一、鱼类的性别决定和分化及其研究方法综述（论文文献综述）
戴生飞[1]（2021）在《Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究》文中认为生殖是最基本的生命活动之一,也是物种延续的保障。生殖包括性别决定、性腺分化、配子发生、受精等一系列过程。脊椎动物的性腺主要由体细胞和生殖细胞构成,其中生殖细胞是唯一能将遗传信息传递至下一代的细胞。因此,脊椎动物性别决定可分为体细胞性别决定和生殖细胞性别决定两部分。胚胎发育过程中,性腺体细胞性别由遗传因子（性别决定基因）和环境因子（光照,温度,p H等）共同决定。传统观点认为,性腺中生殖细胞根据其所处的体细胞环境获得相应的性别。然而,青鳉（Oryzias latipes）中对foxl3的研究挑战了这一观点,缺失foxl3的XX青鳉生殖细胞在雌性体细胞环境中进行了精子发生,并产生可育的精子。由此提出生殖细胞中存在自主的性别决定机制。然而,尚未解决的重要问题是,缺失foxl3后生殖细胞中的哪些关键基因起始了雌性环境中的精子发生过程?在雌性生殖细胞中与foxl3相拮抗的雄性命运决定基因是什么?已有的研究表明,脊椎动物性腺中保守的转录因子dmrt1和foxl2相互拮抗并分别维持雌雄性别分化和性腺发育过程。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中结果表明,敲降dmrt1会导致雄性性腺体细胞雌性化和生殖细胞缺失。敲除foxl2或过表达其显复性突变体导致完全的由雌向雄的性逆转。foxl3是foxl2的一个古老的旁系同源基因,罗非鱼foxl3的功能研究尚未见报道。罗非鱼生殖细胞中相互拮抗的雌雄基因是什么?这个问题还有待进一步的研究。本研究通过转录组测序、蛋白免疫印记（Western blot,WB）、荧光原位杂交（FISH）等方法分析了dmrt1和foxl3在尼罗罗非鱼性腺的表达模式和细胞定位。运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建了dmrt1和foxl3单基因突变体,并通过双杂合突变体进一步繁殖获得dmrt1;foxl3双纯合突变体。采用组织学染色（HE）、荧光免疫组化（IF）、荧光原位杂交、real-time PCR等方法,分析了各突变体性腺表型和基因表达情况,并尝试使用外源雌激素（17β-estradiol,E2）和芳香化酶抑制剂（Fadrozole）对突变鱼进行表型回救。最后,利用启动子分析、凝胶迁移（EMSA）和染色质免疫共沉淀（ChIP）等体外实验探究了dmrt1和foxl3之间的相互调控关系。并通过在dmrt1和foxl3突变体中敲降体细胞特异的foxl2,探究了生殖细胞基因和体细胞基因间的上下位关系。具体结果如下:1、尼罗罗非鱼foxl3细胞定位和功能研究。性腺转录组测序结果表明,foxl3在孵化后30天（days after hatching,dah）XX罗非鱼卵巢中表达最高,而不在精巢中表达。荧光原位杂交和生殖细胞标记Vasa共定位结果显示,foxl3 m RNA主要定位于卵巢卵原细胞中,精巢组织中检测不到foxl3的表达。通过CRISPR/Cas9成功突变尼罗罗非鱼foxl3并获得缺失5bp和7bp的两种纯合突变体。组织学检测发现,120 dah天foxl3突变XY鱼精巢发育正常。而foxl3突变XX鱼性腺外形仍像正常卵巢,且存在卵巢的特征结构卵巢腔;但与对照XX鱼不同,foxl3突变XX性腺中不存在卵母细胞而是含有各级生精细胞。这表明foxl3突变导致XX性腺中生殖细胞起始了精子发生。荧光原位杂交和荧光免疫组化结果显示,foxl3突变XX性腺中存在精子细胞（表达Sox30）,而不存在卵母细胞（不表达bmp15和42Sp50）。荧光免疫组化结果显示,突变性腺体细胞中表达雌激素合成的关键酶Cyp19a1a,而不表达雄激素合成酶Cyp11c1。血清激素测定结果表明,foxl3突变XX鱼血清雌激素水平与对照XX雌鱼相比显着降低,但仍然显着高于对照XY雄鱼。与对照XX雌鱼一致,foxl3突变XX鱼血清雄激素（11-ketotestosterone,11-KT）水平很低。表明foxl3突变XX性腺中生殖细胞在雌性化的体细胞环境中进行了精子发生。Real-time PCR结果证实了foxl3突变性腺中体细胞的雌性化环境和生殖细胞中进行的精子发生。值得注意的是,雄性特异基因dmrt1在foxl3突变XX性腺中有显着的升高。另一方面,foxl3的突变不影响XY鱼性腺精子发生过程和育性。2、尼罗罗非鱼dmrt1的表达模式和功能研究。90 dah时,荧光原位杂交结果显示,罗非鱼dmrt1 m RNA定位于精巢中精原细胞、初级精母细胞和支持细胞（Sertoli cell）中,卵巢中没有检测到dmrt1的表达。利用设计的高效CRISPR/Cas9g RNA靶点成功在1号外显子突变尼罗罗非鱼dmrt1,获得缺失2 bp和5 bp的两种纯合突变体。60 dah时组织学检测发现,所有dmrt1突变XY鱼发生了由雄向雌的性逆转,其性腺发育为卵巢。免疫荧光结果表明,dmrt1纯合突变XY鱼性腺中表达雌激素合成酶Cyp19a1a,不表达雄激素合成酶Cyp11c1。成年期dmrt1突变鱼卵子发生正常,性腺中存在有卵黄的卵母细胞。性别决定关键时期4 dah时,免疫荧光结果显示,罗非鱼性别决定基因amhy的表达在XY dmrt1突变性腺不受影响,而另一个重要的dmrt1下游雄性通路基因Gsdf不表达,表明dmrt1突变鱼发生了原发性逆转。孵化后15天时,dmrt1突变XY性腺中可检测到Cyp19a1a的表达。这些结果证实在雄性通路中,dmrt1位于amhy和gsdf之间,也就是说,尼罗罗非鱼雄性通路由amhy-dmrt1-gsdf构成。3、尼罗罗非鱼dmrt1;foxl3双基因突变系的建立及表型分析。利用dmrt1杂合突变XY鱼和foxl3杂合突变XX鱼繁殖获得dmrt1;foxl3双杂合突变XX和XY后代。进一步通过双杂合突变鱼繁殖获得dmrt1;foxl3双纯合突变后代。60 dah时组织学观察发现,dmrt1;foxl3双突变XX鱼性腺生殖细胞发育为卵母细胞,表明dmrt1的缺失回救了XX foxl3突变体生殖细胞性逆转的表型。另一方面,dmrt1;foxl3双突变XY鱼性腺发育为精卵巢,性腺中除卵母细胞外,还存在精母细胞,表明突变foxl3部分回救了XY dmrt1突变体生殖细胞的表型。荧光免疫组化结果显示,双突变性腺中有明显的Cyp19a1a表达。双突变XX/XY鱼血清雌激素水平和对照XX鱼接近。这些结果提示,dmrt1和foxl3在生殖细胞性别命运决定过程中存在相互拮抗的作用。4、尼罗罗非鱼Dmrt1和Foxl3相互调控影响生殖细胞可塑性。Dmrt1和Foxl3双突变鱼生殖细胞性别的相互回救促使我们进一步检测dmrt1在foxl3突变XX性腺中的表达和foxl3在dmrt1突变XY性腺中的表达。RT-PCR、real-time PCR和Western blot结果证实foxl3突变XX性腺中dmrt1在m RNA和蛋白水平显着升高。荧光原位杂交结果显示,dmrt1主要定位于foxl3突变XX性腺中生殖细胞,而不在对照XX卵巢中表达。另一方面,real-time PCR结果显示,dmrt1突变XY性腺中foxl3表达量显着升高。荧光原位杂交结果表明,30 dah时dmrt1突变XY性腺中生殖细胞表达foxl3,而对照XY性腺生殖细胞中不表达foxl3。进一步的调控实验证实,在HEK293细胞中,Dmrt1和Foxl3分别以剂量依赖的方式下调foxl3和dmrt1的启动子活性。删除或突变相应的启动子上结合位点,可以去除两者之间的抑制效果。凝胶迁移和染色质免疫共沉淀实验分析表明,Dmrt1和Foxl3可以在体外直接结合foxl3和dmrt1启动子上相应的结合位点。这些结果表明,Dmrt1和Foxl3通过直接结合对方启动子发挥转录抑制作用。利用外源雌激素处理对foxl3突变鱼进行回救。结果显示,E2处理1个月后foxl3杂合突变XY鱼性腺发育为卵巢,而foxl3突变XX鱼性腺中生殖细胞仍进行精子发生,不能诱导卵母细胞产生。表明foxl3是生殖细胞中雌激素下调dmrt1诱导卵母细胞发育所必须的关键基因。采用芳香化酶抑制剂（Fadrozole,aromatase inhibitor,AI）回救dmrt1突变鱼。结果显示,同批处理的dmrt1杂合突变XX鱼发生性逆转,而处理的dmrt1突变XX/XY鱼性腺仍发育为卵巢。Real-time PCR结果显示,AI处理后dmrt1突变性腺中foxl3表达水平与对照雌鱼接近。这些结果表明,AI诱导的由雌向雄的性逆转依赖于dmrt1的存在。突变foxl3或dmrt1后导致的性逆转不能被雌激素或芳香化酶抑制剂回救,表明生殖细胞的可塑性依赖于这两个基因的存在。不同的是,双突变dmrt1;foxl3后再使用AI处理,双突变XX/XY鱼性腺发育为精巢,性腺中不存在卵母细胞。表明突变foxl3后再抑制雌激素合成,能够回救Dmrt1缺失造成的性逆转。此外,AI处理foxl3突变XX鱼后,其性腺发育为正常精巢。前期研究结果表明,敲降或敲除foxl2会导致XX罗非鱼发生性逆转。AI处理的dmrt1突变性腺仍发育为卵巢,这可能是由于foxl2不能被有效抑制所致。在dmrt1突变鱼中敲降foxl2后,dmrt1;foxl2双突变XX/XY性腺发育为精巢,但生殖细胞数目显着减少,且不能起始精子发生。表明dmrt1对于生殖细胞的存活和精子发生的起始是必需的。综上所述,尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3分别表达于精巢和卵巢组织中,体外实验证实二者间存在直接的转录抑制。突变dmrt1或foxl3分别导致由雄向雌和生殖细胞由雌向雄的性逆转。双突变体表型分析证实,dmrrt1和foxl3在尼罗罗非鱼生殖细胞性别命运决定过程中起着相互拮抗的作用。外源雌激素和芳香化酶抑制剂回救实验表明,罗非鱼生殖细胞的可塑性依赖于这两个基因的存在。敲降foxl2后,foxl3和dmrt1单突变性腺都发育为精巢,但缺失dmrt1导致精子发生不能正常起始。本研究解析了尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3在雌雄性别分化和生殖细胞性别命运决定过程中的关键功能,揭示了dmrrt1和foxl3通过直接的转录抑制作用相互拮抗,决定生殖细胞性别的分子机制,丰富了我们对脊椎动物性别分化和生殖细胞性别决定的认识。
