） Thl/Th2 平衡与疾病 |
| 1、TH1/TH2 平衡，5-羟色胺和犬尿氨酸与神经毒性 |
| 2、TH1/TH2 细胞因子检测方法 |
| 二、 实验部分 |
| （一） 仪器与试剂 |
| 1、仪器 |
| 2、试剂 |
| （二） 实验方法 |
| 1、给药和样品采集 |
| 2、实验操作步骤 |
| 3、统计学分析 |
| （三） 结果 |
| 三、 讨论 第五章 柴胡毒素神经毒性相关受体研究 |
| 一、 前言 |
| （一） GABA受体和NMDA受体 |
| 1、GABA 受体研究进展 |
| 2、NMDA 受体研究简介 |
| 二、 实验部分 |
| （一） 实验材料和方法 |
| 1、动物 |
| 2、试剂 |
| 3、仪器 |
| 4、实验方法 |
| 三、 实验结果 |
| 四、 讨论 总结 参考文献 攻读博士学位期间发表的论文 致谢 |
（8）低副作用的大麻类镇痛药物研究：内源肽类激动剂的鉴定和药物联用新策略（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 大麻系统简介 |
| 1.1.1 大麻受体的发现及其分布 |
| 1.1.2 大麻受体的配体 |
| 1.1.3 大麻配体的生物学功能 |
| 1.2 大麻类镇痛药物的研究进展 |
| 第二章 大麻肽类激动剂介导低副作用的镇痛活性 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 大麻肽类配体的发现 |
| 2.1.2 大麻肽类配的体外功能性活性鉴定 |
| 2.1.3 大麻肽类镇痛作用的研究进展 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 (m)VD-Hpα的镇痛活性及其作用机制 |
| 2.3.2 (m)VD-Hpα的中枢副作用 |
| 2.3.3 (m)VD-Hpα对摄食的调节 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 (m)VD-Hpα的镇痛活性及其作用机制研究 |
| 2.4.2 (m)VD-Hpα中枢副作用研究 |
| 2.4.3 (m)VD-Hpα对摄食的调节作用 |
| 第三章 大麻激动剂与NPVF联合使用介导无耐受的镇痛作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.1.1 NPFF系统简介 |
| 3.1.2 NPFF对大麻系统调节作用的立论依据 |
| 3.1.3 大麻与药物联用介导协同镇痛作用的研究 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NPFF系统对大麻激动剂镇痛作用的调节及其作用机制 |
| 3.3.2 NPVF与WIN55,212-2联用的镇痛活性及中枢副作用 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 NPFF系统对大麻镇痛作用的调节及其作用机制的研究 |
| 3.4.2 NPVF与WIN55,212-2联用的镇痛活性及中枢副作用的研究 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 一、发表的论文 |
| 二、参与申请的专利 |
| 三、参与的课题 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 论文中缩略语索引 |
| 附录Ⅱ 合成的化合物的质谱图 |
（9）几株放线菌发酵液抑菌活性成分的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 微生物资源的开发利用 |
| 1.1.1 微生物资源的特点 |
| 1.1.2 药用微生物资源 |
| 1.1.3 放线菌的研究 |
| 1.1.4 微生物次级代谢产物的研究 |
| 1.2 农用抗生素的研究进展 |
| 1.2.1 国外研究概况 |
| 1.2.2 国内研究概况 |
| 1.2.3 农用抗生素的作用机理 |
| 1.3 抗菌蛋白研究进展 |
| 1.3.1 抗菌蛋白质的分类及其作用机制 |
| 1.3.2 抗菌蛋白质的研究展望 |
| 1.4 肽类化合物研究进展 |
| 1.4.1 肽类抗生素研究进展 |
| 1.4.2 环肽类化合物研究进展 |
| 1.5 论文设计思路 |
| 1.5.1 选题的依据及研究内容 |
| 1.5.2 研究的技术路线 |
| 第二章 Streptomyces alboflavus 313 菌株发酵液抑菌成分的进一步研究 |
| 第一节 前体添加对 Streptomyces alboflavus 313 代谢产物的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 材料与试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌种活化 |
| 2.2.2 单一前体添加试验 |
| 2.2.3 复合前体添加试验 |
| 2.2.4 发酵液抑菌活性测定 |
| 2.2.5 发酵产物处理、检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 单一前体添加试验结果 |
| 2.3.2 复合前体添加试验结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第二节 Streptomyces alboflavus 313 发酵液中抑菌成分的进一步分离鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 材料与试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 摇瓶发酵 |
