一、成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究（论文文献综述）
吴雨[1]（2020）在《GH和GHR基因对贵州地方黄牛生长性能影响研究》文中提出贵州有关岭牛、思南牛、威宁牛等优良地方黄牛品种资源,有研究表明它们均含有人体必需的8种氨基酸,是一种蛋白质含量高,脂肪含量较低的膳食肉品,深受人们喜爱,但这些地方品种具有体格偏小,生长速度缓慢等问题,在一定程度上影响了开发利用。故本试验以贵州地方黄牛（关岭牛、思南牛、威宁牛）为主要研究对象,以生长激素（GH）和生长激素受体（GHR）为候选基因,对GH、GHR两个基因进行多态性检测,分析两个基因SNPs位点与贵州地方黄牛生长性状的相关性,对贵州地方黄牛骨骼肌相关组织GH和GHR基因的表达规律进行分析,克隆牛GH和GHR基因的CDS区,构建GH和GHR基因真核表达载体,转染关岭牛原代骨骼肌细胞,从细胞水平检测生长相关因子的表达水平及细胞增殖速率。旨在探索GH、GHR基因对贵州地方黄牛生长发育的影响机理,为贵州地方黄牛的选育和利用提供科学依据。研究结果如下:1、在贵州地方黄牛（关岭牛、思南牛、威宁牛）GH基因第5外显子均检测到2个SNPs,即Exon5-G1570C、Exon5-A1720C。GHR基因共检测出8个SNPs,分别为Exon9-C162T、Exon9-C201T、Exon9-G243C、Exon9-G383A、Exon9-A495T、Exon9-C622T、Exon9-C642T、Exon9-A650C,其中思南牛无Exon9-G243C。相关性分析显示,关岭牛中:GH基因Exon5-G1570C无显着性差异（P>0.05）,而Exon5-A1720C基因型CC在体高、十字部高、胸围、腹围对AC和AA显着（P<0.05）,在体斜长、坐骨端宽分别对AC或AA显着（P<0.05）;思南牛中:Exon5-G1570C基因型GG在体高对GC和CC显着（P<0.05）,而Exon5-A1720C基因型CC则在胸围对AA显着（P<0.05）;威宁牛中:Exon5-G1570C基因型CC在体直长、胸围对GG显着,Exon5-A1720C基因型CC则在体直长、胸围、腰高、坐骨端宽对AA显着（P<0.05）,而AC则在胸宽对AA显着（P<0.05）。GHR基因突变位点在关岭牛和思南牛中均未检测到差异显着,但在威宁牛中,发现Exon9-G243C基因型GC在胸围对GG和CC显着（P<0.05）,Exon9-A650C基因型AA在体斜长、坐骨端宽对CC显着（P<0.05）,在胸深对AC和CC显着（P<0.05）,其余6个SNPs均不显着。表明Exon5-G1570C、Exon5-A1720C、Exon9-G243C、Exon9-A650C这4个SNPs对贵州地方黄牛生长性状具有显着影响,可能作为贵州地方黄牛生长发育的候选分子标记。遗传特性分析表明:除Exon5-A1720C位点在三个牛品种和Exon9-G243C位点在威宁牛中偏离Hardy-Weinberg平衡,其余SNPs均未偏离Hardy-Weinberg平衡,这可能是由于遗传漂变、突变或育种措施等原因导致Hardy-Weinberg不平衡。生物信息学分析表明:黄牛GH、GHR蛋白的相对分子质量分别为27385.45或70872.71、理论等电点为6.90或4.60、均属于跨膜蛋白、亲水性、稳定性较高。突变前后,除Exon9-G383A m RNA二级结构未发生改变,其余SNPs均发生改变。2、GH和GHR基因在贵州地方黄牛相关骨骼肌组织（腰大肌、背最长肌）中均检测到m RNA表达,且表达趋势趋于一致,三个牛品种的GH、GHR基因均高表达于腰大肌,表明GH、GHR基因的表达量与贵州地方黄牛腰大肌生长发育存在一定相关性。3、成功克隆关岭牛GH和GHR基因CDS区,构建p EGFP-N3-GH、p EGFP-N3-GHR真核表达载体,根据测序结果与NCBI的黄牛GH和GHR基因序列进行比较,结果表明成功构建p EGFP-N3-GH、p EGFP-N3-GHR真核表达载体,为细胞转染提供试验基础。4、成功分离纯化培养关岭牛原代骨骼肌细胞,转染重组质粒p EGFP-N3-GH、p EGFP-N3-GHR,利用q RT-PCR方法、CCK-8试剂分别检测转染前后牛骨骼肌细胞生长因子IGF-1、IGF-2 m RNA表达水平和细胞增殖速率,试验结果显示,超表达GH、GHR基因可极显着提高牛骨骼肌细胞生长关键因子IGF-1、IGF-2 m RNA表达量,且4个时期（6 h、12h、24h、48 h）超表达组细胞增殖速率明显高于空白组,达到差异极显着水平（P<0.01）,说明GH、GHR基因可促进关岭牛骨骼肌细胞的增殖分化,对其具有正向调控作用。
曾雪花[2]（2020）在《CTRP3对鹅骨骼肌细胞成肌分化的调控作用》文中研究说明鹅肉是理想的高蛋白、低脂肪和低胆固醇的健康食品,深受消费者青睐,因此开展鹅产肉性能品种改良具有重大的经济效应。探究在鹅骨骼肌组织中发挥重要作用的功能基因,并深入了解鹅骨骼肌生长发育调控的分子机理,是开展遗传育种的重要基础。CTRP3（C1q/tumor necrosis factor-related protein-3）是近期发现的参与肌肉生长发育过程的重要因子,与骨骼肌细胞分化调控密切相关,但其在鹅骨骼肌发育过程中的调控作用尚未明晰。本研究以浙东白鹅为研究对象,包含以下部分研究:（1）通过酶消化法体外分离骨骼肌卫星细胞,利用骨骼肌卫星细胞增殖期特异性标记基因进行免疫荧光鉴定,并且诱导骨骼肌卫星细胞分化,建立在体外细胞培养条件下稳定传代的细胞分化模型;（2）通过qRT-PCR检测鹅胚胎发育过程中CTRP3基因的表达情况,并检测该基因在骨骼肌卫星细胞诱导分化后的表达情况;利用真核表达载体pCDNA3.1构建CTRP3基因过表达载体,通过过表达和沉默CTRP3基因,检测CTRP3及其与分化相关标志基因的mRNA和蛋白表达水平;（3）利用生物信息学软件预测和筛选可能靶向调控CTRP3基因的重要miRNA,通过骨骼肌卫星细胞的转染试验,结合qRT-PCR和Western blot检测候选miRNA以及CTRP3基因的表达,进一步推测候选miRNA对CTRP3基因的调控作用。结果表明,（1）体外成功分离培养鹅骨骼肌卫星细胞,并构建能够稳定传代的体外分化模型,用于后续相关实验研究;（2）成功获得了鹅骨骼肌发育过程CTRP3的表达谱;通过过表达和干扰试验,进一步证实CTRP3能够调控鹅骨骼肌卫星细胞的分化;（3）通过生物信息学预测并结合实验初步分析发现miR-129-5p可能作用于鹅CTRP3基因。
刘维海[3]（2019）在《过表达慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞实验研究》文中进行了进一步梳理研究目的:神经胶质瘤是（Glioma）颅内常见的恶性肿瘤,其侵入性生长的特性为手术治疗带来了巨大的挑战,由于血脑屏障的存在,许多化疗药物及靶向治疗药物也无法完全发挥疗效。Sema4D是Semaphorins信号家族的一员,依靠与跨膜蛋白Plexin-B1的结合发挥影响细胞框架稳定性、促进细胞迁移、诱导T细胞活化、影响B细胞存活、促进血管内皮细胞生成等作用,Sema4D与Plexin-B1的相互作用已被证实影响多种肿瘤细胞的迁移、增殖能力。VX15/2503是一种来源于人体的IGg4单克隆抗体,近年来被广泛应用于抗肿瘤治疗,目前在欧洲地区进行的I期临床实验中取得了令人欣喜的成果。VX15/2503作用于Sema4D与Plexin-B1之间的结合位点,竞争性抑制Sema4D与Plexin-B1的结合,从而起到抑制肿瘤细胞分散、远处转移的能力。毛囊神经嵴干细胞（hair follicle neural crest stem cells,hfNCSCs）位于皮肤内毛囊外根鞘的隆突区,是一种神经嵴来源的干细胞。多数哺乳动物毛囊分布广泛,所以对于hfNCSCs而言,取材的来源不是问题。毛囊隆突部相比于其他来源干细胞的的取材方法更为简便,便于开展大规模的细胞培养。而且,hfNCSCs来源于神经嵴结构,相比于其他成体干细胞要更为高级,所以其癌变倾向也更小。因其取材于本体毛囊,所以免疫反应性以及伦理学问题也相对较小。正因如此,hfNCSCs在基因治疗、组织工程、新药开发中可做为理想的种子细胞。本研究拟采用已构建好的载有VX15/2503基因序列的过表达慢病毒载体CD-100转染hfNCSCs,并对转染后细胞形态进行观察,初步鉴定转染后细胞表达产物,以期为胶质瘤的基因治疗提供一种新的思路。研究方法:（1）采用毛囊Bugle区组织块贴壁培养法对提取的毛囊神经嵴干细胞进行原代培养,在细胞传代后运用免疫荧光法对细胞类型进行鉴定。（2）采用吉凯基因化学技术有限公司构建的含有EGFP绿色荧光蛋白基因的CD-100过表达慢病毒载体对传代培养的毛囊神经嵴干细胞进行转染,倒置荧光显微镜下观察转染情况,并收集转染后细胞培养上清液。（3）对转染完成后细胞培养上清液进行酶联免疫吸附法鉴定其表达产物。结果:（1）从大鼠毛囊外根鞘Bugle区提取的组织块中培养出的毛囊神经嵴干细胞活性良好、细胞游出速度快、增殖能力强,细胞形态较多样,以细长梭型、三角形比较多见,免疫荧光鉴定显示Nestin、p75阳性。（2）对传代细胞进行慢病毒转染,倒置荧光显微镜下可见转染细胞绿色荧光蛋白显色清晰,细胞转染成功率高,转染后细胞活性受影响较小。（3）运用酶联免疫吸附法对转染后细胞培养上清液进行鉴定,结果显示实验组相比对照组蛋白表达量明显上调,初步证实转染成功且产物表达成功。结论:（1）大鼠毛囊外根鞘Bugle区提取的组织块可以培养出毛囊神经嵴干细胞。（2）基于单克隆抗体VX15/2503蛋白序列构建的CD-100过表达慢病毒载体可以成功转染毛囊神经嵴干细胞。（3）毛囊神经嵴干细胞被转染后可成功表达出具有单克隆抗体VX15/2503蛋白序列的产物。
李昊[4]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中认为肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