汪淳[2]（2020）在《弓背青鳉三个地理群体表型比较与性别决定基因初探》文中研究说明青鳉属（Oryzias）是一类广泛分布于亚洲东部、东南部中南半岛及印度尼西亚群岛的小型鱼类,具有体型小、产卵多、繁殖周期短等特点,同时由于其易观察受精过程、胚胎发育快、对水质敏感等优点,因而被大量应用于发育生物学、毒理学等领域。弓背青鳉（O.curvinotus）因其背部从外观看呈隆起的弓状而得名,是一种可生活于广温广盐,热带与亚热带,无洄游性的河口上层小型鱼类,团队近期利用分子标记揭示出弓背青鳉群体间存在明晰的遗传距离。本研究以三亚（SY）、高桥（GQ）、饶平（RP）三个不同地理群体的弓背青鳉为研究对象,优化了弓背青鳉孵化和早期繁养方法,测定了三个不同地理群体弓背青鳉的形态学数据,分析了弓背青鳉三亚群体雌雄性腺转录组,并探究了养殖温度对不同地理种群弓背青鳉生长发育的影响,为弓背青鳉的繁殖和资源保护提供了理论指导。相关主要结果如下:一、本实验所用弓背青鳉分别采自三亚、高桥、饶平,记录各采样点平均水温、盐度等相关参数,结果显示三亚群体年平均水温27.5℃显着高于高桥和饶平。分别以三个群体的样本作为亲本,优化弓背青鳉室内孵化和早期繁养方法。饶平、高桥、三亚三个群体平均产卵量分别为23.88、22.34和24.64;三个群体孵化率分别为87.04%、86.33%和91.08%;三个群体生存率分别为71.20%、81.36%、88.52%。使用弓背青鳉性别特异性引物Ocsex-F和Ocsex-R进行三个群体的性别鉴定,结果表明在高桥和饶平两个群体中遗传雄性弓背青鳉中扩增出长度分别为959bp和656bp两条清晰的DNA条带,在雌性个体中仅扩增出959 bp的单一条带;而在三亚群体中遗传雄性和遗传雌性均只能扩增出959 bp的单一条带。二、对弓背青鳉三亚、高桥、饶平等3个群体共计131尾进行形态学差异比较。测量弓背青鳉囊胚期鱼卵,发现3个群体间横径、竖径均存在P<0.001的显着性差异,卵径大小的横径、竖径均存在RP>GQ>SY的结果。本研究对共计131尾弓背青鳉三个群体的可数性状和可量性状进行了多元统计分析:3个群体的弓背青鳉在体长/最长背鳍条这一指标上均出现明显的雌雄分化。对5个可数性状和13个体长/可量性状平均值进行聚类分析表明饶平和高桥群体在外部形态上更为相似。主成分分析前三项贡献率分别为68.14%、8.35%和6.41%,累计贡献率为82.70%。多元统计显示饶平和三亚群体的差异较大,高桥和饶平群体的差异较小。通过计算各项指标的变异系数可知,三个群体的形态差异是种内不同地理种群的差异,这种差异还达不到亚种水平。三、对弓背青鳉三亚群体雌雄性腺转录组分析后,我们随机挑选了21个差异表达基因进行q RT-PCR验证,结果表明,差异表达量存在一定差异,表达量差异的总体趋势呈现一致。dmy基因（DM domain gene on Y chromosome）是弓背青鳉的性别决定基因,但在三亚群体雄性性腺转录组文库中未能调取dmy基因,与实验室已有的其他群体雄性性腺转录组可调取dmy基因的结果不一致。这一研究结果为进一步探究弓背青鳉性别决定基因和探究弓背青鳉性别决定及性别分化都具有重要意义。四、对饶平、高桥、三亚3个地理群体不同温度下的弓背青鳉的出膜时间进行统计。在22～30℃范围内,同一群体的出膜时间随着温度的升高逐渐减少。相同温度下,弓背青鳉的大量出膜时间在3个群体中存在差异,分别为SY>GQ>RP。3个群体的弓背青鳉出膜仔鱼分别在22℃、26℃和30℃恒温下进行养殖发现:在22℃下,三亚和高桥群体出膜10d后大量死亡,极少数（3～5%）可继续生长,饶平群体10d后可生长,但生长速率缓慢;在恒温26℃和30℃下三个群体均可正常生长,且生长速率呈现RP>GQ>SY的趋势。
冉本会[3]（2020）在《亲代双酚A暴露对稀有鮈鲫子代胚胎发育及性腺分化的影响》文中进行了进一步梳理双酚A（Bisphenol A,BPA）是一种内分泌干扰物,广泛存在于水环境中。前期研究发现,BPA处理亲代稀有鮈鲫后会导致子代雄性性别比例上调,而将亲代清水恢复后,其子代雄性依然有雄性化趋势,然而其作用机理尚不明确。本研究以稀有鮈鲫为试验模型,用15μg/L BPA暴露3月龄稀有鮈鲫60天,人工繁殖获得子代（记为NR:Non-Recovery）;再将BPA暴露后的亲鱼置入清水中恢复45天后,人工繁殖获得子代（记为R:Recovery）。通过统计子代胚胎发育相关指标,评估亲代BPA暴露对子代胚胎发育的影响;统计子代性别比例并分析性腺发育状况,探究亲代BPA暴露对子代性腺发育和分化的影响;检测子代性类固醇激素和VTG水平,研究亲代BPA暴露对子代性激素及VTG合成的影响;通过对NR子代转录组测序,探究亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫性腺发育和分化产生影响的分子机制;q RT-PCR检测R子代中调控生殖功能相关基因,探究亲代清水恢复后BPA对子代性腺发育和分化的分子机制。通过对NR子代和R子代的研究,比较亲代清水恢复前后,BPA对子代胚胎发育和性腺分化的影响能否通过亲代清水恢复被减弱或消除。研究主要结果如下:1.亲代经15μg/L BPA暴露后,其产卵量和卵径、受精率和胚胎孵化率均显着降低,且孵化延迟,而自主运动、胚胎心率、畸形率和死亡率均显着升高,表明亲代BPA处理能抑制胚胎发育。BPA暴露后的亲鱼经清水恢复45天后,BPA对子代胚胎发育的抑制效应明显减弱。2.亲代经BPA暴露后,子代的生长发育加快,而这种作用随着发育逐渐减弱;NR子代卵巢重及性腺指数均显着增加,卵母细胞总数目减少;BPA对子代精巢发育影响不明显,但使其精子质量降低;亲代BPA暴露使子代雄性性别比例上调,表明BPA可通过亲代暴露影响子代性别分化。3.亲代经BPA暴露后,子代性腺和血清中T和11-KT水平升高,而E2和VTG水平无显着性变化,表明亲代BPA暴露使子代性类固醇激素合成紊乱。亲鱼经清水恢复后,这种效应减弱。4.转录组结果表明,亲代BPA暴露可通过影响子代精子发生、性激素合成、细胞周期及卵巢发育过程相关基因的表达影响其性腺分化和发育过程。BPA主要促进雌性和雄性精子发生及调控T及11-KT合成相关基因的表达,同时使卵巢发育过程相关基因的m RNA表达被抑制。5.亲代清水恢复后,BPA仍能通过影响R子代性腺中性腺发育和分化过程相关基因、类固醇合成相关基因及性激素受体相关基因esrs和ar的表达影响子代性腺分化和发育。综上所述,本研究发现亲代BPA暴露能抑制子代胚胎发育并干扰子代性腺发育和分化,导致雄性性别比例上调;亲代经清水恢复后,BPA对子代的不良影响减弱。此外,我们发现亲代BPA暴露可能通过影响子代精子发生、性激素合成、卵巢发育及细胞周期过程相关基因的表达影响其性腺分化和发育过程,此外BPA还可以通过干扰稀有鮈鲫性类固醇合成酶基因的表达影响性类固醇的合成。这些基因和性激素的共同作用可能导致子代雄性化。
肖河生[4]（2020）在《胆固醇侧链裂解酶Cyp11a1在尼罗罗非鱼中的表达及功能研究》文中提出类固醇激素包括皮质激素和性类固醇激素,是脊椎动物重要的内分泌调节因子。cyp11a1编码的胆固醇侧链裂解酶催化所有类固醇激素共同前体孕烯醇酮的合成,对脊椎动物类固醇激素的合成至关重要。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的基因组序列已经公开,具有单性鱼苗,个体较大,便于取血,且能通过基因编辑进行缺失功能研究,是研究鱼类内分泌的良好模型。本研究分离了尼罗罗非鱼及其它脊椎动物的cyp11a1基因,分析了cyp11a1在尼罗罗非鱼成鱼各组织及性腺发育各时期的表达模式和细胞类型,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立罗非鱼cyp11a1突变系,并借助cyp11a1突变模型对皮质激素和性类固醇激素在罗非鱼个体存活和性别分化及配子发生中的作用进行了探讨。具体研究结果如下:1)尼罗罗非鱼及其它脊椎动物cyp11a1基因的分离。从尼罗罗非鱼基因组中分离了cyp11a1基因,并以罗非鱼cyp11a1的ORF序列为检索序列,通过blastn从NCBI中分离了人、鸡、中华软骨龟、爪蟾、腔棘鱼、斑点雀鳝、东方鲀、青鳉和斑马鱼等脊椎动物的cyp11a1基因。结果表明,除斑马鱼外,其它脊椎动物均只有1个cyp11a1基因。共线性分析表明,斑马鱼的2个cyp11a基因产生于串接复制而非真骨鱼特有的全基因组复制。2)cyp11a1在尼罗罗非鱼中的表达。转录组分析及Real-time PCR结果显示cyp11a1主要在成体尼罗罗非鱼精巢、卵巢和头肾组织表达。cyp11a1在孵化后5、7、20、30、40天卵巢的表达水平高于精巢,而在孵化后90、180和300天精巢的表达水平高于卵巢。原位杂交结果显示cyp11a1表达于尼罗罗非鱼精巢Leydig细胞、卵巢鞘膜细胞和间质细胞以及头肾肾间细胞中。3)尼罗罗非鱼cyp11a1纯合突变系的建立。通过CRISPR/Cas9成功突变罗非鱼cyp11a1并建立纯合突变系。分析发现,cyp11a1纯合突变鱼血清皮质醇含量显着降低,胆固醇含量显着升高。Real-time PCR结果显示,突变鱼垂体中促肾上腺皮质激素合成酶基因pomca的表达显着升高。突变鱼的头肾明显大于对照鱼头肾,且头肾肾间细胞胞质增生。这些结果表明,cyp11a1突变鱼头肾无法正常合成皮质醇。此外,分析发现纯合突变鱼可以存活但抗低氧能力显着下降。这些结果表明,皮质激素对于罗非鱼的压力应激很重要但对于存活不是必需的。4)cyp11a1纯合突变鱼性腺表型及基因表达分析。采用组织学检测孵化后90天、180天cyp11a1突变XX罗非鱼性腺发现,突变鱼性腺表现为精巢样结构,存在生精细胞。表明cyp11a1突变导致XX罗非鱼发生了由雌向雄的性逆转。对孵化后30天的XX突变鱼性腺进行分析发现,性腺中存在退化的卵母细胞,这表明生殖细胞早期仍然发育为卵母细胞,但无法维持。Real-time PCR结果表明,在孵化后90天突变XX鱼性腺中,雌性特异表达基因foxl2和雌激素合成酶基因cyp19a1a的表达显着降低,雄性特异表达基因dmrt1和雄激素合成酶基因cyp11c1的表达显着升高。与此一致的是,与对照雌鱼相比,突变鱼血清中E2水平显着降低。添加外源E2可以回救XX突变鱼的性逆转表型,回救的XX突变鱼性腺发育为卵巢,表明雌激素对于罗非鱼雌鱼卵巢分化至关重要。对孵化后90天和180天cyp11a1突变XY雄鱼进行分析发现,突变鱼血清11-KT和T的水平极低,突变鱼性腺具有精巢形态,但精子发生几乎无法进行。添加cyp11a1直接下游产物孕烯醇酮可以升高突变鱼血清中11-KT和T的水平,精子发生恢复。值得注意的是,无论是在cyp11a1突变XX鱼还是在突变XY鱼中,仍会有少量的精子细胞产生。这些结果表明类固醇激素对于精子发生的进行十分重要但并非必不可少。综上所述,脊椎动物除了斑马鱼均只有一个cyp11a1基因。cyp11a1在尼罗罗非鱼中呈现性二态性表达,主要表达于精巢Leydig细胞、卵巢鞘膜细胞和间质细胞以及头肾肾间细胞中。对cyp11a1突变鱼进行分析发现,皮质激素对于罗非鱼的压力应激很重要但对于个体存活不是必需的;雌激素对于罗非鱼雌鱼卵巢分化很重要;雄激素对于精子发生很重要但并非必不可少。本研究为今后深入分析皮质激素的生理意义及雌雄激素在鱼类性别分化和配子发生中的作用奠定了基础。