| 2.2.2 抑菌活性测定 |
| 2.2.3 发酵液中活性成分的分离 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 活性成分的提取分离 |
| 2.3.2 活性化合物的结构鉴定 |
| 2.3.3 活性化合物对细菌的抑制活性 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三节 化合物 NW-G01 对番茄灰霉病菌作用机理的初步研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 材料与试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2. 实验方法 |
| 2.2.1 番茄灰霉病菌的培养 |
| 2.2.2 扫描电镜观察 |
| 2.2.3 菌丝粗提物的制备 |
| 2.2.4 细胞膜相对渗透率的测定 |
| 2.2.5 菌丝还原糖含量的测定 |
| 2.2.6 菌丝壳聚糖含量的测定 |
| 2.2.7 菌丝几丁质酶活性的测定 |
| 2.2.8 菌丝可溶性蛋白含量的测定 |
| 2.2.9 菌丝丙酮酸含量的测定 |
| 2.2.10 统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 扫描电镜观察 |
| 2.3.2 细胞膜相对渗透率 |
| 2.3.3 还原糖含量 |
| 2.3.4 壳聚糖含量 |
| 2.3.5 几丁质酶活性 |
| 2.3.6 可溶性蛋白含量 |
| 2.3.7 丙酮酸含量 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 SC11 菌株发酵液抑菌活性成分的研究 |
| 第一节 SC11 菌株发酵液抑菌活性的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 发酵时间优化 |
| 3.2.2 发酵液稳定性测定 |
| 3.2.3 抑菌活性测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 SC11 菌株发酵时间优化结果 |
| 3.3.2 SC11 发酵液稳定性测定结果 |
| 3.3.3 抑菌离体活性测定结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第二节 SC11 菌株发酵液抑菌活性成分的分离 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 材料与试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 吸附树脂的选择 |
| 3.2.2 动态饱和吸附量 |
| 3.2.3 活性成分的分离 |
| 3.2.4 活性成分的抑菌活性 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 活性成分的提取分离及结构鉴定 |
| 3.3.2 活性化合物的抑菌活性 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第三节 沙漠霉素的早期识别 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 常用材料与试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 样品制备 |
| 3.2.2 RP-HPLC 保留特性 |
| 3.2.3 LC/MS 分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 反相高效液相色潽法——保留时间 |
| 3.3.2 SC11 菌株发酵液中沙漠霉素的液质联用分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 11D2-9 菌株发酵液抑菌活性成分的研究 |
| 第一节 11D2-9 菌株发酵液抑菌活性的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 发酵培养基的筛选 |
| 4.2.2 发酵时间优化 |
| 4.2.3 发酵液稳定性测定 |
| 4.2.4 抑菌活性测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 11D2-9 菌株发酵培养基的筛选结果 |
| 4.3.2 11D2-9 菌株发酵时间优化结果 |
| 4.3.3 11D2-9 菌株发酵液稳定性测定结果 |
| 4.3.4 抑菌离体活性测定结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第二节 11D2-9 菌株发酵液抑菌活性成分的分离 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 材料与试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 吸附树脂的选择 |
| 4.2.2 动态饱和吸附量 |
| 4.2.3 活性成分的分离 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 大孔吸附树脂的选择 |
| 4.3.2 HPD 300 树脂的动态吸附量 |