张萌萌[5]（2018）在《ZBTB16基因过表达对牛肌内前体脂肪细胞增殖与分化的影响研究》文中研究表明在肉用动物生产中,脂肪组织的沉积和分布与肉牛生产效率及经济效益关系密切。其中肌内脂肪含量是影响牛肉品质的关键因素,对牛肉多汁性、嫩度和风味等肉品质具有重要影响,提高肌内脂肪含量是改善牛肉品质的重要途径。ZBTB16基因在动物个体发育、胚胎发生、染色体重构和细胞周期调控等方面发挥着重要的作用。本研究旨在探讨ZBTB16基因对牛肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响,为通过分子育种手段调控脂质沉积奠定理论基础。试验共分为以下四个部分:第一部分:本研究旨在建立西门塔尔杂交牛肌内前体脂肪细胞的体外培养体系。采集成年西门塔尔杂交牛背最长肌处肌肉组织,分离肌内脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶分离获得前体脂肪细胞,进行前体脂肪细胞的原代和传代培养,并对其进行生长曲线的测定、细胞形态观察、油红O染色鉴定及脂肪含量的测定,且采用实时荧光定量RT-qPCR检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBPα、FABP4、ATGL、ADIOQ、HSL及LPL的mRNA在牛肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达。结果显示,分离的原代前体脂肪细胞约6h开始贴壁,细胞贴壁良好,细胞形态多为小梭形或形状不一的三角形,传代后杂质减少,细胞成分单一,第5～11天细胞进入指数生长期,细胞生长曲线近似“细胞形;诱导培养第8天细胞充脂率高,油红O染色呈红色,细胞内脂肪含量显着高于未诱导组（P<0.05）,具有前体脂肪细胞的典型特征。PPARγ、C/EBPα、FABP4、ADIPOQ和ATGL的表达量随着分化过程增强（P<0.05）,HSL的表达量随着分化过程逐渐降低（P<0.05）,而LPL的表达量在细胞分化早期逐渐升高,分化后期逐渐下降（P<0.05）。本研究成功建立了牛肌内前体脂肪细胞的体外培养方法和诱导分化方法,揭示了分化关键基因在此过程中的表达规律,为进一步研究肉牛肌内脂肪沉积和改善肉品质奠定基础。第二部分:本研究旨在研究ZBTB16基因过表达对牛肌内前体脂肪细胞增殖和分化的影响。对牛肌内前体脂肪细胞进行腺病毒载体Ad-ZBTB16（ZBTB16过表达载体）和Ad-GFP（腺病毒空载体）转染,细胞培养24h后,进行荧光拍照并观察细胞形态。结果显示,利用病毒载体（感染复数280）转染细胞后,细胞形态正常,呈纺锤状成纤维细胞样,贴壁牢固,荧光观察转染率在90%以上。RT-qPCR检测病毒转染后第1天的Ad-ZBTB16过表达效率,结果显示,Ad-ZBTB16组ZBTB16的mRNA极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）,约为空白对照组的30倍;Western Blot检测转染后第2天细胞内ZBTB16蛋白表达量,结果显示,Ad-ZBTB16组ZBTB16蛋白水平极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）,表明ZBTB16基因在牛肌内前体脂肪细胞中成功过表达。使用CCK-8测定细胞增殖活性,结果显示,与空白对照组和Ad-GFP组相比,Ad-ZBTB16组并无显着差异（P>0.05）,表明ZBTB16对牛肌内前体脂肪细胞的增殖并无显着影响。利用RT-qPCR和Western Blot方法检测细胞分化第-2、0、2、4、6、8天和成熟脂肪细胞中ZBTB16基因表达量。结果显示,随着牛肌内前体脂肪细胞的分化,细胞内ZBTB16基因mRNA和蛋白表达量均呈显着递增。在前体脂肪细胞诱导分化的第0天对细胞进行腺病毒转染,并于分化第8天进行油红O染色和细胞内GPDH活性的测定。结果显示,Ad-ZBTB16组细胞内脂质含量极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）;Ad-ZBTB16组细胞GPDH活性显着强于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）。另外分别在细胞诱导分化的第1、2和8天,使用RT-qPCR检测脂肪细胞分化关键基因PPARγ、CEBP/α和FABP4的mRNA表达水平;Western Blot检测诱导分化第8天细胞内FABP4和PPARγ的蛋白表达量。结果显示,在诱导分化的第1、2和8天,Ad-ZBTB16组PPARγ、CEBP/α、FABP4的mRNA表达量均极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）,蛋白测定结果与mRNA结果一致。由此可见,ZBTB16过表达对细胞增殖并无显着影响,但是能够显着促进牛肌内前体脂肪细胞的分化。第三部分:本研究旨在探究ZBTB16对牛肌内前体脂肪细胞棕色化及分化相关信号通路的影响。对牛肌内前体脂肪细胞进行腺病毒载体Ad-ZBTB16和Ad-GFP转染后,在诱导分化的第8天,RT-qPCR检测细胞中线粒体ND1基因的表达量,免疫荧光染色观察细胞中线粒体的变化。结果显示,Ad-ZBTB16组线粒体ND1基因表达量显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.05）,与免疫荧光染色结果一致。在诱导分化的第8天,RT-qPCR和Western Blot分别检测细胞中UCP1基因的mRNA表达量和蛋白表达量,以及脂肪细胞棕色化相关的重要基因PRDM16、PGC-1α、CD137、Cox8b、TMEM26、Cidea和Tbx1的mRNA表达量。结果显示,Ad-ZBTB16组UCP1基因的mRNA表达量和蛋白表达量都极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）,Ad-ZBTB16组中PGC-1α、TMEM26和Tbx1的基因mRNA表达量都极显着高于空白对照组和 Ad-GFP 组（P<0.01）,PRDM16、CD137、Cox8b和 Cidea的基因 mRNA表达量显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.05）。为进一步了解ZBTB16对牛肌内前体脂肪细胞促分化的作用机制,在腺病毒转染细胞后的0 min、15 min、1h和24 h提取细胞中的总蛋白,Western Blot检测细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、p44/42 MAPK、p-p44/42 MAPK蛋白表达水平,结果显示,Ad-ZBTB16组中p38 MAPK磷酸化水平无显着变化（P>0.05）,p44/42MAPK磷酸化水平极显着升高（P<0.01）。综上,我们可以初步得出结论,ZBTB16过表达能够促进牛肌内前体脂肪细胞棕色化;p44/42 MAPK信号通路可能参与了ZBTB16基因对牛肌内前体脂肪细胞促分化过程的调节。第四部分:本研究旨在验证前期试验结果,观察比较ZBTB16过表达后对牛皮下前体脂肪细胞分化和棕色化的影响。对牛皮下前体脂肪细胞进行腺病毒载体Ad-ZBTB16和Ad-GFP转染后,在诱导分化的第8天进行油红O染色和细胞中脂质含量的测定。结果显示,Ad-ZBTB16组细胞内脂质含量极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）,与染色观察结果一致。RT-qPCR检测诱导分化第8天细胞中与分化相关基因PPARγ、CEBP/α和FABP4的mRNA表达量,结果显示,Ad-ZBTB16组中PPARγ、CEBP/α和FABP4基因mRNA表达量均极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）。腺病毒载体转染细胞后,在诱导分化的第8天,RT-qPCR检测细胞中线粒体ND1基因的表达量,免疫荧光染色观察细胞中线粒体的变化。结果显示,Ad-ZBTB16组线粒体ND1基因表达量极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）,与免疫荧光染色结果一致。RT-qPCR检测诱导分化第8天细胞中与脂肪细胞棕色化相关重要基因UCP1、PRDM16、PGC-1α、CD137、Cox8b 和TMEM26 的 mRNA 表达量,结果显示,Ad-ZBTB16组细胞中,UCP1、PRDM16和CD137基因的mRNA相对表达量均极显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.01）,PGC-1α、Cox8b和TMEM26的mRNA相对表达量显着高于空白对照组和Ad-GFP组（P<0.05）。结果证明,ZBTB16过表达能够促进牛皮下前体脂肪细胞的分化和棕色化,与前期在牛肌内前体脂肪细胞中ZBTB16过表达结果一致。
雷钏[6]（2015）在《水牛胎儿骨髓间充质干细胞分离培养及基因转染的初步研究》文中提出本研究以水牛胎儿四肢长骨骨髓为分离对象,采用全骨髓贴壁法分离培养水牛胎儿骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）,首先比较了不同胎儿大小和不同血清浓度对水牛胎儿BMSCs增殖效果和分化情况的影响,并对所分离得到的细胞进行生物学特性鉴定；同时探讨了水牛胎儿BMSCs分别培养在常氧条件（20%02）和低氧条件（5%02）下细胞表面抗原、间质标记基因、应力纤维和核型的变化情况；另外,还比较了水牛胎儿BMSCs和水牛胎儿成纤维细胞（BFFs）用不同转染试剂对其转染效果的影响,以期建立一套稳定的水牛胎儿BMSCs分离培养体系和高效转染外源基因的方法。研究结果如下：（1）随着培养基中血清浓度的增加,细胞增殖速度加快；细胞周期检测试验发现15%血清浓度中处于G0/G1期的细胞比例最小（35.8%vs52.4%,P<0.01;35.8%vs51.6%,P<0.01）,10%血清浓度和20%血清浓度的差异不显着（52.4%vs51.6%,P>0.05）；但从细胞形态来看随着血清浓度的增加,胞质内出现钙沉积的细胞数量也随之增多。分离自不同大小胎牛的水牛胎儿BMSCs培养在10%血清浓度的培养基中,细胞形态无明显区别均与典型的MSCs细胞形态相似。细胞生长曲线均成“S”型,增殖速率与细胞代数和胎牛大小有关：10cm以下的水牛胎儿不易分离得到其骨髓,10cm～17cm的胎牛来源的BMSCs在3代以内随着代数的增加增殖速度加快,传至4代后,其增殖速度随着代数的增加而下降；17cm以上胎牛来源的BMSCs其增殖速率,第2代高于第1代细胞,第3代开始下降且低于第1代细胞。（2）对所分离得到的水牛胎儿BMSCs进行生物学特性鉴定发现：RT-PCR检测到第3代细胞表达oct4、sox2、nanog等多能因子和CD73、CD90、CD105等细胞表面抗原。免疫荧光分析发现第3代细胞表达OCT4、Nanog和CD73。流式细胞仪检测结果显示：第3代、第5代、第10代、第15代和第20代细胞的CD29和CD44的阳性率均大于95%,造血干细胞表面抗原CD45和内皮细胞表面抗原CD31的阳性率均小于2%。体外诱导分化试验表明第3代细胞可以被定向诱导分化为成骨细胞和成脂细胞。（3）在常氧培养条件下,水牛胎儿BMSCs随着培养代数的增加,CD29+阳性细胞比例逐渐下降；细胞内应力纤维合成受阻,细胞形态由梭形逐渐转变成多边型;培养至10代后,间质细胞标记（mesenchymal marker）基因：snail、slug、fn1、N-Cadhering mRNA的表达水平下降。然而,在低氧培养条件下,免疫荧光染色结果显示：细胞内的低氧诱导因子1、2（HIF-1、HIF-2）的表达被激活,其下游基因twist的表达量亦随之升高,与此同时间质标记基因snail、slug、fn1、N-Cadhering、coll a的表达量亦随之升高；细胞黏附试验表明,低氧条件下细胞的黏附性较于常氧条件下更小,更具有间质细胞特性；细胞免疫荧光染色亦表明：在低氧条件下,水牛胎儿BMSCs的应力纤维较在常氧下合成更稳定,表达量更高。培养于低氧条件下的P3、P10和P20水牛胎儿BMSCs核型分析统计结果表明随着细胞代数的增加,核型正常率下降,培养于低氧条件下的P10、P20细胞核型正常率高于常氧条件下的（4）在转染试剂相同的情况下,相同代数的水牛胎儿BMSCs转染效率显着高于BFFs（15.6%±0.17>13.3%±0.13,P<0.05;23.9%±0.21>19.1%±0.2 2,P<0.05）;转染同一种细胞的情况下,转染试剂LipofectamineTM 3000的转染效率显着高于Roche（?） X-tremegene（19.1%±0.22>13.3%±0.13,P<0.05 ;23.9%±0.21>15.6%±0.17,P<0.05）。在此基础上利用LipofectamineTM 3000将带有催乳素（PRL）基因的质粒分别转染了相同代数的水牛胎儿BMSCs和BFFs,水牛胎儿BMSCs转染效率同样显着高于BFFs （18.5%±0.19>16.4%士0.14,P<0.05）；PCR检测结果显示转染的细胞有PRL基因整合。结论：（1）从10-17cm长的水牛胎儿长骨分离的骨髓利用全骨髓贴壁法可以分离得到具有间充质干细胞特性的BMSCs;（2）水牛胎儿BMSCs在10%的血清浓度和低氧（5%O2）条件下体外培养,细胞中HIF-Twist轴被激活,其下游靶基因snail、slug、N-Cadherin、fn1和colla1表达量升高,从而有助于BMSCs维持其间质干细胞的特性和更稳定的核型；（3）在质粒和转染试剂相同的情况下,水牛胎儿BMSCs的转染效率显着高于BFFs。