王晓双[5]（2020）在《ATF/CREB家族生物信息学分析及creb1在尼罗罗非鱼配子发生中的功能研究》文中提出转录因子ATF/CREB（Activating transcription factor/cAMP response element binding protein）家族是一大类碱性亮氨酸拉链（Basic leucine zipper,bZIP）蛋白,参与多种细胞生命活动,包括细胞存活、增殖、分化、凋亡等过程。基因复制是产生基因组复杂性的关键,而全基因组复制为进化适应和创新提供了大量的原材料。研究表明,真核生物中bZIP蛋白的多样化与多细胞生物的进化有关。近年来,ATF/CREB家族的全基因组鉴定工作在一定程度上已经在植物及少数几种哺乳动物（如人和小鼠）中开展。然而,该家族在大多数动物类群中的全基因组鉴定工作,特别是在鱼类,却鲜有报道。ATF/CREB家族在动物界的起源、演化过程不清楚,其家族扩张与在脊椎动物发生的四次全基因组复制的联系有待研究。ATF/CREB整个家族的表达模式也未见报道。Creb1作为ATF/CREB家族的一员可能参与了哺乳动物的卵子发生和精子发生。在四足动物中只有一个Creb1,而在真骨鱼中保留了两个拷贝,creb1a和creb1b。已有研究表明,creb1a和creb1b分别在罗非鱼的卵巢和精巢中高表达。由于没有直接敲除Creb1的证据,其在配子发生中的具体作用仍不清楚。本研究分离鉴定了不同动物类群,共22种代表性动物的ATF/CREB家族成员,全面系统的分析了该家族在动物界的起源与演化,包括全基因组鉴定、基因定位、系统发育和共线性分析。此外,基于尼罗罗非鱼成体八个不同组织以及雌雄性腺发育的四个关键时期的转录组,分析了ATF/CREB整个家族在尼罗罗非鱼的表达模式。此外,以尼罗罗非鱼为研究对象,制备了Creb1b多克隆抗体,通过CRISPR/Cas9技术分别对creb1a和creb1b进行突变,分析其在卵子发生和精子发生中的具体作用。主要研究结果如下:1)ATF/CREB家族的起源与演化。本研究分离鉴定了22种代表性动物的ATF/CREB家族成员。在原始的多细胞动物中（如海绵动物、水母、丝盘虫和线虫）,分离出了1-3个ATF/CREB成员;在环节动物、软体动物、节肢动物、原索动物和无颌脊椎动物中,分离到4-6个ATF/CREB成员;而在有颌脊椎动物,经历了第二轮全基因组复制（2R）的象鲨、腔棘鱼、斑点雀鳝和四足动物中,该家族成员的数量增加到12-14个;在经历了第三轮全基因组复制（3R）的真骨鱼中,ATF/CREB成员的数量增加到18-21个,而在鲤鱼这种经历了第四轮全基因组复制（4R）的物种中,ATF/CREB家族的扩张更为明显,总共分离到了30个ATF/CREB家族成员。系统进化分析表明该家族可能起源于原始的多细胞生物,伴随着全基因组复制,该家族在脊椎动物中发生了显着的扩张,大量的复制基因在真骨鱼中保留了下来。其中,atf6的复制起源于2R,而creb1、crem、jdp2、creb5、atf4、atf5和atf7的拷贝则是3R的产物。共线性分析表明,紧密排列的基因簇jdp2-batf和atf7-atf1分别在脊椎动物和辐鳍鱼类是高度保守的。2)ATF/CREB家族的表达模式分析。基于成体尼罗罗非鱼8个组织的转录组数据分析,在尼罗罗非鱼基因组中鉴定的21个ATF/CREB家族中的大多数成员在多个组织中都有表达,有12个、11个、9个、9个、7个、5个、5个和4个成员分别表达于精巢、头肾、脑、心脏、肝脏、卵巢、肾脏和肌肉。对尼罗罗非鱼雌雄性腺发育的四个关键时期（5、30、90和180 dah）（Days after hatching,dah）转录组数据分析发现,有19个成员在性腺中有表达,其中在5 dah时,creb1a、creb1b、jdp2b和atf5a呈现性二态表达;在90和180 dah时,creb1a、jdp2b、atf4b和atf5b在卵巢中高表达,而creb1b、creb5a、crema、cremb、atf1、atf4a和atf7a在精巢中高表达。这表明ATF/CREBs可能在性腺发育过程中具有重要功能。原位杂交验证了起源于3R的4对复制基因（creb1a、creb1b、crema、cremb、atf4a、atf4b、jdp2a和jdp2b）的表达,其结果与转录组一致。creb1a、creb1b和atf4a、atf4b在性腺中的表达发生了分化,creb1a和atf4a主要在卵巢I期和II期卵母细胞中表达,而creb1b和atf4b主要表达于精母细胞,这表明复制基因在进化过程中有可能发生了亚功能化。此外,免疫组织化学分析显示,Creb1b特异表达于精巢的初级和次级精母细胞,与原位杂交结果一致,表明Creb1b可以作为精母细胞的标记物。3)creb1a和creb1b对配子发生的影响。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别对尼罗罗非鱼creb1a和creb1b进行突变,现已分别获得cerb1a F0代突变鱼和creb1b纯合突变鱼。基因敲除的靶位点分别位于creb1a的第3个和creb1b的第2个外显子上,选择靠近原型间隔基序（Protospacer adjacent motif,PAM）区的限制性内切酶BsaJI和Nci I分别筛选creb1a和creb1b的F0代阳性突变鱼。用creb1b的F0代突变雄鱼与野生型雌鱼交配、酶切筛选、亚克隆测序获得F1代杂合突变鱼,选择删除5bp的杂合突变雌鱼和杂合突变雄鱼交配得到creb1b纯合突变鱼。性腺组织学分析显示,creb1a突变雌鱼卵母细胞退化,体细胞增多,而突变雄鱼精巢无明显表型。creb1b纯合突变雄鱼在90 dah时精巢出现空洞,精母细胞减少,后期精子发生正常,可育;纯合突变雌鱼卵母细胞退化,体细胞增多,Cyp19a1a的表达下调。结果表明creb1a参与了卵母细胞的发育,而creb1b同时在后期卵母细胞的发育和早期精子发生中起作用,但其他相似的蛋白可以补偿它在精子发生中的功能,使精子发生正常。综上所述,ATF/CREB家族可能起源于原始的多细胞动物,在经历了四轮全基因组复制以后该家族发生了显着的扩张。对整个家族表达模式的分析表明ATF/CREB家族大多数成员在多个组织中都有表达,一些成员在性腺中呈现差异表达。我们分别获得了creb1a和creb1b的突变鱼,发现creb1a只在卵子发生中起作用,而creb1b同时参与卵子发生和精子发生。本研究丰富了对ATF/CREB家族进化和表达的认知,为了解其潜在的功能,特别是在性腺发育和配子发生中的作用提供了新视角,对creb1的功能研究揭示了其在硬骨鱼类配子发生中的重要作用。
郑树清[6]（2020）在《基于全基因组测序的南方鲇性别连锁分子标记开发和性别决定候选基因鉴定》文中提出南方鲇（Silurus meridionalis Chen）又名大口鲇,隶属于鲇形目（Siluriformes）、鲇科（Siluridae）、鲇属（Silurus）,是一种广布于我国长江流域的重要经济鱼类,也是近年来开发的名特优养殖新品种。具有个体大、肉质好、生长快、抗病力强、经济价值高等特点。常见个体2-5 kg,最大个体达50 kg。雄鱼一般2-4年性成熟,雌鱼3-5年性成熟。南方鲇的生长速度和个体大小具有明显的性别二态性,雌鱼比雄鱼长得快,因此,水产上全雌化养殖能显着提高经济效益。但是南方鲇的基础研究相对薄弱,且缺乏基因组信息,为优良品种选育和性控育种带来了极大的困难。本研究中,我们首先通过将XY的正常个体与性逆转个体交配获得了YY超雄南方鲇,从而为研究鱼类性别决定提供了一个良好的模型。在此基础上,综合利用Illumina、Nanopore、Bionano和Hi-C等技术,测序组装获得高质量XX、XY和YY南方鲇个体全基因组序列,结合雌雄混合池的重测序,确定性别决定区间、筛选性别连锁分子标记、鉴定性别决定候选基因,为在基因组水平上解析南方鲇经济性状的遗传基础、开展全基因组选择育种和性控育种奠定基础。主要研究工作及结果如下。1、南方鲇染色体水平的基因组图谱构建。首先利用二代测序技术对南方鲇基因组大小和杂合度进行估测。测序得到的49.5 Gb高质量XX Illumina序列,经k-mer分析得出南方鲇XX个体基因组大小为712.42Mb,杂合度为0.49%,GC含量为39%。利用Nanopore三代测序平台,XX、XY和YY分别获得81.3 Gb,80.3 Gb和85.7 Gb的原始数据,质控之后分别为69.7 Gb,69.2 Gb和77.1 Gb,基因组覆盖度约为100×,测序平均读长分别为24.29 kb,24.15 kb和24.67 kb。经组装和纠错之后,获得基因组大小分别为741.2 Mb,727.2 Mb和750.0 Mb,contig N50分别为13.19 Mb,13.81 Mb和15.96 Mb。然后利用116.4 Gb XX、174.9 Gb XY的Bionano测序数据和80.6 Gb XX、80.4 Gb XY的Hi-C测序数据将XX、XY和YY的contig挂载到29条染色体上,分别获得738.9 Mb,723.9 Mb和739.1 Mb的染色体水平基因组,挂载率分别为99.5%、99.3%和98.54%,得到的scaffold N50长度分别为28.04 Mb,28.08 Mb和27.22 Mb。BUSCO评估结果分别为92.0%,90.7%和92.3%,说明具有较高的完整性。对XX基因组进行注释,得到40.12%的重复序列。整合从头注释、同源预测和转录组预测三种方法共预测到22,965个蛋白质编码基因,平均基因长度16,897 bp,平均基因编码区长度1,689 bp。其中,22,519个基因（98.06%）能在蛋白数据库中找到对应的功能注释。BUSCO评估基因完整性约93.1%。这些结果表明基因组组装和注释具有较好的完整性和准确性。2、南方鲇性染色体及性别决定区间的定位。利用XY性逆转雌鱼与XY雄鱼交配产生的后代中41条雌鱼构建雌鱼混合池,110条雄鱼构建雄鱼混合池,并对雌雄混合池进行建库和重测序,原始数据过滤和质控之后,分别获得342,503,436和270,953,302条reads共51.2 Gb和38.7 Gb的有效数据,比对到南方鲇XX参考基因组上,比对率分别为95.90%和98.96%,覆盖深度分别为58.94x和46.06x。对比对结果进行性别相关的SNP挖掘,经条件过滤后雌雄混合池分别剩余2,421,301和2,468,613个SNP标记,根据这些SNP位点进行FST的计算,最终确定了性染色体为24号染色体（chr.24）,性别决定区间位于X染色体3.74 Mb到5.91 Mb之间,Y染色体3.75 Mb到6.13 Mb之间。3、南方鲇性别连锁分子标记的开发。首先,将Illumina测序获得的XY雄鱼142,759,127条clean reads截短成60 bp长度（male k-mers-60）,通过Bowtie2比对到XX雌鱼参考基因组上,用SAMtools软件将没有比对到参考基因组的21,024,303条reads提取出来,并通过De novo组装软件Iterative De Bruijn Graph Assembler（IDBA）进行从头组装,得到8954个contig,然后将雌鱼混合池的172,602,041条clean reads比对到这些contig上,从比对结果中进一步过滤掉被雌鱼混合池中的reads比对上的contig,最终得到38条Y染色体特异的contig。对这些contig进行定位,并根据两侧是否存在雌雄一致序列来设计引物,分别对南方鲇养殖群体和野生群体进行PCR扩增,最终筛选出8个与性别连锁的分子标记,其中,前7个分子标记为雄性特异,而marker-8为共显性分子标记,可同时区分XX、XY和YY个体。从对南方鲇不同群体的遗传性别鉴定的结果来看,这些分子标记适用性良好,鉴定结果准确可靠。基因组比对分析发现,8个分子标记全部位于chr.24上,且均落在性别决定区间内部,从而印证了chr.24为南方鲇的性染色体。基于筛选到的这些分子标记,我们构建了南方鲇分子标记辅助生产XX全雌和YY超雄鱼的方法。4、南方鲇性别决定候选基因的鉴定。通过X和Y染色体的比对,发现在性别决定区间存在一段Y特异的序列,经过注释,发现这段序列含有一个amhr2的复制基因,命名为amhr2y。两者序列上存在一定的差异,核苷酸序列一致性为81%,编码的氨基酸序列一致性为70%。通过对南方鲇各组织及不同时期性腺转录组分析,发现amhr2y只在精巢特异表达。荧光原位杂交显示amhr2y在南方鲇5、10、30和120天的精巢体细胞和生殖细胞中均有表达。这些结果表明amhr2y可能是南方鲇的性别决定候选基因。综上所述,本研究综合利用二代和三代测序技术,测序组装获得高质量南方鲇染色体水平基因组,并完成了基因组注释。结合雌雄混合池的重测序,成功定位了南方鲇性染色体及性别决定区间;筛选到8个性别连锁分子标记并建立了分子标记辅助育种技术生产南方鲇单性鱼苗;鉴定了性别决定候选基因amhr2y。本研究结果为开展南方鲇经济性状的遗传解析、性别决定的分子机制研究和性控育种等奠定了基础。