| 4.3.3 活性成分的提取分离及结构鉴定 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 GXWl 菌株发酵液抑菌活性成分的研究 |
| 第一节 GXWl 菌株发酵液抑菌活性的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试菌株 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 发酵液稳定性测定 |
| 5.2.2 抑菌活性测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 发酵液稳定性测定结果 |
| 5.3.2 抑菌离体活性测定结果 |
| 5.4 小节与讨论 |
| 第二节 GXWl 菌株发酵液抑菌活性成分的分离鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试菌株 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 硫酸铵饱和度的确定 |
| 5.2.2 抗菌粗蛋白的提取 |
| 5.2.3 阴离子交换柱层析 |
| 5.2.4 凝胶柱层析 |
| 5.2.5 SDS-PAGE 电泳 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 硫酸铵饱和度的确定 |
| 5.3.2 阴离子交换柱层析 |
| 5.3.3 凝胶柱层析 |
| 5.3.4 SDS-PAGE 电泳 |
| 5.3.5 LC-MS/MS 分析 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 菌株 SC11、11D2-9 和 GXWl 的分类鉴定 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 供试菌株 |
| 6.1.2 培养基 |
| 6.1.3 常用材料与试剂 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 菌种活化 |
| 6.2.2 发酵培养 |
| 6.2.3 放线菌 16S rDNA 鉴定 |
| 6.2.4 菌株培养特征的观察和生化特性的测定 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 菌株的分子鉴定 |
| 6.3.2 菌株的形态特征 |
| 6.3.3 菌株的培养特征 |
| 6.3.4 菌株的生理生化特征 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 论文发表情况 |
（10）内毒素结合肽突变体（mEBP9）的聚乙二醇定点修饰及其稳定性和拮抗内毒素效应研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 聚乙二醇定点修饰的mEBP9 的构建、筛选及其稳定性实验 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 PEG-NH-mEBP9 拮抗内毒素效应实验 |
| 实验一 PEG-NH-mEBP9 体外拮抗内毒素活性实验 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验二 PEG-NH-mEBP9 体内拮抗内毒素活性实验 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
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| 参考文献 |
| 文献综述 内毒素拮抗措施研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
四、新型细菌内毒素竞争性受体拮抗剂Lipid A结构类似物的研究现状（论文参考文献）
- [1]壳寡糖对阿尔茨海默病的作用效果评价及其机制初探[D]. 朱立猛. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所), 2021(01)
- [2]NADPH氧化酶2及右美沙芬在内毒素诱导的病态行为中的作用研究[D]. 李毅. 天津医科大学, 2019(02)
- [3]放射性核素68Ga标记的示踪剂68Ga-DOTA-TMTP1和68Ga-NOTA-（TMVP1）2在肿瘤靶向分子显像中的研究[D]. 陈曦. 华中科技大学, 2019(01)
- [4]高分子量激肽原在宿主应答革兰氏阴性细菌感染中的双重作用[D]. 阳艾珍. 苏州大学, 2018(12)
- [5]三个LipidA合成酶基因的克隆、原核表达及B-LPS刺激条件下RAW264.7细胞Casp4的表达研究[D]. 贾晓晓. 海南大学, 2015(07)
- [6]脂氧素对鼠源性巨噬细胞内TLR4/NF-κB信号通路的影响及其作用机制[D]. 黄利兴. 南昌大学, 2014(01)
- [7]柴胡毒素毒性代谢组学及毒性机制研究[D]. 张中晓. 第二军医大学, 2014(04)
- [8]低副作用的大麻类镇痛药物研究：内源肽类激动剂的鉴定和药物联用新策略[D]. 韩政岚. 兰州大学, 2014(01)
- [9]几株放线菌发酵液抑菌活性成分的研究[D]. 范丽霞. 西北农林科技大学, 2013(01)
- [10]内毒素结合肽突变体（mEBP9）的聚乙二醇定点修饰及其稳定性和拮抗内毒素效应研究[D]. 徐小明. 第三军医大学, 2012(01)