彭丽敏[7]（2015）在《褐牙鲆三种细胞系的建立、鉴定及dnmt3基因表达模式初步分析》文中进行了进一步梳理自Wolf和Quimby在1962年建立第一个永生细胞系,即虹鳟鱼（Onchorynchus mykiss）性腺细胞系RTG-2,随后越来越多的鱼类细胞系被陆续建立。截止到2011年,全世界报道的鱼类细胞系已有275株,但性腺来源的体细胞系和肌肉来源细胞系十分稀少。鱼类性腺体细胞主要包括卵巢的间质细胞、颗粒细胞和鞘膜细胞,以及精巢的Sertoli细胞、Leydig细胞等。性腺体细胞系对于生殖细胞正常的分裂、分化和性腺组织的结构组成等方面具有决定性的作用,尤其是近几年对于生殖干细胞研究的热潮,使得性腺体细胞的体外培养成为发展必然。肌肉是鱼类主要的食用组织,而肌肉细胞系的建立则为进一步研究鱼类肌肉的生长、分化和发育提供了平台,也有助于养殖鱼类快速生长发育机制的研究和应用。鱼类细胞系已广泛应用于病毒学、遗传学、基因调控和功能分析、生理学、内分泌学、资源保护等领域。因此,开展鱼类细胞培养及细胞系建立的研究具有深远意义。鱼类性别决定和性腺分化机制研究一直是热点,而相关的表观遗传修饰-DNA甲基化对其调控作用研究还处于起步阶段。无论在海水鱼还是淡水鱼中,对于DNA甲基转移酶基因dnmt3的研究十分匮乏,环境因子如温度、外源激素等对于甲基化模式的影响更是知之甚少。而dmrt1基因被认为是迄今唯一保守的性别相关基因,近年来其在各种鱼类雌雄个体差异表达谱研究较多,但其甲基化表观遗传修饰在性腺分化中的研究报道还很薄弱。褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）,是名贵的海产养殖品种,在相同养殖成本下,雌性个体比雄性个体生长快、体积大,因而其性别决定和分化是国内外研究的热点。然而由于缺少合适的性腺细胞系,其性别相关形成机制尤其是细胞水平的机理几乎还是空白。且研究证明褐牙鲆三倍体生长明显快于二倍体,2010年已成功实现褐牙鲆三倍体诱导并达到批量化,然而到目前为止,还没有关于褐牙鲆三倍体肌肉生长发育机制的任何研究进展,更没有褐牙鲆三倍体肌卫星细胞体外培养的任何研究报道。本研究首先建立、鉴定了褐牙鲆精巢、卵巢、三倍体褐牙鲆肌肉3个细胞系,并分别对其进行外源质粒转染,以期将这3种细胞系作为体外遗传操作模型运用于外源基因载体的应用研究。同时,克隆得到褐牙鲆甲基转移酶基因dnmt3a和dnmt3b的cDNA全长。利用雌核发育褐牙鲆幼鱼为材料,通过28oC、雌二醇处理,获得遗传雌性（XX）表型雄性或雌性的褐牙鲆。之后检测了dnmt3a和dnmt3b保守区域与dmrt1在雌二醇刺激和性逆转褐牙鲆的表达关联,以期探讨甲基化作用对雄性相关基因dmrt1的调控作用。具体内容及研究结果如下:褐牙鲆精巢细胞系、卵巢细胞系,分别命名为POSC和POOC,目前分别传代到55代和34代。两细胞系都用DMEM/F12基本培养基,FBS添加量为20%,对于EGF生长因子POSC添加15 ng/ml,POOC添加20 ng/ml。POSC和POOC主要细胞类型均为成纤维样;线粒体707bp COI序列分析结果与NCBI褐牙鲆COI序列一致性为99%,证明2种细胞系均来自于褐牙鲆;染色体分析显示POSC和POOC染色体众数都为48,都具有褐牙鲆正常二倍体核型;精巢支持细胞特异抗体Fas-L免疫组化实验证明POSC主要为精巢支持细胞,POOC对卵巢间质特异抗体P450SCC和3β-HSD反应呈现阳性,证明POOC为卵巢间质细胞;脂质体2000分别成功将pEGFP-N3转染到POSC和POOC细胞系,转染效率分别为10%和15%,说明2种细胞系均适宜作为有效的外源基因转化载体,都有望应用于体外遗传操作。三倍体褐牙鲆骨骼肌肌肉细胞系命名为POMSCS（3n）,经过一年的时间目前已传代66代。POMSCS（3n）适宜的生长培养基为MEM,添加20%FBS。其细胞类型主要为梭形或纺锤体样;染色体分析显示POMSCS（3n）的染色体众数为72,具有褐牙鲆正常三倍体核型;肌卫星特异标记基因pax7b RT-PCR扩增和Desmin特异抗体免疫组化实验均证明POMSCS（3n）为骨骼肌肌卫星细胞;通过利用含2%马血清的分化培养基DM诱导POMSCS（3n）细胞分化,再利用DAPI染核发现,分化组（DM培养基）相对于对照组（GM培养基）含有较多的2核甚至3-4核的多核纤维样细胞,证实POMSCS（3n）细胞具有分化潜能,且分化能力强;同样脂质体2000成功将pEGFP-N3转染到该细胞系,转染效率高达20%,说明该细胞系适宜成为有效的外源基因载体,有望成为遗传操作的有利工具。克隆获得褐牙鲆dnmt3a和dnmt3b基因cDNA全长,分别得到dnmt3a基因4个转录本,dnmt3b基因3个转录本,转录本之间相似性较高,都具有甲基转移酶保守结构域PWWP。以雌核发育褐牙鲆幼鱼为材料,通过雌二醇（E2）和高温28oC处理分别得到100%遗传雌表型雌褐牙鲆和100%遗传雌表型雄性逆转褐牙鲆,与预期结果一致。分析E2处理和28oC处理条件下,dmrt1与dnmt3a和dnmt3b表达模式,发现dmrt1与dnmt3a和dnmt3b表达有关联,且dnmt3a与dmrt1关系更为密切,暗示雄性相关基因dmrt1基因表达受甲基转移酶影响,进一步推测褐牙鲆性别决定和分化过程受甲基化作用调控。
周诺[8]（2012）在《PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究》文中研究说明目的牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）技术是利用骨痂的愈合机理产生新骨,是一种内源性的骨组织工程学技术。自其开始应用于颅颌面领域以来,大量基础和临床研究逐渐开展,随着基础研究的深入以及该技术的改进和成熟,牵张成骨在颌面部整形、肿瘤的术后重建以及牙槽种植修复等方面展现出了广阔的应用前景,成为口腔颌面外科领域的研究热点。虽然DO有许多传统手术不可比拟的优势,已被广泛地应用于各种颅颌面的畸形以及四肢短小畸形的矫治,但其较长的牵张和固定时间,限制了其在临床上的广泛应用。因此如何提高DO的新骨形成的速度,缩短其固定时间,减少其并发症的发生和保证新骨形成质量,正成为目前该领域的研究热点。本课题利用hBMP-2作为促进因子,将基因工程和组织工程的技术结合起来,先把hBMP-2转染入兔BMSCs,构建稳定表达hBMP-2的BMSCs,再与组织工程支架材料Pluronic F-127复合,注射入牵张区内,使hBMP-2能在牵张区内稳定持续地起作用,拟让其能促进兔下颌骨的牵张成骨新骨生成。从组织学水平、蛋白水平、基因水平观察和检测牵张间隙内新骨的形成以及改建的情况,为牵张成骨技术在治疗各种颌面部畸形或骨缺损等疾患上的广泛应用奠定基础。方法1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化:取成年健康新西兰大白兔,穿刺双侧胫骨抽取骨髓,通过密度梯度离心法收集细胞后培养,原代培养8-10d后传代培养,按照1:3传代,每3-4天可传代1次,传到第3代时用地塞米松,β-甘油磷酸钠,抗坏血酸配制而成的成骨诱导分化液进行成骨诱导14至21天,并分别用茜素红染色,ELISA以及免疫组化的方法检测其矿化结节的形成和ALP、BGP的表达。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs:取第3代BMSCs,用脂质体介导携带hBMP-2基因的pcDNA3.1质粒转染入BMSCs中,观察GFP表达的情况,MTT法检测转染后细胞的增殖和生长的能力,通过RT-PCR检测瞬时转染后hBMP-2 mRNA的表达。转染后再用G418筛选2周,筛选出稳定转染的阳性细胞,收集备用。将经过筛选后的BMSCs培养4周后,对其进行BMP-2的免疫组织化学以及Western Blot检测。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养:利用Pluronic F-127低温下为水溶液,室温可凝固的特点,冰浴中制备凝胶并消毒后与转染hBMP-2的BMSCs复合,调整细胞浓度,使细胞浓度达到2.5×107个/ml,MTT法检测Pluronic F-127的细胞毒性。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型的建立:取成年健康新西兰大白兔6只,依据其下颌骨的解剖结构设计牵张器。利用传统单线骨皮质切开的术式,在右侧下颌骨第二和三磨牙间行骨切开术,固定牵张器。术后潜伏期为5天,第6天开始牵张,每天牵张2次,每次0.5mm,共牵张7mm,随后固定。于牵张固定2周、6周后分别摄X线片以观察新生骨愈合以及改建情况。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究:取健康新西兰白兔48只随机分为4组,每组12只,于固定期第2天进行干预。实验分组:A组:牵张间隙内注射200 u 1 hBMP-2基因修饰的BMSCs/Pluronic F-127凝胶复合物;B组:注射200μ1 hBMP-2基因修饰的BMSCs液;C组:注射200μ1 BMSCs液;D组:注射200μ1生理盐水。分别于牵张结束固定2w、6w各组处死动物6只,通过大体病理、摄X线片、扫面电镜、HE染色组织切片、免疫组化等手段检测新骨形成和改建情况。结果1.兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化结果:BMSCs培养8-10d后即可长满瓶底,并可传代,传代后细胞生长状态良好,可一直维持BMSCs的典型形态以及生长状态,细胞呈现长梭形形状,旋涡式的排列并可成功向成骨方向诱导。其中钙结节茜素红染色见阳性结节染色。ALP含量逐渐升高,并在2周后达到最高,与未诱导组有显着差异（p<0.05）。BGP免疫组化也呈阳性染色。2.脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的结果:利用脂质体介导携带hBMP-2的pcDNA3.1质粒成功转染BMSCs,转染效率约30%;转染24h能观察到弱荧光表达,48h后荧光强度增强;MTT法显示转染后的BMSCs生长增殖能力无明显变化;RT-PCR也检测到了hBMP-2 mRNA的表达。