吴琼[7]（2019）在《cAMP/PKA通路介导的戊唑醇对斑马鱼性别分化影响的机制研究》文中提出戊唑醇是一种常用的三唑类杀菌剂,具有高效广谱的特性,在土壤和水环境中可以检测到戊唑醇残留。而与戊唑醇有关的研究主要是环境行为、检测方法和哺乳动物毒性方面,关于其对水生生物的毒性研究不多。本论文以戊唑醇为研究对象,重点研究了戊唑醇对斑马鱼性别分化产生的影响,并对其可能的分子机制进行了探讨。（1）研究了戊唑醇影响斑马鱼性别分化最显着的时期。将不同生命阶段的斑马鱼（0-5 dpf,5-19 dpf,0-19 dpf,19-60 dpf,5-60 dpf,0-60 dpf）分别曝露于同一浓度（0.5 mg/L）的戊唑醇中,结果表明戊唑醇曝露对斑马鱼有发育毒性,包括存活率下降、体长体重减少。但性别分化前曝露并未对性别分化造成显着影响,并确定影响最显着的5-60 dpf为以后研究的曝露阶段。（2）研究了戊唑醇曝露对斑马鱼性别分化相关基因和性激素水平的影响,结果表明,戊唑醇使雄性发育相关基因gata4,fzd2,fzd7a转录水平上调,雌性发育相关基因rspo1,cyp19a1a,fox12,sf-1转录水平下调,dmrt1转录水平下调。并且雌二醇含量降低,睾酮含量升高。（3）研究了戊唑醇曝露对cAMP/PKA通路的影响。结果表明,戊唑醇抑制了该通路的活性,使PKA活性降低,FOXL2蛋白的磷酸化受阻碍,FOXL2调控的下游芳香化酶cyp19a转录受抑制,睾酮向雌二醇转化的效率降低,导致了性别比例偏向雄性化。推测戊唑醇可干扰cAMP/PKA的磷酸化。（4）通过非标记定量蛋白质组学和磷酸化非标记定量蛋白质组学测序,进一步探索戊唑醇影响斑马鱼性别分化的相关通路,发现戊唑醇可影响蛋白的磷酸化功能,FOXL2的同源蛋白FOXO有显着富集的KEGG通路,蛋白激酶B也受到了显着影响,证明我们的推测正确,戊唑醇通过干扰磷酸化来影响性别分化过程。
韩玉龙[8]（2019）在《amh基因在斜带石斑鱼性别分化中的作用机制研究》文中指出脊椎动物的性腺发育和性别分化涉及多种机制。硬骨鱼类由于种类繁多,导致了鱼类的性腺发育和性别分化机制多样。尤其在性逆转鱼类中,性腺发育和性别分化的研究仍然有限（目前的研究仅限于雌、雄激素和芳香化酶等研究）。众所周知,内源性雌激素是硬骨鱼类卵巢分化的诱导因子。然而,鱼类中性别分化除了受性激素影响外,还可以受到遗传因素抗缪勒氏管激素（amh）的影响。目前,AMH在雌性哺乳动物中可以通过减少芳香化酶（CYP19A1）的生物合成起作用,而且AMH对原始卵泡的募集和卵泡的发生有重要的作用。相比哺乳动物而言,硬骨鱼类中对于amh的研究较少。斜带石斑鱼是一种雌雄同体且雌性先熟的鱼类,在发育过程中经历性逆转,因此是研究脊椎动物的性别决定和性别分化的理想模型。针对性逆转斜带石斑鱼中性别决定和性腺分化研究的空白,本文成功的构建了amh在体过表达模型,并探索了amh在性别决定和性别分化过程中所起的功能,同时也初步研究了amh对于相对应的信号通路的调节。取得的研究结果如下:（1）原核表达纯化后,我们制备了amh的多克隆抗体,对得到的抗体进行Western blot和免疫组化检测,验证抗体的特异性。在性腺不同的分化时期和各组织内利用Western blot检测发现,从卵巢向精巢过渡的过程中,amh信号逐渐呈现一个增强的趋势,并且发现仅在性腺（精巢高表达,卵巢低表达）中检测到amh信号,而在其他组织中未检测到。免疫组化也证明了制备的多克隆抗体具有特异性。（2）通过成功建立的在体过表达模型,在亚成年斜带石斑鱼中进行投喂amh质粒实验。实验结果表明,与对照组性腺相比,投喂组鱼性腺发生了结构的变化,即卵巢出现退化并伴随着精原细胞和精母细胞的出现。荧光定量也表明体内雄性相关基因的表达量显着升高,而雌性相关基因的表达量显着下降。同时激素测定发现,与对照组相比,amh质粒投喂组中,血清中的E2含量有了显着性下降,而血清中的11-KT含量却出现显着性升高。结果表明amh在斜带石斑鱼性逆转过程中发挥的重要作用,即可以提前使卵巢退化并使性别决定为精巢。（3）通过成功建立的在体过表达模型,在未分化的幼年斜带石斑鱼中进行投喂amh质粒实验。实验结果发现,与对照组性腺相比,投喂组鱼性腺发生了结构的变化,即卵巢出现退化和凋亡并伴随着精原细胞的大量出现。荧光定量也表明出体内雄性相关基因的表达量显着升高,而雌性相关基因的表达量显着下降。同时激素测定发现,与对照组相比,amh质粒投喂组中,血清中的E2含量有了显着性下降,而血清中的11-KT含量却出现显着性升高。结果表明amh在斜带石斑鱼的性别分化中发挥着重要作用,即amh可以调节性腺出现雄性分化趋势而不用先经历雌性分化。（4）最后,基于上述在体实验结果推测amh上下游可能存在的信号通路,进行离体实验。实验结果表明,利用细胞系表达纯化得到的Amh蛋白具有生物活性,并且证明斜带石斑鱼中的Amh可以激活下游的Smad磷酸化通路。细胞系中双分子荧光互补实验证明,目标蛋白Smad5和下游Smad4可以进行互作。共转染amh表达质粒后会对cyp19a1a的启动子活性产生明显的抑制作用。同时发现,在cyp19a1a启动子上Smad特异性的结合区域主要是-2257/-2246bp和-1834/-1823bp位置。综上所述,离体实验可以初步证明在斜带石斑鱼中存在amh-Smads-cyp19a1a信号通路。
龙娟[9]（2019）在《TGF-β信号通路成员生物信息学分析及其在尼罗罗非鱼中的表达研究》文中研究表明转化生长因子-β（Transforming growth factorβ,TGF-β）信号通路是一个包含众多成员的大家族,主要由膜外的配体、膜上的受体以及胞内的SMADs蛋白组成。该信号参与介导了多种生物学过程,尤其在胚胎、组织和器官的发育与形成等方面发挥着重要作用。目前的研究报道都局限于单个TGF-β信号通路成员或者单个亚家族成员在某些组织或者某个发育时期的表达或功能研究,且研究对象大多为人类、小鼠和斑马鱼等模式动物,而大部分TGF-β信号通路成员在真骨鱼类中的表达模式和功能仍不清楚。此外,TGF-β信号通路被认为是动物基因组进化过程的良好标记,但TGF-β信号通路成员在多数动物类群中没有被全面鉴定过,其演化还不清晰。近年来,研究表明TGF-β信号通路在真骨鱼类性别决定、分化和性腺发育中也具有非常重要的作用,有多个成员被证实为鱼类的性别决定基因,还有很多成员也参与了鱼类的性别分化。本研究从全基因组水平鉴定了包括尼罗罗非鱼在内的24种代表性动物的TGF-β信号通路成员,分析了该信号通路在无脊椎动物进化过程中以及脊椎动物4次基因组复制过程中的系统演化。基于尼罗罗非鱼成鱼的8个不同组织转录组及不同发育时期雌雄性腺的16个转录组,分析了TGF-β信号通路成员的表达模式,并通过qPCR、原位杂交和免疫组化进行了实验验证。主要结果如下:本研究分离鉴定了海绵、水母、丝盘虫、绦虫、线虫、黑腹果蝇、水蛭、牡蛎、海胆、玻璃海鞘、文昌鱼、七鳃鳗、象鲨、斑点雀鳝、河鲀、尼罗罗非鱼、青鳉、斑马鱼、鲤鱼、腔棘鱼、非洲爪蟾、巨蟒、鸡和人24种代表性动物的TGF-β信号通路成员,分析表明TGF-β信号最早出现于海绵动物,是后生动物的关键特征之一。在海绵动物中已经出现多个配体、I型受体和SMADs,而仅有一个II型受体ACVR2,表明ACVR2可能是II型受体的祖先。在无脊椎动物和无颌类脊椎动物中,TGF-β配体、受体和SMADs的总数较少,且各物种间变化不大。而经过2R,有颌类脊椎动物中该信号通路成员发生了显着的扩张,四足动物已经拥有了30多个配体、7个I型受体、5个II型受体和8个SMADs,配体的扩张尤为明显。经过3R和4R,在真骨鱼类中有43-82个配体、9-22个I型受体、7-14个II型受体和13-31个SMADs,其成员明显多于四足动物。TGF-β信号通路成员在2R和3R后显着扩增,为脊椎动物组织和器官的复杂化奠定了物质基础。另外,脊椎动物中配体的数量远远超过了受体和SMADs,这表明多个配体可以共享相同的受体和SMADs。我们首次在软骨鱼类中分离出BMP16,也首次在四足动物中分离出了TGFB2、TGFBR2、ACVR1、SMAD4和SMAD6的复制基因。通过对TGF-β信号通路成员共线性分析,发现该信号通路成员间形成了5个紧密排列的基因簇,且这些基因簇在脊椎动物高度保守,表明这些基因间可能有协同作用。对尼罗罗非鱼成鱼8个组织的转录组数据分析表明,TGF-β多数配体呈现组织特异性表达,主要表达于心脏、性腺、肝脏和脑中:其中有6个配体（bmp16、bmp5、inhbba、bmp10a、bmp10b和bmp4）主要表达在心脏,有5个配体（admp2、bmp7a、gdf9、bmp15和gdf3）主要表达在卵巢,有4个配体（inha、gsdf、amh和gdf6b）主要表达在精巢,有3个配体（gdf2、inhbe和inhbab）主要表达在肝脏,有3个配体（gdf8a、gdf11和bmp7b）主要表达在脑;而大多数受体和SMADs在多个组织中都有表达,呈现泛表达模式,这可能是因为配体比较多样,且在不同的组织起作用的配体,共享同一个受体和SMADs。对尼罗罗非鱼不同发育阶段雌雄性腺转录组数据分析发现,TGF-β信号通路中有13个基因在性腺高表达并有明显性差,其中包括9个在卵巢高表达的基因（admp2、bmp7a、gdf9、bmp15、gdf3、acvr2ba、smad1、smad5和smad8）和4个在精巢高表达的基因（amh、gsdf、inha和amhr2）。为了更进一步了解TGF-β信号通路成员在性腺中的细胞定位,我们挑选16个基因（bmp15、gdf9、gdf3、ALK2a、ALK3、ALK6b、bmpr2a、bmpr2b、smad1、smad2a、smad2b、smad3a、smad3b、smad4ab、smad5和smad8）进行了原位杂交,结果表明这些基因都表达于卵巢的卵母细胞,其中大多数受体和SMADs还表达于成鱼精巢的精母细胞,表明TGF-β信号广泛地参与到尼罗罗非鱼的性腺发育中,尤其是对于卵母细胞的发育具有重要作用。利用实验室前期制备的特异性抗体进行免疫组化分析,结果表明Gsdf高表达于精巢精原细胞周围的支持细胞,也少量表达于不同发育阶段卵巢卵原细胞周围的体细胞,Amh在5 dah（Days after hatching,dah）高表达于精巢生殖细胞周围的体细胞,在后期主要表达于精巢的叶边细胞和支持细胞,也少量表达于卵巢初级生长阶段卵泡的颗粒细胞中。结合本实验室已有的敲除实验结果进一步表明gsdf和amh在性别决定和分化中有重要作用。综上,本研究从全基因组水平分析了TGF-β信号通路成员在动物界的起源和演化,并以尼罗罗非鱼为研究对象分析了TGF-β信号通路成员的表达模式,为全面理解TGF-β信号通路成员的进化及功能提供了新视角,为进一步研究TGF-β信号通路在不同组织特别是在性别决定、分化和性腺发育中的作用奠定了基础。