用G418成功筛选出稳定转染的细胞,该细胞培养4周可用免疫组织化学以及Western Blot方法检测到BMP-2蛋白地稳定表达。3.支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的结果:Pluronic F-127在4℃时为水溶液,37℃下为凝胶状,其与转染hBMP-2基因的BMSCs复合后,MTT检测结果见复合物中的BMSCs生长增殖能力无明显变化（p>0.05）。4.兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的结果:所有的实验动物都成功地完成了手术,术区与口内无穿通,无感染,并能顺利牵张。实验动物全部存活至预定时间,体重皆有不同程度地增加。从手术至取材,应用于体内的牵张器均固位良好,无断裂以及脱钉现象。X线片见新骨形成在时间段有明显变化,符合临床上牵张成骨的成骨规律。动物模型构建成功。5.Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究结果:通过大体病理、X线、扫描电镜和HE染色组织切片观察,新骨形成质量由高到低排列为:A组>B组>C组=D组;通过免疫组化观察并经过灰度值统计软件分析,在固定期第2周和6周A组牵张区骨质量明显高于B组（p<0.05）,B组牵张区骨质量明显高于C组与D组（p<0.05）,在各期C、D两组间无明显差异（p>0.05）。结论1.密度梯度离心法简便、易行,可大量扩增、纯化兔骨髓间充质干细胞,所获细胞经过诱导后可向成骨细胞分化。2.通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因导入BMSCs,并使其获得基因及蛋白的表达。3.组织工程支架材料Pluronic F-127具有低温下为水溶液,室温可凝固的特点,细胞相容性良好。4.兔子不仅性情温顺,饲养方便,对手术耐受性好,易于操作,而且术后愈合效果好,是一个稳定可靠的实验模型动物,可适合较大样本的实验研究。5.hBMP-2基因修饰BMSCs复合可注射骨组织工程支架材料Pluronic F-127移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成,为临床上缩短牵张成骨治疗周期提供了一定的理论依据以及技术参考。
张东[9]（2011）在《转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究》文中认为fat-1基因编码ω-3 PUFAs脱氢酶,可以将PUFAs从ω-6转化为ω-3形式。本研究目的是通过动物转基因技术将fat-1转入绵羊的基因组,再利用动物克隆技术创造能产生ω-3 PUFAs的转基因绵羊,从而培育含ω-3 PUFAs丰富的转基因肉羊新材料。以我区绵羊为对象,摸索了绵羊克隆胚的构建和胚胎移植体系;建立雄性绵羊胎儿的皮肤成纤维细胞系;克隆了秀丽隐杆线虫的fat-1基因,构建目的基因表达载体;再将其转染到绵羊成纤维细胞基因组中,经G418筛选,PCR鉴定后选择阳性细胞建立转基因细胞系;通过体细胞克隆动物技术构建并生产转基因克隆胚并移植,待移植后代出生后鉴定并检测其肌肉中ω-6和ω-3 PUFAs的相对含量及比值;以获得转基因的具有保健功能的肉羊新品种。1.绵羊体细胞克隆体系的优化本实验主要是对体细胞克隆胚移植胚龄的摸索。采用组织块种植法分离培养了三种雌性成年绵羊耳皮肤成纤维细胞系,分三个阶段进行绵羊体细胞克隆体系的优化。第一阶段构建了来源于1号细胞的重构胚272枚,体外发育到桑椹胚期移植入17只受体羊中,有一只妊娠,妊娠率为5.88%,产羔羊1只,经鉴定为克隆羊。第二阶段构建了来源于2号细胞的重构胚683枚,分别在胚胎发育的不同时期进行了胚胎移植,共移植了35只受体羊。结果显示,在3只移入的胚龄是1-细胞期胚胎的羊中,有一只妊娠并产羔1只,经鉴定为克隆羊。第三阶段构建了来源于3号细胞的重构胚197枚,在1-细胞期阶段全部移入了11只受体羊中,结果有两只羊妊娠,妊娠率为18.18%,生产了3只克隆羊,产羔率为27.27%。有效地的重复了第二阶段实验。待克隆羔羊性成熟和体成熟后对其进行了自然交配,成年体细胞克隆羊正常顺产2胎,均是双胞胎。表明获得的克隆羊具有正常的生殖和哺育后代的能力,进一步证明,本实验室建立了相对稳定的的体细胞克隆绵羊技术体系。2.转基因体细胞克隆体系的建立采用组织块种植法分离纯化了约40日龄绵羊胎儿成纤维细胞;克隆了秀丽隐杆线虫fat-1基因,同时对其进行了密码子的优化与合成,构建了pTFK-c和pTFK-o两个真核表达载体。pTFK-o转染绵羊胎儿成纤维细胞,经G418压力筛选后进行转基因细胞的鉴定。结果表明获得的7个细胞克隆中有5个细胞系的基因组中整合有目的基因,对获得的转基因细胞进行染色体数目分析,其核型正常率为69.77% （2n=54）,符合用于转基因克隆的要求。以筛选到的7号转fat-1基因绵羊胎儿成纤维细胞系为核供体,绵羊去核卵母细胞胞质为核受体生产转基因克隆胚。采用抽吸法共回收卵母细胞4881枚,成熟培养18h成熟率为72.87%。实验共进行去核操作绵羊卵母细胞3557枚,用于融合的卵数是3305枚,共融合3040枚,融合率为91.39%。共分三组移植了处于1-细胞期的2909枚胚胎到230只羊体内,1组移植了146只受体羊,妊娠5只,妊娠率为3.42%,产羔5只,产羔率为3.42%;2组移植了60只受体羊,妊娠18只,妊娠率为30%,产羔19只,产羔率为31.67%;3组移植了24只羊,妊娠5只,妊娠率为20.83%,产羔6只,产羔率为25%。后2组实验结果进一步优化了体细胞克隆技术体系。3.转fat-1基因克隆绵羊的出生与鉴定通过实验共产羔30只,其中19只存活。对获得的30只中的29只转基因克隆羔羊进行基因组水平检测,结果显示有27只羔羊基因组中含有目的基因。克隆羊肌肉组织中ω-6和ω-3PUFAs的相对含量检测结果显示,在检测的23只羊中有18只羊都表达了有活性的脂肪酸脱氢酶,其ω-6/ω-3 PUFAs比值都有不同程度的降低,平均值为16.45,其ω-3 PUFAs的平均值为0.194,和对照公羊平均值0.147相比提高了31.97%,有效的改善了绵羊体内ω-6和ω-3 PUFAs的相对比例和含量。
陈冬梅[10]（2011）在《不同转录因子组合诱导成年牛体细胞为iPS细胞的研究》文中研究指明本研究用逆转录病毒将牛Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc四个转录因子导入牛皮肤成纤维细胞,首次成功获得重编程牛iPS细胞,经检测这些细胞具有多能干细胞的生长特征和多向分化能力。为了研究相关转录因子对诱导细胞重编程的必要性,本试验从四因子组合中依次减少转录因子的数量,以避免或减少细胞的癌变,分析了3因子（Oct4,Sox2和Klf4）、2因子（Oct4和Sox2）和1因子（Oct4）诱导细胞重编程的能力和效率。（1）.牛Oct4与c-Myc基因克隆及逆转录病毒表达载体的构建通过RT-PCR方法,从Holstein奶牛胎儿原始生殖嵴总RNA中克隆了牛Oct4和c-Myc基因ORF全长。与GenBank中牛Oct4和c-Myc基因编码序列进行BLAST分析,同源性分别为99.4%和99.8%。氨基酸序列同源性分别为98.9%和99.5%。通过酶切位点连接入逆转录病毒载体pMSCV,成功构建的重组质粒分别为pMSCV-Oct4（MO）和pMSCV-Myc（MC）。重组质粒MO与MC经测序分析,表明克隆目的基因序列正确。（2）.感染性重组逆转录病毒的包装与鉴定在用重组质粒MO和MC转染包装细胞的同时,用带绿色荧光蛋白的pMSCVneo-IRES-GFP质粒作对照,即用同样的浓度和方法共同转染包装细胞PT67,可观察到有50%左右表达绿色荧光蛋白的发光细胞。用流式细胞仪分析瞬时转染后的PT67-Oct4和PT67-Myc两株细胞中发荧光的细胞各占53.1%和51.3%。用TRIzol LSReagent提取病毒上清总RNA,进行RT-PCR扩增。分别获得Oct4和c-Myc基因单一的1038bp和1320bp大小的条带。PT67-Oct4和PT67-Myc细胞培养液经磷钨酸负染后透射电镜观察,可见多个病毒颗粒。收集细胞培养上清感染NIHA3T3细胞,测得病毒滴度分别为8.83×107cfu/mL和8.50×107cfu/mL,说明试验获得高感染力的逆转录病毒。（3）.四个转录因子组合诱导成年牛皮肤成纤维细胞重编程为多能干细胞试验用四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc）共同感染牛皮肤成纤维细胞,以hAM为饲养层,添加hLIF和bFGF的iPS细胞培养液获得ES细胞样克隆。经检测表达碱性磷酸酶；通过定量PCR方法,分析其多能性基因表达量与PGCs相当,在感染60天后已经检测不到外源基因的表达。免疫细胞化学检测,表达SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81,以及表达干细胞相关的特异性蛋白OCT4, NANOG, SOX2与端粒酶。Western blotting分析,表达Nanog, Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4蛋白。通过亚硫酸氢盐-基因组测序法,检测NANAOG和OCT4基因启动子区甲基化水平处于低甲基化状态,说明多能性基因重新被激活参与基因的表达调控。根据传代计数结果,所得两株牛iPS细胞均呈现指数增长,80天内分别获得细胞数1.5×1011和2.4×1011个。本实验得到的2株牛iPS细胞已经传至第30代冻存。在体外传代大于150天,其形态仍与ES细胞相似,未出现分化迹象。分析第20代BiPSO细胞的核型,具有正常的60XX二倍体核型。（4）.诱导性多能干细胞分化多能性检测通过类胚体介导体外分化,在EB周围已分化细胞中检测出表达βⅢ-tubulin, Nestin和GFAP等标志的神经样细胞,α-Actin标志的心肌样细胞,波形蛋白（Vimentin）标志的成纤维样细胞,α-甲胎蛋白标志的肝上皮样细胞,CK7标志的胃肠上皮细胞和PDX-1为标志的胰岛样细胞。RT-PCR对三胚层细胞特异性基因进行分子生物学检测,表达三个胚层细胞的特异性条带,包括Nestin和βⅢ-tubulin（外胚层）；GATA4和ACTA2（中胚层）；Keratin-14、PDX-1和AFP（内胚层）。说明牛iPS细胞有向三个胚层细胞分化的潜能。对牛iPS细胞用DMSO诱导液进行诱导分化,能提高其体外分化为心肌细胞的效率。用RA诱导液进行诱导分化,能在体外分化出成熟的神经细胞。在裸鼠体内能够形成畸胎瘤,H.E.染色显示,有包含三胚层在内的各种组织,如血管、肌肉、软骨,内脏上皮和神经组织。说明牛iPS细胞在体内有向三个胚层细胞分化的潜能。（5）.减少诱导因子对诱导牛多能干细胞的影响用Oct4, Sox2和KLF4三因子诱导细胞重编程试验显示,在不用c-Myc转录因子也能够获得牛iPS细胞,但重编程效率降低,与四因子诱导时差异极显着（P<0.01）。经过RT-PCR和免疫细胞化学鉴定重编程的细胞表达OCT4, SOX2, NANOG转录因子及SSEA-3和SSEA-4表面抗原。但没有检测到端粒酶的激活。体外分化实验显示检测到神经样细胞,骨骼肌样细胞,腔上皮样细胞。RT-PCR检测显示除了AFP和Nestin,有多种分化基因的表达。体外分化试验显示注入裸鼠皮下的重编程细胞形成畸胎瘤,组织切片观察到肌肉组织和血管样组织,没有观察到外胚层和内胚层的组织结构。说明该株牛iPS细胞有分化三胚层细胞的能力,但不完全。可能三因子诱导的试验只获得了部分重编程的iPS细胞。用Oct4和Sox2两因子诱导细胞重编程时重编程效率极低,不能获得有效传代的牛iPS细胞。只用Oct4一因子诱导细胞重编程的试验没有获得AP染色阳性的iPS细胞集落。
二、成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究（论文提纲范文）
（1）GH和GHR基因对贵州地方黄牛生长性能影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究背景 |
| 2 贵州地方黄牛品种介绍 |
| 2.1 关岭黄牛 |
| 2.2 思南黄牛 |
| 2.3 威宁黄牛 |
| 2.4 贵州地方黄牛研究进展 |
| 3 GH基因研究概述 |
| 3.1 GH基因结构特点 |
| 3.2 GH基因研究现状 |
| 4 GHR基因研究概述 |
| 4.1 GHR基因结构特点 |
| 4.2 GHR基因研究现状 |
| 5 研究的目的和意义 |
| 第二章 贵州地方黄牛GH和GHR基因多态性及其与生长性状的关联研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 试验仪器 |
| 1.3 试验试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 血液基因组DNA提取 |
| 2.2 引物设计及PCR扩增 |
| 2.3 筛选多态位点 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基因组DNA检测结果 |
| 3.2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果 |
| 3.3 GH和 GHR基因DNA混池PCR产物测序结果 |
| 3.4 GH和 GHR基因SNPs位点分析 |
| 3.5 GH和 GHR基因SNPs位点的遗传学分析 |
| 3.6 GH和 GHR基因SNPs位点与生长性状相关性分析 |
| 3.7 黄牛GH生物信息学分析 |
| 3.8 黄牛GHR生物信息学分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GH基因的多态性及其与生长性状的关联分析 |
| 4.2 GHR基因的多态性及其与生长性状的关联分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 GH和GHR基因在贵州地方黄牛中的表达规律研究 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 动物材料及样品采集 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 组织RNA的提取(Trizol法) |
| 2.2 第一链cDNA的合成 |
| 2.3 GH、GHR基因荧光定量PCR引物的设计 |
| 2.4 荧光定量PCR反应条件的探索与优化 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 扩增产物特异性检测 |
| 3.2 实时荧光定量PCR反应的特异性分析 |
| 3.3 GH和GHR基因表达差异分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 贵州地方黄牛GH和GHR基因表达载体的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验样品 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 关岭牛骨骼肌组织总RNA的提取和c DNA的合成 |
| 2.2 关岭牛GH和 GHR基因CDS区的克隆 |
| 2.3 p EGFP-N3-GH、pEGFP-N3-GHR真核表达载体的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒pUCM-T-GH、pUCM-T-GHR的鉴定 |
| 3.2 重组质粒pEGFP-N3-GH、pEGFP-N3-GHR的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 关岭牛骨骼肌细胞的分离、培养及生长相关因子的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 原代骨骼肌细胞的分离培养 |
| 2.2 骨骼肌细胞传代培养 |
| 2.3 骨骼肌细胞的诱导鉴定 |
| 2.4 重组质粒的瞬时转染 |
| 2.5 转染前后细胞总RNA的提取 |
| 2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.7 CCK-8检测超表达前后细胞增殖速率 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 骨骼肌细胞生长状态观察 |
| 3.2 骨骼肌细胞的鉴定 |
| 3.3 重组质粒转染细胞 |
| 3.4 超表达GH与GHR基因对生长相关基因表达的影响 |
| 3.5 超表达GH、GHR对细胞增殖的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）CTRP3对鹅骨骼肌细胞成肌分化的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述 |
| 1 骨骼肌及骨骼肌卫星细胞的研究 |
| 1.1 骨骼肌生长发育基本过程 |
| 1.2 骨骼肌发育相关因子的研究现状 |
| 1.3 骨骼肌生长发育相关信号通路 |
| 1.4 骨骼肌卫星细胞概述 |
| 2 鹅骨骼肌发育相关基因的研究进展 |
| 3 CTRP3基因相关研究进展 |
| 4 miRNA与骨骼肌发育的研究进展 |
| 4.1 miRNA生物形成与作用机制 |
| 4.2 miRNA与骨骼肌发育 |
| 5 本研究的目的、意义及内容 |
| 5.1 本研究的目的及意义 |
| 5.2 本研究的主要内容 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 鹅骨骼肌卫星细胞的分离鉴定和诱导分化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂与仪器 |
| 1.2 实验样品 |
| 1.3 应用的分析软件 |
| 1.4 实验试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 鹅骨骼肌卫星细胞分离培养 |
| 2.2 鹅骨骼肌卫星细胞传代培养及换液 |
| 2.3 免疫荧光鉴定鹅肌卫星细胞 |
| 2.4 鹅肌卫星细胞分化模型的构建 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 鹅肌卫星细胞的分离培养 |
| 3.2 未分化鹅骨骼肌卫星细胞的鉴定 |
| 3.3 诱导分化后鹅骨骼肌卫星细胞的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鹅骨骼肌卫星细胞的分离培养 |
| 4.2 鹅骨骼肌卫星细胞的鉴定 |
| 4.3 鹅骨骼肌卫星细胞的诱导分化 |
| 5 小结 |
| 第二章 CTRP3对鹅骨骼肌细胞分化的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂与仪器 |
| 1.2 实验样品 |
| 1.3 应用的分析软件 |
| 1.4 实验试剂的配置 |
| 1.5 实验所用载体和菌株 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CTRP3基因在鹅骨骼肌发育过程中的表达情况 |
| 2.2 过表达载体的构建 |
| 2.3 siRNA合成 |
| 2.4 过表达载体及siRNA转染相关试验 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 浙东白鹅腿肌组织总RNA提取结果 |
| 3.2 鹅早期发育过程中CTRP3的表达谱 |
| 3.3 过表达载体构建及siRNA筛选 |
| 3.4 si RNA干扰CTRP3 抑制骨骼肌卫星细胞的分化 |
| 3.5 过表达CTRP3促进骨骼肌卫星细胞的分化 |
| 3.6 CTRP3 基因对Notch信号通路相关基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CTRP3对鹅骨骼肌卫星细胞分化的影响 |
| 4.2 Notch 信号通路与骨骼肌发育 |
| 5 小结 |
| 第三章 鹅骨骼肌细胞中靶向调控CTRP3 的潜在mi RNA预测分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂与仪器 |
| 1.2 实验样品 |
| 1.3 实验所用主要分子生物学软件、数据库和网站 |
| 1.4 实验试剂的配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 靶向CTRP3 基因的mi RNA的预测和筛选 |
| 2.2 miRNA模拟物的合成 |
| 2.3 miRNA定量引物的设计(茎环法) |
| 2.4 miRNA模拟物在骨骼肌卫星细胞中的表达量检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 生物信息学初步预测候选靶向鹅CTRP3的mi RNA |
| 3.2 miRNA模拟物对鹅骨骼肌卫星细胞分化的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 miRNA的预测及筛选 |
| 4.2 miRNA对骨骼肌发育的调控研究 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 1 本实验中的主要研究结论 |
| 2 本研究的创新点 |
| 3 本实验中的不足以及后续实验计划 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 在校期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）过表达慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要实验设备 |
| 2.1.4 载体及目的基因信息 |
| 2.1.5 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 毛囊神经嵴干细胞的分离培养及鉴定 |
| 2.2.2 过表达慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞 |
| 2.3 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 hfNCSCs分离培养及鉴定 |