王飞龙[10]（2019）在《DNA甲基化酶家族生物信息学分析及其在尼罗罗非鱼中的表达和功能初探》文中指出表观遗传学研究在不改变DNA序列下的可遗传改变,DNA甲基化是表观遗传学研究的重要内容之一。以往的研究表明DNA甲基化在鱼类的性别决定和分化过程中具有重要作用,DNA甲基化酶在此过程中发挥的作用仍不清楚,本研究分析了DNA甲基化酶在脊椎动物中的系统进化及其成员扩增与动物全基因组复制的关系,并研究了DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼不同组织、不同发育时期雌鱼（卵巢）和雄鱼（精巢）性腺以及由雌转雄次发性逆转过程中的表达。此外,在离体条件下,采用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza-dC）体外孵育罗非鱼性腺组织,研究了抑制剂处理对DNA甲基化酶以及雌、雄通路关键基因表达的影响;在在体条件下,采用不同浓度梯度5-aza-dC浸浴或腹腔注射仔稚鱼,研究了抑制剂处理对罗非鱼幼鱼骨骼发育和性腺分化的影响,初步评估了DNA甲基化酶在尼罗罗非鱼发育过程中的功能。主要研究结果如下:1)本研究在尼罗罗非鱼基因组中鉴定了7个DNA甲基化酶家族成员,包括dnmt1、dnmt2、dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2,此外还从海鞘、象鲨、腔棘鱼、爪蟾、原鸡、蜥蜴、小鼠、人、斑点雀鳝、三棘刺鱼、青鳉、河豚、斑马鱼和鲤鱼基因组中分别鉴定了3、4、4、4、4、5、5、5、5、7、5、7、8和12个DNA甲基化酶家族成员。本研究在1R动物分离鉴定1个dnmt3,2R动物分离鉴定了2-3个dnmt3,3R动物分离鉴定了4-6个dnmt3,4R动物分离鉴定了10个dnmt3,说明DNA甲基化酶家族成员数目增多主要是由于dnmt3亚家族成员复制增多引起的,同时表明DNA甲基化酶家族随着全基因组复制而发生了扩张,本结果支持了2R和3R假说。2)系统发育分析表明脊椎动物DNA甲基化酶家族分为dnmt1、dnmt2和dnmt3 3个亚家族,dnmt1和dnmt2在进化过程中比较保守,而dnmt3亚家族发生了分歧。共线性分析表明,在硬骨鱼中dnmt3a复制产生了dnmt3aa和dnmt3ab,dnmt3b复制产生了dnmt3ba和dnmt3bb.1,dnmt3bb.1经过串联复制产生了dnmt3bb.2,说明dnmt3亚家族在硬骨鱼和其他脊椎共同祖先发生了复制,在硬骨鱼辐射前和其他脊椎动物分离后发生了扩张。3)通过对8个不同组织（脑、心脏、肝脏、卵巢、精巢、肾脏、肌肉和头肾）转录组数据分析和RT-PCR验证,结果表明尼罗罗非鱼的7个DNA甲基化酶（dnmt1、dnmt2、dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2）在头肾和精巢都有表达,有6个在心脏、卵巢和肾脏有表达。此外,维持甲基化酶dnmt1在8个组织都有相对较高的表达,而从头甲基化酶dnmt3亚家族成员（dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2）在各个组织中的表达差异较大,其中dnmt3ba、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2在性腺高表达。4)通过对四个不同发育时期（孵化后5、30、90和180天）及次发性逆转过程的雌雄性腺转录组数据分析和qPCR验证,结果表明所有的DNA甲基化酶都在性腺中表达,且在雌雄性腺中的表达具有显着差异,其中dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2在精巢中的表达高于卵巢,而dnmt1、dnmt2和dnmt3ba在卵巢中的表达高于精巢。此外,在由雌转雄的次发性逆转过程中dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2的表达显着升高,表明从头甲基化酶可能在尼罗罗非鱼性腺发育过程中具有重要作用。原位杂交检测结果表明了DNA甲基化酶家族成员主要表达于在卵巢组织中I和II时相卵母细胞和精巢组织中的精母细胞。5)通过DNA甲基化酶抑制剂5-aza-dC体外孵育罗非鱼雌雄性腺和性逆转性腺,发现5-aza-dC能够下调DNA甲基化酶家族成员的表达,同时上调雌性通路关键基因cyp19a1a和雄性通路关键基因dmrt1的表达。采用不同浓度梯度5-aza-dC浸浴罗非鱼鱼卵,发现与对照组相比,处理组幼鱼的死亡率和畸形率增加,茜素红染色结果表明处理组鱼脊柱弯曲变形。此外,采用较高浓度5-aza-dC腹腔注射孵化后5天的雌鱼,处理后60天和90天组织学检测发现有25-34%雌鱼性逆转为雄鱼,免疫组化结果表明,处理后60天,处理鱼性腺表达雄性特异基因dmrt1,不再表达雌性特异基因cyp19a1a。本研究结果表明DNA甲基化酶在尼罗罗非鱼发育过程中尤其是性腺发育过程中具有重要作用,其发挥作用的具体机制还有待进一步阐明。
二、鱼类的性别决定和分化及其研究方法综述（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鱼类的性别决定和分化及其研究方法综述（论文提纲范文）
（1）Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 脊椎动物性腺发育 |
| 1.1 生殖细胞的来源 |
| 1.2 生殖细胞的迁移与原始性腺的形成 |
| 2 脊椎动物性别决定 |
| 2.1 脊椎动物性别决定方式 |
| 2.2 脊椎动物生殖细胞的性别决定 |
| 3 脊椎动物性别分化 |
| 3.1 哺乳动物性别分化 |
| 3.2 鸟类性别分化 |
| 3.3 爬行类性别分化 |
| 3.4 两栖类性别分化 |
| 3.5 鱼类性别分化 |
| 4 Dmrt家族基因与性别分化 |
| 4.1 Dmrt1 |
| 4.2 Dmy/dmrt1bY |
| 4.3 Dm-w |
| 5 Fox家族基因与性别分化 |
| 5.1 Foxl2 |
| 5.2 Foxl3 |
| 6 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 7 本研究的技术路线 |
| 第2章 尼罗罗非鱼foxl3 在生殖细胞性别命运决定中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼foxl3 序列进化分析和性腺表达模式 |
| 3.2 尼罗罗非鱼foxl3 纯合突变系的建立 |
| 3.3 尼罗罗非鱼foxl3 纯合突变导致卵巢中出现精子发生 |
| 3.4 尼罗罗非鱼XX foxl3 纯合突体性腺体细胞维持雌性环境 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼foxl3 特异表达于雌性生殖细胞中 |
| 4.2 尼罗罗非鱼foxl3 决定XX个体性腺生殖细胞性别命运 |
| 第3章 尼罗罗非鱼dmrt1 在雄性性别分化中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼dmrt1 在精巢中的细胞定位 |
| 3.2 尼罗罗非鱼dmrt1 纯合突变系的建立 |
| 3.3 尼罗罗非鱼dmrt1 纯合突变导致由雄向雌的性逆转 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼dmrt1 表达于精巢支持细胞和生殖细胞 |
| 4.2 尼罗罗非鱼dmrt1 是精巢分化所必需的 |
| 第4章 尼罗罗非鱼dmrt1和foxl3 相互拮抗研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 双突变dmrt1;foxl3 导致性腺发育为精卵巢 |
| 3.2 尼罗罗非鱼Foxl3 直接抑制dmrt1 的转录 |
| 3.3 尼罗罗非鱼Dmrt1 直接抑制foxl3 的转录 |
| 3.4 外源雌激素不能回救foxl3 突变导致的生殖细胞性逆转 |
| 3.5 阻断雌激素合成无法回救dmrt1 突变导致的性逆转 |
| 3.6 阻断雌激素合成导致foxl3 突变性腺完全雄性化 |
| 3.7 阻断雌激素合成导致dmrt1;foxl3 双突变性腺雄性化 |
| 3.8 敲降foxl2 成功回救dmrt1 突变导致的性逆转 |
| 4 讨论 |
| 4.1 尼罗罗非鱼foxl3与dmrt1 相互拮抗决定生殖细胞性别命运 |
| 4.2 尼罗罗非鱼dmrt1 拮抗foxl2/cyp19a1a决定性腺分化方向 |
| 4.3 体细胞环境对生殖细胞性别命运的影响 |
| 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的主要论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（2）弓背青鳉三个地理群体表型比较与性别决定基因初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 鱼类的形态学比较研究进展 |
| 1.2 鱼类早期发育及其环境因素的研究进展 |
| 1.3 鱼类性别决定基因DMY和 Dmrt的研究进展 |
| 1.4 温度驯化对鱼类影响的研究进展 |
| 1.5 弓背青鳉的研究进展 |
| 1.6 选题目的与意义 |
| 2 弓背青鳉不同地理种群的驯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 弓背青鳉孵化和早期繁养方法 |
| 2.1.2 弓背青鳉不同地理种群的驯化 |
| 2.1.3 弓背青鳉不同地理种群F1的性别鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 弓背青鳉不同地理种群的驯化 |
| 2.2.2 弓背青鳉不同地理种群F1的性别鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 3 弓背青鳉不同地理群体的形态学初步分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 不同地理群体F1出膜后卵径大小的比较 |
| 3.1.2 不同地理野生群体形态学比较分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 三个地理群体F1出膜后卵径大小的比较 |
| 3.2.2 不同地理野生群体形态学比较分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 弓背青鳉三亚群体雌雄性腺转录组分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 测序文库构建、数据分析及验证 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 转录组测序结果分析 |
| 4.2.2 转录组Unigene的功能注释 |
| 4.2.3 功能基因GO分类 |
| 4.2.4 功能基因KEGG分类 |
| 4.2.5 差异基因比较分析 |
| 4.2.6 差异表达基因Pathway分类 |
| 4.2.7 差异基因表达水平聚类分析 |
| 4.2.8 RT-qPCR验证表达 |
| 4.3 讨论 |
| 5 温度对不同地理种群弓背青鳉生长发育的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料与试剂 |
| 5.1.2 温度梯度设置 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 温度对不同地理群体出膜时间的比较 |
| 5.2.2 温度对不同地理群体弓背青鳉生长的比较 |
| 5.3 讨论 |
| 6 结论 |
| 7 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（3）亲代双酚A暴露对稀有鮈鲫子代胚胎发育及性腺分化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 BPA简介 |
| 1.1.1 BPA的理化特性 |
| 1.1.2 BPA的用途 |
| 1.1.3 BPA在人类生活中的分布 |
| 1.1.4 BPA的污染状况 |
| 1.1.5 BPA的安全标准 |
| 1.1.6 BPA的一般作用机制 |
| 1.2 BPA的危害 |
| 1.2.1 BPA对生殖发育的影响 |
| 1.2.1.1 BPA对雄性生殖发育的影响 |
| 1.2.1.2 BPA对雌性生殖发育的影响 |