| 3.1.1 毛囊神经嵴干细胞原代培养 |
| 3.1.2 毛囊神经嵴干细胞传代培养 |
| 3.1.3 毛囊神经嵴干细胞免疫荧光鉴定 |
| 3.2 慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞及产物初步鉴定 |
| 3.2.1 慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞后细胞形态观察 |
| 3.2.2 慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞产物表达初步检测 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 过表达慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞 |
| 4.2 过表达慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞表达产物检测 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢病毒载体研究进展 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间成果 |
| 致谢 |
（4）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）ZBTB16基因过表达对牛肌内前体脂肪细胞增殖与分化的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1 肌内脂肪细胞概述 |
| 1.1 肌内脂肪细胞的特性 |
| 1.2 脂肪细胞分化相关基因 |
| 2 p38 MAPK和p44/42 MAPK信号通路概述 |
| 2.1 p38 MAPK和p44/42 MAPK信号通路在脂肪分化和代谢中的作用 |
| 3 ZBTB16相关研究进展 |
| 3.1 ZBTB16的结构与分布 |
| 3.2 ZBTB16基因的调控 |
| 3.3 ZBTB16基因的功能 |
| 3.4 ZBTB16基因在脂肪细胞分化中的作用 |
| 4 脂肪细胞棕色化 |
| 4.1 棕色脂肪细胞 |
| 4.2 棕色化相关基因 |
| 5.研究目的及内容 |
| 第一章 牛肌内前体脂肪细胞的分离培养及分化相关基因的表达规律研究 |
| 1 材料与设备 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及配方 |
| 1.3 试验仪器及器材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 前体脂肪细胞的体外培养 |
| 2.2 生长曲线绘制 |
| 2.3 细胞诱导分化 |
| 2.4 油红O染色及细胞内脂质含量测定 |
| 2.5 RNA提取、纯化及基因表达检测 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 牛前体脂肪细胞原代培养和传代培养的形态学观察 |
| 3.2 CCK-8比色法绘制牛前体脂肪细胞的生长曲线 |
| 3.3 细胞内脂肪含量测定 |
| 3.4 牛前体脂肪细胞分化过程中标志基因表达情况 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二章 ZBTB16过表达对牛肌内前体脂肪细胞增殖与分化的影响 |
| 1 材料与设备 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及配方 |
| 1.3 试验仪器及器材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 牛肌内前体脂肪细胞的体外培养 |
| 2.2 Ad-ZBTB16腺病毒载体的验证 |
| 2.3 CCK-8检测细胞增殖活性 |
| 2.4 牛肌内前体脂肪细胞的诱导分化 |
| 2.5 油红O染色及细胞内脂质含量测定 |
| 2.6 GPDH活性测定 |
| 2.7 RNA的提取、纯化及基因表达检测 |
| 2.8 Western blot |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Ad-ZBTB16过表达载体的检测与验证 |
| 3.2 ZBTB16过表达对牛肌内前体脂肪细胞增殖的影响 |
| 3.3 ZBTB16过表达对牛肌内前体脂肪细胞分化的影响 |
| 3.4 牛肌内前体脂肪细胞分化过程中ZBTB16表达水平 |
| 3.5 ZBTB16过表达对脂肪细胞分化关键基因表达的影响 |
| 3.6 ZBTB16过表达对脂肪细胞分化关键基因的蛋白表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 ZBTB16过表达诱导牛肌内前体脂肪细胞的棕色化 |
| 1 材料与设备 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及配方 |
| 1.3 试验仪器及器材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 牛肌内前体脂肪细胞的体外培养 |
| 2.2 腺病毒载体转染 |
| 2.3 细胞的诱导分化 |
| 2.4 RT-qPCR检测棕色脂肪相关标志基因mRNA表达量 |
| 2.5 Western Blot检测棕色化过程中标志蛋白UCP1及分化相关信号通路蛋白磷酸化水平 |
| 2.6 线粒体免疫荧光分析 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZBTB16过表达对牛肌内脂肪细胞中ND1基因表达的影响 |
| 3.2 ZBTB16过表达对牛肌内脂肪细胞中棕色脂肪标志基因UCP1基因表达的影响 |
| 3.3 ZBTB16过表达对牛肌内脂肪细胞中棕色化相关基因表达的影响 |
| 3.4 免疫荧光染色分析ZBTB16过表达对牛肌内脂肪细胞中线粒体的影响 |
| 3.5 ZBTB16过表达对牛肌内脂肪细胞中分化相关信号通路的影响 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 ZBTB16过表达对牛皮下前体脂肪细胞分化和棕色化的影响 |
| 1 材料和设备 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 主要试剂及配方 |
| 1.3 试验仪器及器材 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 牛皮下前体脂肪细胞的体外培养 |
| 2.2 腺病毒载体转染 |
| 2.3 细胞的诱导分化 |
| 2.4 RT-qPCR检测脂肪分化及棕色化相关基因mRNA表达量 |
| 2.5 油红O染色及细胞内脂质含量测定 |
| 2.6 线粒体免疫荧光分析 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZBTB16过表达对牛皮下前体脂肪细胞分化的影响 |
| 3.2 ZBTB16过表达对牛皮下脂肪细胞中线粒体基因ND1表达的影响 |
| 3.3 免疫荧光染色分析ZBTB16过表达对牛皮下前体脂肪细胞中线粒体的影响 |
| 3.4 ZBTB16过表达对牛皮下脂肪细胞中棕色化相关基因表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
（6）水牛胎儿骨髓间充质干细胞分离培养及基因转染的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 骨髓间充质干细胞的分离培养 |
| 1.1 骨髓间充质干细胞的来源 |
| 1.2 成年MSCs和新生儿或胎儿MSCs |
| 1.3 MSCs的鉴定 |
| 2 BMSCs在培养过程中的间质上皮转变的分子机制及其调控 |
| 2.1 BMSCs在体外培养过程中的MET |
| 2.2 低氧条件与EMT |
| 2.3 低氧条件对BMSCs的影响 |
| 3 BMSCs的应用 |
| 3.1 BMSCs应用于核移植 |
| 第二章 水牛胎儿骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 水牛胎儿骨髓间充质干细胞和胎儿成纤维细胞原代培养 |
| 1.6 水牛胎儿骨髓间充质干细胞传代培养 |
| 1.7 水牛胎儿骨髓间充质干细胞冻存与复苏 |
| 1.8 水牛胎儿骨髓间充质干细胞的形态观察及生物学特性研究 |
| 1.9 水牛胎儿骨髓间充质干细胞的生物学特性鉴定 |
| 1.10 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 水牛胎儿BMSCs的原代培养 |
| 2.2 不同大小水牛胎儿对BMSCs分离效果和细胞增殖的影响 |
| 2.3 不同血清浓度对水牛胎儿BMSCs增殖和分化的影响 |
| 2.4 水牛胎儿BMSCs的生物学特性鉴定 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 低氧条件对水牛胎儿BMSCs培养效果的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 1.5 水牛胎儿BMSCs常氧条件下细胞表面抗原、间质标记基因、应力纤维表达变化和核型的研究 |
| 1.6 低氧条件对水牛胎儿BMSCs培养效果的影响 |
| 2 结果 |
| 2.1 水牛胎儿BMSCs常氧条件下细胞表面抗原变化的研究 |
| 2.2 水牛胎儿BMSCs常氧条件下应力纤维变化的研究 |
| 2.3 水牛胎儿BMSCs常氧条件下间质标记基因表达量变化的研究 |
| 2.4 水牛胎儿BMSCs常氧条件下核型变化的研究 |
| 2.5 水牛胎儿BMSCs低氧条件下的研究 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 水牛胎儿BMSCs转染条件的摸索 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 水牛胎儿BMSCs的分离和培养 |
| 1.5 水牛胎儿成纤维细胞原代培养 |
| 1.6 水牛胎儿成纤维细胞传代培养 |
| 1.7 无内毒质粒的制备 |
| 1.8 水牛胎儿BMSCs和BFFs的转染试验 |
| 1.9 流式细胞仪检测细胞转染效率 |
| 1.10 PCR检测 |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 转染条件的摸索 |
| 2.2 转染PRL目的基因 |
| 3 分析与讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（7）褐牙鲆三种细胞系的建立、鉴定及dnmt3基因表达模式初步分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.鱼类细胞培养研究进展及应用 |
| 1.1 鱼类细胞培养及细胞系建立概况 |
| 1.2 鱼类细胞培养技术与方法 |
| 1.2.1 鱼类细胞原代培养 |