| 1.2.2 BPA对鱼类性别分化的影响 |
| 1.2.3 BPA的胚胎发育毒性 |
| 1.2.4 BPA的神经系统发育毒性 |
| 1.2.5 BPA对生殖内分泌系统的影响 |
| 1.2.6 BPA对鱼类的免疫毒性 |
| 1.3 鱼类的性别决定 |
| 1.3.1 鱼类的性腺分化 |
| 1.3.2 鱼类的性别决定过程 |
| 1.3.3 鱼类性别决定相关基因 |
| 1.3.4 类固醇激素及相关基因在性别决定中的作用 |
| 1.4 选题目的与意义 |
| 第二章 亲代BPA暴露对稀有鮈鲫子代胚胎发育及性腺发育的影响 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验用鱼 |
| 2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.1.3 主要实验溶液及配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 BPA暴露实验及其清水恢复实验 |
| 2.2.2 稀有鮈鲫人工繁殖 |
| 2.2.3 稀有鮈鲫子代的养护 |
| 2.3 稀有鮈鲫子代胚胎发育相关指标的检测 |
| 2.3.1 鱼均产卵量、产卵率和卵径的检测 |
| 2.3.2 子代胚胎受精率、胚胎自主运动和胚胎心率的检测 |
| 2.3.3 子代胚胎孵化率的检测 |
| 2.3.4 子代初孵仔鱼形态学观察及畸形率统计 |
| 2.3.5 子代胚胎死亡率及0-20dph死亡率的统计 |
| 2.4 子代生长发育相关指标检测 |
| 2.5 子代性腺相关生物学指标检测 |
| 2.5.1 样品采集 |
| 2.5.2 性腺组织学切片的制备与观察 |
| 2.5.3 子代雄性精子质量相关指标的评估 |
| 2.5.4 类固醇激素及卵黄蛋白原(VTG)水平的测定 |
| 2.6 数据处理与分析 |
| 2.7 结果 |
| 2.7.1 亲代BPA暴露对稀有鮈鲫产卵量、产卵率和卵径的影响 |
| 2.7.2 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫受精率、自主运动及心率的影响 |
| 2.7.3 亲代BPA暴露对稀有鮈鲫孵化率及孵化曲线的影响 |
| 2.7.4 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫畸形率和不同畸形类型比率的影响 |
| 2.7.4.1 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫畸形率的影响 |
| 2.7.4.2 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫初孵仔鱼形态特征的影响 |
| 2.7.4.3 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫成鱼畸形类型的影响 |
| 2.7.5 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫胚胎死亡率及仔鱼死亡率的影响 |
| 2.7.6 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫性腺发育的影响 |
| 2.7.6.1 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫部分生长发育相关生物学指标的影响 |
| 2.7.6.2 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫肥满度的影响 |
| 2.7.6.3 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫性腺重量的影响 |
| 2.7.6.4 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫性腺指数的影响 |
| 2.7.6.5 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫精子质量的影响 |
| 2.7.6.6 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫性别比例的影响 |
| 2.7.6.7 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫精巢发育的影响 |
| 2.7.6.8 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫卵巢发育的影响 |
| 2.7.7 类固醇激素及卵黄蛋白原(VTG)水平的测定 |
| 2.7.7.1 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫性腺类固醇激素水平的影响 |
| 2.7.7.2 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫血清类固醇激素水平的影响 |
| 2.7.7.3 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫VTG水平的影响 |
| 2.8 分析与讨论 |
| 2.8.1 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫胚胎发育的影响 |
| 2.8.2 亲代BPA暴露对稀有鮈鲫子代性腺发育的影响 |
| 2.8.3 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫性腺分化及性类固醇激素合成的影响 |
| 2.8.4 亲代BPA暴露对子代稀有鮈鲫精子质量的影响 |
| 2.9 小结 |
| 第三章 基于转录组测序技术探究亲代BPA暴露对稀有鮈鲫子代性腺分化的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 样品的采集 |
| 3.2.2 总RNA的提取及质量检测 |
| 3.2.3 稀有鮈鲫性腺cDNA文库的构建、检测及测序 |
| 3.2.4 RNA测序数据的生物信息学分析 |
| 3.2.4.1 测序结果的质控、de novo组装 |
| 3.2.4.2 Unigene统计与功能注释 |
| 3.2.4.3 差异表达基因的筛选 |
| 3.2.4.4 差异表达基因功能注释 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证RNA-Seq数据的可靠性 |
| 3.3 数据分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 性腺总RNA质量检测 |
| 3.4.2 转录组测序与组装 |
| 3.4.2.1 转录组数据特征 |
| 3.4.2.2 数据过滤后reads质量统计 |
| 3.4.2.3 Unigene质量指标 |
| 3.4.2.4 组装质量评估 |
| 3.4.3 Unigene功能注释 |
| 3.4.3.1 Unigene注释总览 |
| 3.4.3.2 Unigenes的功能注释与分类 |
| 3.4.4 基因差异表达分析 |
| 3.4.5 差异表达基因的Gene Ontology富集分析 |
| 3.4.5.1 卵巢差异表达基因功能注释及富集分析 |
| 3.4.5.2 精巢差异表达基因功能注释及富集分析 |
| 3.4.6 差异表达基因的KEGG富集分析 |
| 3.4.6.1 卵巢差异表达基因功能注释及富集分析 |
| 3.4.6.2 精巢差异表达基因功能注释及富集分析 |
| 3.4.7 性腺生殖相关差异基因的筛选 |
| 3.4.7.1 卵巢中生殖相关差异基因的筛选 |
| 3.4.7.2 精巢中生殖相关差异基因的筛选 |
| 3.4.8 BPA处理后性腺类固醇合成KEGG通路分析 |
| 3.4.9 性腺中生殖相关差异基因的q RT-PCR定量验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 BPA对精子发生过程相关基因表达的影响 |
| 3.5.2 BPA对类固醇合成过程相关基因的表达的影响 |
| 3.5.3 BPA对细胞周期调控相关基因表达的影响 |
| 3.5.4 BPA对稀有鮈鲫调控卵巢发育过程基因表达的影响 |
| 3.5.5 BPA对稀有鮈鲫调控其他生物学过程基因表达的影响 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 亲代BPA暴露并清水恢复后对子代生殖相关基因m RNA表达的影响 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试验试剂及仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 样品的采集 |
| 4.2.2 总RNA的提取 |
| 4.2.3 cDNA的合成 |
| 4.2.4 定量引物设计与合成 |
| 4.2.5 q RT-PCR检测目标基因的m RNA表达 |
| 4.3 数据处理及分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 BPA对调控性腺发育和分化相关基因m RNA表达的影响 |
| 4.4.2 BPA对性腺类固醇合成相关基因m RNA表达的影响 |
| 4.4.3 BPA对性腺性激素受体基因及vtg基因m RNA表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 BPA对调控性腺发育和分化相关基因m RNA表达的影响 |
| 4.5.2 BPA对性腺类固醇合成相关基因m RNA表达的影响 |
| 4.5.3 BPA对性腺中性激素受体基因及vtg基因m RNA表达的影响 |
| 4.6 小结 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）胆固醇侧链裂解酶Cyp11a1在尼罗罗非鱼中的表达及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 类固醇激素的合成 |
| 1.1 类固醇激素合成酶 |
| 1.2 类固醇激素合成途径 |
| 2 类固醇激素的生理作用 |
| 2.1 皮质激素的生理作用 |
| 2.2 性类固醇激素的生理作用 |
| 3 Cyp11a1的研究现状 |
| 4 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 第2章 尼罗罗非鱼cyp11a1的分离及表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要仪器和试剂 |
| 2.3 脊椎动物cyp11a1的分离 |
| 2.4 脊椎动物cyp11a1系统进化树的构建 |
| 2.5 共线性分析 |
| 2.6 罗非鱼成鱼各组织和性腺发育各时期转录组分析 |
| 2.7 Real-time PCR |
| 2.8 原位杂交 |
| 3 结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼及其它脊椎动物cyp11a1的分离 |
| 3.2 脊椎动物cyp11a1的系统进化和共线性分析 |
| 3.3 cyp11a1在尼罗罗非鱼成鱼各组织中的表达 |
| 3.4 cyp11a1在尼罗罗非鱼性腺各时期的表达 |
| 3.5 cyp11a1在尼罗罗非鱼头肾和性腺中的细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 cyp11a1在脊椎动物中的拷贝情况 |
| 4.2 cyp11a1在罗非鱼性腺和头肾中表达 |
| 第3章 cyp11a1在尼罗罗非鱼中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 靶点设计 |
| 2.3 g RNA和 Cas9 合成及显微注射 |
| 2.4 突变检测及传代建系 |
| 2.5 Real-time PCR |
| 2.6 苏木精-伊红染色 |
| 2.7 免疫荧光 |
| 2.8 激素测定 |
| 2.9 抗低氧能力评估 |
| 2.10 孕烯醇酮及雌激素回救 |
| 2.11 育性评估 |
| 2.12 统计检验 |
| 3 结果 |
| 3.1 F0阳性鱼的获得与建系 |
| 3.2 cyp11a1纯合突变鱼头肾发育异常且无法合成皮质醇 |
| 3.3 cyp11a1 纯合突变XX鱼发生由雌向雄的性逆转 |
| 3.4 cyp11a1 纯合突变XX鱼无法合成雌雄激素 |
| 3.5 E2可回救cyp11a1突变导致的由雌向雄的性逆转 |
| 3.6 cyp11a1 纯合突变XY鱼减数分裂异常 |
| 3.7 cyp11a1 纯合突变XY鱼精巢生殖细胞减少 |
| 4 讨论 |
| 4.1 皮质激素对于罗非鱼很重要但不是必需的 |
| 4.2 雌激素对于鱼类性别分化很重要 |
| 4.3 雄激素对于鱼类精子发生很重要但并非必不可少 |
| 第4章 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（5）ATF/CREB家族生物信息学分析及creb1在尼罗罗非鱼配子发生中的功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略语对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 鱼类生殖生理学概述 |
| 1.1 鱼类生殖生理学定义 |
| 1.2 鱼类生殖生理学的发展 |
| 2 复制基因研究概况 |
| 2.1 复制基因定义 |
| 2.2 全基因组复制 |
| 2.3 复制基因的演化 |
| 2.4 复制基因与基因家族 |
| 3 ATF/CREB家族的生物信息学分析 |
| 3.1 ATF/CREB家族的概况 |
| 3.2 ATF/CREB家族的成员及分类 |
| 3.3 ATF/CREB家族成员的功能 |
| 4 CREB1在脊椎动物中的研究进展 |
| 4.1 CREB1的功能 |
| 4.2 CREB1相关的信号通路 |
| 5 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 第2章 ATF/CREB家族生物信息学分析及其在尼罗罗非鱼的表达研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验鱼 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 ATF/CREB家族成员在代表性动物中的分离鉴定 |
| 3.2 ATF/CREB家族的系统发育分析 |
| 3.3 ATF/CREB家族成员的基因组定位及共线性分析 |
| 3.4 ATF/CREB家族成员在尼罗罗非鱼8 个组织中的表达模式 |
| 3.5 ATF/CREB家族成员在尼罗罗非鱼各时期性腺中的表达 |
| 3.6 ATF/CREB家族成员表达模式验证结果分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ATF/CREB家族的起源与演化 |
| 4.2 ATF/CREB家族成员在尼罗罗非鱼中的表达及其潜在的功能 |
| 4.3 复制基因在尼罗罗非鱼性腺中表达模式发生分化 |
| 第3章 creb1在尼罗罗非鱼配子发生中的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 CRISPR/Cas9 成功突变尼罗罗非鱼creb1a |
| 3.2 CRISPR/Cas9 成功突变尼罗罗非鱼creb1b |
| 3.3 creb1a对配子发生的影响 |
| 3.4 creb1b对配子发生的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 creb1a影响卵母细胞的发育 |
| 4.2 creb1b影响后期卵母细胞的发育及早期精子发生 |
| 4.3 creb1a和 creb1b在性腺中发生了功能分化 |
| 第4章 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
（6）基于全基因组测序的南方鲇性别连锁分子标记开发和性别决定候选基因鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstracts |
| 第1章 文献综述 |
| 1 南方鲇的生物学特性及研究概况 |
| 1.1 南方鲇生物学特性 |
| 1.2 南方鲇生物学研究概况 |
| 2 鱼类性别决定研究进展 |
| 2.1 鱼类性染色体与性别决定 |
| 2.2 鱼类性别决定基因研究进展 |
| 3 鱼类性别连锁分子标记的开发及应用 |
| 3.1 微卫星分子标记 |
| 3.2 随机扩增多态性DNA分子标记 |
| 3.3 扩增片段长度多态性分子标记 |
| 3.4 单核苷酸多态性及插入缺失分子标记 |
| 3.5 基于高通量测序的分子标记开发 |
| 4 DNA测序组装技术及其在鱼类中的应用 |
| 4.1 DNA测序技术的发展概况 |
| 4.2 辅助基因组组装技术的发展概况 |
| 4.3 鱼类全基因组测序 |
| 4.4 鱼类基因组重测序 |
| 5 科学问题的提出及本研究的目的意义(含技术路线) |
| 第2章 南方鲇全基因组测序组装、注释及分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因组测序结果统计 |
| 3.2 基于k-mer的基因组大小评估 |
| 3.3 基因组组装与质量评估 |
| 3.4 转录组测序数据统计 |
| 3.5 基因组注释结果 |
| 3.6 比较基因组学分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 南方鲇基因组测序组装策略 |
| 4.2 南方鲇基因组特征 |
| 第3章 南方鲇性染色体及性别决定区间的定位 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 基因组DNA质量检测 |
| 3.2 原始数据过滤及质量控制 |
| 3.3 有效数据比对到参考基因组 |
| 3.4 SNP检测结果 |
| 3.5 SNP定位性染色体及性别决定区间 |
| 3.6 性别决定区间基因分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 雌雄混合池重测序确定性别决定区间的策略 |
| 4.2 南方鲇性染色体与性别决定区间 |
| 第4章 南方鲇性别连锁分子标记的开发 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂和药品 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 表型性别鉴定 |
| 3.2 基因组DNA质量检测 |
| 3.3 性别连锁分子标记的筛选 |
| 3.4 性别特异引物的设计 |
| 3.5 养殖群体和野生群体的遗传性别鉴定 |
| 3.6 分子标记在染色体上的分布及与性别决定区间的关系 |
| 3.7 分子标记辅助育种 |
| 4 讨论 |
| 4.1 南方鲇性别连锁分子标记的开发 |
| 4.2 南方鲇性别连锁分子标记与性别决定区间的关系 |
| 4.3 南方鲇分子标记辅助育种技术的建立 |
| 第5章 南方鲇性别决定候选基因的鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂和药品 |
| 2.3 仪器设备 |
| 2.4 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 性别决定区间X与Y染色体的序列差异 |
| 3.2 性别决定候选基因定位 |
| 3.3 性别决定候选基因生物信息学分析 |
| 3.4 性别决定候选基因的表达分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 YY个体的获得对鉴定性别决定候选基因的重要性 |
| 4.2 南方鲇性别决定候选基因的定位 |
| 4.3 南方鲇性别决定候选基因的表达模式 |
| 4.4 南方鲇性别决定的可能机制 |
| 4.5 鱼类性别决定基因的鉴定及其意义 |
| 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 在读期间申请专利 |
| 在读期间参加科研情况 |
（7）cAMP/PKA通路介导的戊唑醇对斑马鱼性别分化影响的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语和缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鱼类的性别分化 |
| 1.1.1 鱼类的性腺发育及性别分化机制 |
| 1.1.2 环境因子对鱼类性别分化的影响 |
| 1.1.3 环境内分泌干扰物对鱼类的性别分化的影响研究进展 |
| 1.2 戊唑醇应用现状和毒理学研究进展 |
| 1.2.1 戊唑醇在农业的产量及应用情况 |
| 1.2.2 戊唑醇对水生生物的环境毒理研究进展 |
| 1.3 研究内容和意义 |
| 1.3.1 研究内容 |
| 1.3.2 研究意义 |
| 第二章 戊唑醇曝露对不同生命阶段斑马鱼性别分化的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试药剂 |
| 2.2.2 仪器及设备 |
| 2.2.3 斑马鱼饲养 |
| 2.2.4 戊唑醇暴露试验 |
| 2.2.5 性腺组织切片及苏木精-伊红(HE)染色 |
| 2.2.6 戊唑醇和E2复合曝露试验 |
| 2.2.7 数据统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 戊唑醇对斑马鱼存活率的影响 |
| 2.3.2 戊唑醇对斑马鱼对体长的影响 |
| 2.3.3 戊唑醇对斑马鱼对体重的影响 |
| 2.3.4 戊唑醇对斑马鱼性别比例的影响 |
| 2.3.5 戊唑醇和E2复合曝露对斑马鱼性别比例的影响 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 戊唑醇暴露后斑马鱼幼鱼性别分化相关基因和性激素的时空表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 供试药剂 |
| 3.2.2 仪器及设备 |
| 3.2.3 斑马鱼饲养 |
| 3.2.4 斑马鱼曝露试验 |
| 3.2.5 基因转录水平检测 |
| 3.2.6 性激素水平测定 |
| 3.2.7 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 戊唑醇曝露对斑马鱼性别分化相关基因的影响 |