| 1.2.2 鱼类细胞传代培养 |
| 1.3 鱼类细胞体外生长所需的条件 |
| 1.3.1 鱼类细胞培养营养组成 |
| 1.3.2 鱼类细胞培养生长条件 |
| 1.4 鱼类细胞冻存和复苏 |
| 1.5 鱼类细胞系鉴定 |
| 1.5.1 形态学鉴定 |
| 1.5.2 染色体核型鉴定 |
| 1.5.3 分子生物学方法鉴定 |
| 1.5.4 细胞生长状态鉴定 |
| 1.6 鱼类细胞培养过程中的交叉污染和过度传代问题 |
| 1.7 鱼类细胞系的应用价值 |
| 1.7.1 鱼类细胞系在病毒学中的应用 |
| 1.7.2 鱼类细胞系在毒理学中的应用 |
| 1.7.3 鱼类细胞系在免疫学中的应用 |
| 1.7.4 鱼类细胞系在生理学中的应用 |
| 1.7.5 鱼类细胞系在内分泌学中的应用 |
| 1.7.6 鱼类细胞系在遗传学和资源保护中的应用 |
| 1.7.7 鱼类细胞系在基因筛选与功能分析中的应用 |
| 2.鱼类性别决定 |
| 2.1 遗传型性别决定 |
| 2.1.1 鱼类性染色体决定类型 |
| 2.1.2 鱼类性别相关基因 |
| 2.2 外源因子在鱼类性别分化中的作用 |
| 2.2.1 温度对鱼类性别分化的影响 |
| 2.2.2 外源性激素对鱼类性别分化的影响 |
| 3.鱼类性别相关的表观遗传学研究 |
| 3.1 表观遗传学的定义 |
| 3.2 DNA甲基化研究进展 |
| 4.研究背景及目的和意义 |
| 第二章 褐牙鲆三种细胞系的建立、鉴定及初步应用 |
| 1.褐牙鲆精巢细胞系的建立、鉴定及应用 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验试剂与仪器设备 |
| 1.2.3 原代培养 |
| 1.2.4 传代培养 |
| 1.2.5 细胞冻存与复苏 |
| 1.2.6 细胞生长曲线的绘制 |
| 1.2.7 染色体核型分析 |
| 1.2.8 细胞系的物种鉴定 |
| 1.2.9 细胞系的分子鉴定 |
| 1.2.10 细胞系的免疫组化分析 |
| 1.2.11 利用pEGFP-N3质粒进行细胞系转染效率测定 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 原代培养和传代培养 |
| 1.3.2 细胞系的冻存和复苏 |
| 1.3.3 细胞生长曲线的测定 |
| 1.3.4 细胞染色体核型分析 |
| 1.3.5 细胞系的物种鉴定 |
| 1.3.6 细胞系的分子鉴定 |
| 1.3.7 细胞系的免疫细胞化学分析 |
| 1.3.8 pEGFP-N3质粒转染细胞系 |
| 1.4 讨论 |
| 2.褐牙鲆卵巢细胞系的建立、鉴定及应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂与仪器设备 |
| 2.2.3 原代培养 |
| 2.2.4 传代培养 |
| 2.2.5 细胞冻存与复苏 |
| 2.2.6 细胞生长曲线的绘制 |
| 2.2.7 染色体核型分析 |
| 2.2.8 细胞系的物种鉴定 |
| 2.2.9 细胞系的免疫组化分析 |
| 2.2.10 利用pEGFP-N3质粒转染对细胞系进行应用测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 原代培养和传代培养 |
| 2.3.2 细胞系的冻存和复苏 |
| 2.3.3 细胞生长曲线的测定 |
| 2.3.4 细胞染色体核型分析 |
| 2.3.5 细胞系的物种鉴定 |
| 2.3.6 细胞系的免疫细胞化学分析 |
| 2.3.7 pEGFP-N3质粒转染细胞系 |
| 2.4 讨论 |
| 3.三倍体褐牙鲆肌肉细胞系的建立、鉴定及应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂与仪器设备 |
| 3.2.3 原代培养 |
| 3.2.4 传代培养 |
| 3.2.5 细胞冻存与复苏 |
| 3.2.6 细胞生长曲线的绘制 |
| 3.2.7 染色体核型分析 |
| 3.2.8 细胞系的分子鉴定 |
| 3.2.9 细胞系的免疫组化分析 |
| 3.2.10 三倍体褐牙鲆肌肉细胞系分化潜能检测 |
| 3.2.11 pEGFP-N3质粒转染对细胞系进行应用测定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 原代培养和继代培养 |
| 3.3.2 细胞系的冻存和复苏 |
| 3.3.3 细胞生长曲线的测定 |
| 3.3.4 三倍体肌肉细胞系染色体分析 |
| 3.3.5 细胞系的分子鉴定 |
| 3.3.6 细胞系的免疫细胞化学分析 |
| 3.3.7 细胞分化潜能检测 |
| 3.3.8 pEGFP-N3质粒转染细胞系 |
| 3.4 讨论 |
| 第三章 褐牙鲆dnmt3a和dnmt3b基因克隆与表达模式分析 |
| 1.甲基转移酶基因dnmt3a和dnmt3b的克隆 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 仪器设备 |
| 1.2.4 感受态细胞的制备（见附录 1） |
| 1.2.5 Dnmt3a和dnmt3b基因中间片段的获得 |
| 1.2.6 Dnmt3a和dnmt3b基因cDNA全长的获得 |
| 1.2.7 生物信息学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 Dnmt3a和dnmt3b基因序列分析 |
| 1.3.2 Dnmt3a和Dnmt3b蛋白理化性质初步分析 |
| 1.3.3 Dnmt3a和dnmt3b不同转录本之间氨基酸序列比对分析 |
| 1.3.4 Dnmt3a和dnmt3b基因的系统发育进化分析 |
| 2.褐牙鲆dnmt3a、dnmt3b与dmrt1基因的表达及相关性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 雌核发育褐牙鲆幼苗激素和高温处理 |
| 2.2.5 褐牙鲆幼鱼性腺总RNA提取和cDNA模板制备 |
| 2.2.6 Dnmt3a和dnmt3b以及dmrt1在褐牙鲆幼鱼性腺分化期的表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 雌二醇和高温处理后雌核发育褐牙鲆的性别比例分析 |
| 2.3.2 Dmrt1与dnmt3a和dnmt3b在雌核发育褐牙鲆幼鱼性腺分化期的差异表达谱 |
| 2.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 全文前言 |
| 第一章: 兔骨髓间充质干细胞体外培养以及成骨定向诱导分化的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第二章: 脂质体介导的hBMP-2转染兔BMSCs的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第三章: 支架材料Pluronic F-127凝胶与兔BMSCs复合培养的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图表 |
| 6. 讨论 |
| 第四章: 兔下颌骨牵张成骨动物模型建立的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 第五章: Pluronic F-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料和器械 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 附图 |
| 6. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 1. 颌骨牵张成骨研究进展 |
| 参考文献 |
| 2. 可注射支架材料在骨和软骨组织工程中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间所发表论文 |
| 攻读博士学位期间所主持的科研项目及课题 |
（9）转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 动物转基因技术的研究历史 |
| 1.1.1 动物转基因技术研究的初级阶段 |
| 1.1.2 动物转基因技术研究的初级应用阶段 |
| 1.1.3 动物转基因技术研究的高潮阶段 |
| 1.1.4 小结 |
| 1.2 转基因动物制作方法及其发展概况 |
| 1.2.1 显微注射法 |
| 1.2.2 逆转录病毒载体介导的转基因 |
| 1.2.3 精子介导的基因转移 |
| 1.2.4 生殖干细胞法 |
| 1.2.5 胚胎干细胞介导的转基因 |
| 1.2.6 iPS 介导转基因技术 |
| 1.2.7 基因打靶介导的转基因技术 |
| 1.2.8 化学诱变介导的基因敲除技术 |
| 1.2.9 RNA 干涉介导的基因沉默技术 |
| 1.2.10 锌指核酸酶介导的基因沉默技术 |
| 1.2.11 转座子介导的基因转移 |
| 1.2.12 转基因体细胞克隆法 |
| 1.3 动物转基因技术的应用 |
| 1.3.1 动物转基因技术在基础研究领域的应用 |
| 1.3.2 动物转基因技术在生物药剂和生物材料生产中的应用 |
| 1.3.3 动物转基因技术在农业生产中的应用 |
| 1.3.4 动物转基因技术在环保方面的应用 |
| 1.3.5 动物转基因技术在应用方面存在的问题 |
| 1.4 ω-3 PUFAs 的研究概况 |
| 1.4.1 ω-3 PUFAs 的研究背景 |
| 1.4.2 ω-3 PUFAs 的生物学功能 |
| 1.5 小结 |
| 2 绵羊体细胞克隆体系的优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 动物材料 |
| 2.1.2 实验设备 |
| 2.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊耳皮肤成纤维细胞的分离培养 |
| 2.2.2 绵羊耳皮肤成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 2.2.3 绵羊耳皮肤成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 2.2.4 绵羊卵母细胞的采集和体外成熟培养 |
| 2.2.5 供体细胞的准备 |
| 2.2.6 受体卵母细胞的准备 |
| 2.2.7 核移植制备重构胚 |
| 2.2.8 重构胚的融合 |
| 2.2.9 重构胚的激活和发育培养 |
| 2.2.10 胚胎移植 |
| 2.2.11 妊娠的确定和克隆羔羊的接产 |
| 2.2.12 克隆羔羊的鉴定 |
| 2.2.13 克隆羊生殖能力检测 |
| 2.2.14 数据统计 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊耳皮肤成纤维细胞的分离培养 |