| 3.3.2 戊唑醇曝露对斑马鱼性激素的影响 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 第四章 戊唑醇对斑马鱼性别分化的信号通路研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验试剂 |
| 4.2.2 仪器及设备 |
| 4.2.3 cyp19a1a RNA敲降实验 |
| 4.2.4 蛋白免疫印迹实验 |
| 4.2.5 PKA活性检测 |
| 4.2.6 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Cyp19a的RNA干扰试验 |
| 4.3.2 FOXL2蛋白及磷酸化检测 |
| 4.3.3 PKA活性检测 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 4.4.1 讨论 |
| 4.4.2 小结 |
| 第五章 戊唑醇对斑马鱼幼鱼蛋白表达及磷酸化蛋白修饰的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试药剂 |
| 5.2.2 仪器及设备 |
| 5.2.3 曝露试验 |
| 5.2.4 非标记定量(Label-free)蛋白质组学测序 |
| 5.2.5 磷酸化非标记定量(Label-free)蛋白质组学测序 |
| 5.2.6 质量控制 |
| 5.2.7 数据处理 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 蛋白质提取质量 |
| 5.3.2 蛋白组组学结果 |
| 5.3.3 磷酸化蛋白质组学结果 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 5.4.1 讨论 |
| 5.4.2 小结 |
| 全文总结 |
| 总结 |
| 论文创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历以及在校期间的科研成果 |
（8）amh基因在斜带石斑鱼性别分化中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1.鱼类性别决定和性别分化研究 |
| 2.鱼类性别决定基因的研究 |
| 3.AMH基因简介 |
| 4.斜带石斑鱼简介 |
| 5.研究的目的和意义 |
| 6.创新点 |
| 第一章 斜带石斑鱼不同分化期的转录组分析及amh多克隆抗体的制备 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二章 amh在斜带石斑鱼性别分化中的作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三章 amh在斜带石斑鱼性腺发育中的作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第四章 amh在斜带石斑鱼性腺中参与的信号通路研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 缩略词对照表 |
| 附录Ⅱ 抗体对照表 |
| 附录Ⅲ 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（9）TGF-β信号通路成员生物信息学分析及其在尼罗罗非鱼中的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 生物信息学概述 |
| 1.1 生物信息学的定义 |
| 1.2 生物信息学的发展历程 |
| 2 复制基因研究概况 |
| 2.1 复制基因定义 |
| 2.2 基因家族 |
| 2.3 全基因组复制 |
| 3 TGF-β信号通路的研究 |
| 3.1 TGF-β信号通路的概况 |
| 3.2 TGF-β信号通路成员 |
| 3.2.1 配体 |
| 3.2.2 受体 |
| 3.2.3 SMADs |
| 3.3 TGF-β信号的识别及作用方式 |
| 3.4 TGF-β信号介导的生物学功能 |
| 3.4.1 在发育中的作用 |
| 3.4.1.1 在胚胎发育中的作用 |
| 3.4.1.2 在骨骼发育中的作用 |
| 3.4.1.3 在肿瘤发生中的作用 |
| 3.4.2 在生殖中的作用 |
| 3.4.3 在鱼类性别决定与分化中的作用 |
| 3.4.3.1 脊椎动物性别决定基因的研究 |
| 3.4.3.2 TGF-β信号参与鱼类的性别决定与分化 |
| 3.4.3.3 TGF-β信号参与鱼类性别决定与分化的可能机制 |
| 4 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 第2章 TGF-β信号的起源和演化 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 数据库本地Blast的构建 |
| 2.2 TGF-β信号通路成员序列的分离 |
| 2.3 配体系统发育分析 |
| 2.4 受体系统发育分析 |
| 2.5 SMADs系统发育分析 |
| 2.6 TGF-β信号通路成员在基因组上的定位 |
| 3 结果 |
| 3.1 TGF-β信号通路成员在动物界中的分离鉴定 |
| 3.2 配体的系统发育分析 |
| 3.3 受体的系统发育分析 |
| 3.4 SMADs的系统发育分析 |
| 3.5 TGF-β信号通路成员的基因组定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TGF-β信号通路的起源与演化 |
| 4.2 TGF-β信号通路成员的扩张与基因组进化的关系 |
| 4.3 TGF-β信号通路成员的共线性 |
| 第3章 TGF-β信号通路成员在尼罗罗非鱼中的表达研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验鱼 |
| 2.2 引物合成 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 主要仪器 |
| 2.6 TGF-β信号通路成员的时空表达模式 |
| 2.7 TGF-β信号通路成员表达模式的验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 TGF-β信号通路成员在尼罗罗非鱼8 个组织中的表达模式 |
| 3.2 TGF-β信号通路成员在尼罗罗非鱼各时期性腺转录组中的表达 |
| 3.3 实验验证TGF-β信号通路成员的表达模式 |
| 4 讨论 |
| 4.1 TGF-β信号通路成员在尼罗罗非鱼8 个组织中的表达及其可能作用 |
| 4.2 TGF-β信号通路成员在尼罗罗非鱼各时期性腺中的表达及其可能作用 |
| 4.3 TGF-β信号通路成员在尼罗罗非鱼性腺表达的实验验证与结果分析 |
| 第4章 结论 |
| 本研究的主要创新点 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
| 附表 |
（10）DNA甲基化酶家族生物信息学分析及其在尼罗罗非鱼中的表达和功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1 鱼类性别决定与性腺分化 |
| 1.1 鱼类的性别 |
| 1.2 鱼类的性别决定方式 |
| 1.3 鱼类的性别分化 |
| 2 DNA甲基化 |
| 2.1 DNA甲基化机制 |
| 2.2 DNA甲基化与基因表达调控 |
| 2.3 DNA甲基化酶分类及成员 |
| 2.4 DNA甲基化酶结构与功能 |
| 2.5 DNA甲基化酶在脊椎动物的表达模式 |
| 2.6 DNA甲基化和DNA甲基化酶与性腺发育 |
| 3 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 第2章 DNA甲基化酶家族生物信息学分析及表达研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验鱼 |
| 2.2 DNA甲基化酶家族成员鉴定 |
| 2.3 DNA甲基化酶家族系统发育分析及基因定位 |
| 2.4 DNA甲基化酶家族共线性分析 |
| 2.5 DNA甲基化酶家族成员在罗非鱼中的时空表达模式分析 |
| 2.6 DNA甲基化酶家族成员表达模式验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 尼罗罗非鱼DNA甲基化酶鉴定 |
| 3.2 DNA甲基化酶系统进化分析 |
| 3.3 DNA甲基化酶家族成员共线性分析 |
| 3.4 DNA甲基化酶在罗非鱼中的时空表达模式 |
| 3.5 DNA甲基化酶表达模式验证结果分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DNA甲基化酶家族成员的分离、系统发生及共线性 |
| 4.2 从头甲基化酶在罗非鱼性腺中的表达具有性差 |
| 4.3 DNA甲基化酶复制基因在罗非鱼中的表达模式发生分歧 |
| 第3章 DNA甲基化酶在罗非鱼性腺发育中的功能 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 抑制剂体外孵育对甲基化酶基因和性腺分化关键基因表达的影响 |
| 3.2 抑制剂浸浴后罗非鱼畸形率和死亡率统计 |
| 3.3 抑制剂腹腔注射后罗非鱼性腺组织学检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DNA甲基化酶抑制剂体外孵育上调性腺分化关键基因的表达 |
| 4.2 DNA甲基化酶抑制剂浸浴导致罗非鱼畸形率和死亡率增加 |
| 4.3 DNA甲基化酶抑制剂腹腔注射使雌性罗非鱼性逆转 |
| 第4章 结论 |
| 本研究的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文 |
| 在读期间参加科研情况 |
四、鱼类的性别决定和分化及其研究方法综述（论文参考文献）
- [1]Dmrt1和Foxl3在尼罗罗非鱼性别分化和生殖细胞命运决定中的功能研究[D]. 戴生飞. 西南大学, 2021
- [2]弓背青鳉三个地理群体表型比较与性别决定基因初探[D]. 汪淳. 广东海洋大学, 2020
- [3]亲代双酚A暴露对稀有鮈鲫子代胚胎发育及性腺分化的影响[D]. 冉本会. 西北农林科技大学, 2020(02)
- [4]胆固醇侧链裂解酶Cyp11a1在尼罗罗非鱼中的表达及功能研究[D]. 肖河生. 西南大学, 2020
- [5]ATF/CREB家族生物信息学分析及creb1在尼罗罗非鱼配子发生中的功能研究[D]. 王晓双. 西南大学, 2020
- [6]基于全基因组测序的南方鲇性别连锁分子标记开发和性别决定候选基因鉴定[D]. 郑树清. 西南大学, 2020
- [7]cAMP/PKA通路介导的戊唑醇对斑马鱼性别分化影响的机制研究[D]. 吴琼. 浙江大学, 2019(01)
- [8]amh基因在斜带石斑鱼性别分化中的作用机制研究[D]. 韩玉龙. 中山大学, 2019
- [9]TGF-β信号通路成员生物信息学分析及其在尼罗罗非鱼中的表达研究[D]. 龙娟. 西南大学, 2019(01)
- [10]DNA甲基化酶家族生物信息学分析及其在尼罗罗非鱼中的表达和功能初探[D]. 王飞龙. 西南大学, 2019(01)