| 2.3.2 绵羊耳皮肤成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 2.3.3 绵羊耳皮肤成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 2.3.4 绵羊卵母细胞的采集与体外成熟 |
| 2.3.5 克隆胚构建中融合条件的摸索 |
| 2.3.6 绵羊体细胞克隆胚的构建、体外发育和胚胎移植 |
| 2.3.7 克隆羔羊的接产及其鉴定 |
| 2.3.8 克隆羊生殖能力检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 卵巢的运输和保存 |
| 2.4.2 卵母细胞体外成熟与重构胚的制作 |
| 2.4.3 克隆胚移植胚龄的摸索 |
| 3 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 活体材料 |
| 3.1.2 实验设备 |
| 3.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 绵羊胎儿性别的鉴定 |
| 3.2.2 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 3.2.3 绵羊胎儿成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 3.2.4 绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 绵羊胎儿的性别鉴定 |
| 3.3.2 绵羊胎儿成纤维细胞的分离培养 |
| 3.3.3 绵羊胎儿成纤维细胞生长曲线的测定 |
| 3.3.4 绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 绵羊胎儿成纤维细胞的基因转染 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验设备 |
| 4.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 转fat-1 基因表达载体的构建 |
| 4.2.2 绵羊胎儿成纤维细胞 G418 敏感度的研究 |
| 4.2.3 绵羊胎儿皮肤成纤维细胞的基因转染 |
| 4.2.4 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的筛选和纯化 |
| 4.2.5 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的鉴定 |
| 4.2.6 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 转fat-1 基因表达载体的构建 |
| 4.3.2 绵羊胎儿成纤维细胞 G418 敏感度的研究 |
| 4.3.3 绵羊胎儿成纤维细胞的转染和筛选 |
| 4.3.4 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的鉴定 |
| 4.3.5 转基因绵羊胎儿成纤维细胞的染色体数目分析 |
| 4.4 讨论 |
| 5 转fat-1 基因克隆胚的构建与移植 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 动物材料 |
| 5.1.2 实验设备 |
| 5.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 绵羊卵母细胞的采集和体外培养 |
| 5.2.2 转fat-1 基因绵羊胎儿成纤维细胞的准备 |
| 5.2.3 受体卵母细胞的准备 |
| 5.2.4 转fat-1 基因绵羊克隆胚的制备 |
| 5.2.5 转fat-1 基因绵羊克隆胚的融合 |
| 5.2.6 转fat-1 基因绵羊克隆胚的激活和发育培养 |
| 5.2.7 转fat-1 基因绵羊克隆胚的移植 |
| 5.2.8 转fat-1 基因克隆羔羊的接产 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 绵羊卵母细胞的采集和体外培养 |
| 5.3.2 转fat-1 基因绵羊克隆胚的制备及其移植 |
| 5.3.3 转fat-1 基因克隆羔羊的接产 |
| 5.4 讨论 |
| 6 转fat-1 基因克隆羊的鉴定 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 活体材料 |
| 6.1.2 实验设备 |
| 6.1.3 实验用药品、试剂和耗材 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 转基因克隆羊羊膜细胞的培养 |
| 6.2.2 羊膜细胞染色体数目的分析 |
| 6.2.3 转基因克隆羊的鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 转基因克隆羊羊膜细胞的培养 |
| 6.3.2 羊膜细胞染色体数目的分析 |
| 6.3.3 转基因克隆羊的鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（10）不同转录因子组合诱导成年牛体细胞为iPS细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 前言 |
| 第一章 多能性干细胞与细胞核重编程 |
| 1.1 各种组织来源的多能性干细胞 |
| 1.1.1 胚胎来源的多能性干细胞(ESCs) |
| 1.1.2 原始生殖嵴来源的多能性干细胞(PGCs/EGCs) |
| 1.1.3 雄性生殖腺来源的多能性干细胞(mGSCs) |
| 1.2 细胞核重编程研究方法及进展 |
| 1.2.1 体细胞核移植 |
| 1.2.2 体细胞与胚胎干细胞融合诱导重编程 |
| 1.2.3 细胞提取物诱导重编程 |
| 1.2.4 转录因子诱导重编程 |
| 1.3 细胞核重编程与表观遗传修饰 |
| 1.3.1 重编程过程基因组的去甲基化 |
| 1.3.2 重编程过程X染色体的重新激活 |
| 1.3.3 重编程过程组蛋白修饰的重塑 |
| 1.4 家畜多能性干细胞建系影响因素 |
| 1.4.1 原代多能干细胞分离与鉴别 |
| 1.4.2 培养条件的优化 |
| 1.5 家畜多能性干细胞研究意义 |
| 第二章 诱导性多能干细胞研究进展 |
| 2.1 诱导多能性干细胞研究概述 |
| 2.2 多能性干细胞的诱导方法 |
| 2.3 诱导方法的优化 |
| 2.3.1 减少致癌和突变风险 |
| 2.3.2 重编程效率的提高 |
| 2.4 诱导性多能干细胞鉴定方法 |
| 2.5 诱导性多能干细胞重编程分子机理 |
| 2.5.1 转录因子及调控网络在重编程中的功能 |
| 2.5.2 表观遗传状态的改变 |
| 2.5.3 重编程过程分析 |
| 2.6 诱导性多能干细胞在医学研究和疾病治疗中的应用 |
| 2.7 多能性干细胞应用前景 |
| 试验研究 |
| 第三章 牛OCT4与C-MYC基因克隆及逆转录病毒表达载体构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 牛Oct4和c-Myc基因的克隆 |
| 3.2.2 牛Oct4和c-Myc基因的扩增与鉴定 |
| 3.2.3 逆转录病毒真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 感染性重组逆转录病毒的包装与鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 G418对RetroPack PT67细胞与NIH3T3细胞最小致死量 |
| 4.2.2 脂质体介导重组质粒转染PT67细胞稳定产毒株的建立 |
| 4.2.3 产毒细胞株和病毒上清中外源基因的表达 |
| 4.2.4 病毒颗粒电镜检测 |
| 4.2.5 重组逆转录病毒滴度测定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 四个转录因子组合诱导成年牛皮肤成纤维细胞重编程为IPS细胞 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 牛皮肤成纤维细胞的分离培养和鉴定 |
| 5.2.2 病毒感染牛成纤维细胞与克隆的获得 |
| 5.2.3 牛iPS细胞克隆传代、冻存与复苏 |
| 5.2.4 iPS细胞生物学特性鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛IPS细胞多分化潜能的检测 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 牛iPS细胞体外自由分化 |
| 6.2.2 牛iPS细胞体外定向诱导分化为心肌细胞 |
| 6.2.3 牛iPS细胞体外定向诱导分化为神经细胞 |
| 6.2.4 畸胎瘤形成与检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 减少转录因子数量对诱导牛IPS细胞效果的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 三因子组合诱导多能性细胞的获得 |
| 7.2.2 二因子和一因子组合诱导多能性干细胞 |
| 7.2.3 三因子诱导获得干细胞的生物学特征鉴定 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新之处和进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究（论文参考文献）
- [1]GH和GHR基因对贵州地方黄牛生长性能影响研究[D]. 吴雨. 贵州大学, 2020(04)
- [2]CTRP3对鹅骨骼肌细胞成肌分化的调控作用[D]. 曾雪花. 浙江农林大学, 2020(01)
- [3]过表达慢病毒转染毛囊神经嵴干细胞实验研究[D]. 刘维海. 滨州医学院, 2019(02)
- [4]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [5]ZBTB16基因过表达对牛肌内前体脂肪细胞增殖与分化的影响研究[D]. 张萌萌. 南京农业大学, 2018(07)
- [6]水牛胎儿骨髓间充质干细胞分离培养及基因转染的初步研究[D]. 雷钏. 广西大学, 2015(03)
- [7]褐牙鲆三种细胞系的建立、鉴定及dnmt3基因表达模式初步分析[D]. 彭丽敏. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2015(02)
- [8]PluronicF-127凝胶复合hBMP-2基因修饰BMSCs促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究[D]. 周诺. 广西医科大学, 2012(08)
- [9]转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究[D]. 张东. 内蒙古农业大学, 2011(11)
- [10]不同转录因子组合诱导成年牛体细胞为iPS细胞的研究[D]. 陈冬梅. 西北农林科技大学, 2011(04)