一、HBV DNA荧光定量PCR与干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的关系（论文文献综述）
李茂仕[1]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中提出背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
徐静[2]（2021）在《CYP27B1-1260多态性与干扰素单药/联合治疗慢性乙型肝炎应答的相关性研究》文中研究指明第一部分聚乙二醇干扰素α-2a治疗HBeAg阳性初治慢性乙型肝炎患者的个体化研究目的探讨聚乙二醇干扰素（Peg-IFN）α-2a个体化治疗HBeAg阳性初治慢性乙型肝炎（CHB）患者的临床疗效及相关预测因素。方法对139例HBeAg 阳性初治CHB患者给予Peg-IFNα-2a 180μg每周1次皮下注射48周,随访48周。治疗前留取2ml血标本分离后提取血浆上清液放置-20℃冰箱保存。所有患者均检测乙肝病毒（HBV）基因型,并分别于治疗前、治疗12周、24周、36周、48周、72周检测HBVDNA、ALT、乙肝五项定量、血常规、甲状腺功能、抗核抗体全套等指标,根据治疗24周HBVDNA应答情况后进行个体化治疗并根据患者意愿分为四组。（1）常规治疗组:如果24周HBVDNA下降≥1log copies/ml,继续治疗疗程达48周。（2）延长疗程组:如果24周HBVDNA下降<1log copies/ml,继续治疗至72周。（3）联合治疗组:如果24周HBVDNA下降<1log copies/ml,加用恩替卡韦（ETV）0.5mg,1 次/天,联合 Peg-IFNα-2a 应用至 48 周。（4）序贯治疗组:如果24周HBVDNA下降<1log copies/ml,停用Peg-I FNα-2a序贯ETV0.5mg,1次/天抗病毒治疗达48周以上。观察治疗12周、24周、36周、48周、72周HBVDNA阴转率、ALT的复常率、HBeAg的阴转率及血清转换率、HBsAg定量下降幅度及阴转率、血清转换率。分析HBV基因型与Peg-IFNα-2a治疗疗效的相关性。观察并记录治疗中的不良反应,一旦出现严重不良反应则给予停用Peg-IFNα-2a。根据ALT、HBVDNA、HBeAg应答情况进行疗效判断,分为完全应答（CR）、部分应答（PR）、无应答（NR）三组。（1）CR:ALT 恢复正常,HBVDNA<103 copies/ml,HBeAg 血清学转换。（2）NR:所有指标均未达到上述标准。（3）PR:介于完全应答与无应答之间。应用统计学方法进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1基线特征139例患者纳入常规治疗组65例、延长疗程组24例、联合治疗组23例、序贯治疗组27例,各组性别、年龄、基因型、治疗前ALT值、HBVDNA及HBsAg定量相比较无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。2各组间疗效比较比较常规治疗组与延长治疗组48周时ALT复常率、HBVDNA阴转率、HBeAg阴转率及血清转换率、HBsAg水平平均下降幅度,前者均高于后者（67.7%vs12.5%、66.2%vs16.7%、53.8%vs12.5%、33.8%vs0%、1.62±1.15logIU/ml vs0.39±0.52logIU/ml）（P<0.05）;给予延长治疗组 Peg-IFNα-2a 治疗至 72 周时与常规治疗组48周比较,上述各项指标仍低于常规治疗组（P<0.05）。四组间进行比较,结果显示,除HBsAg阴转率无统计学差异（P>0.05）,其他指标均有统计学差异（P<0.05）。常规治疗组HBeAg阴转率（53.8%）及血清转换率（33.8%）、HBsAg平均下降幅度（1.62±1.15logIU/ml）均高于联合治疗组（13.04%、0%、0.41±0.16 logIU/ml）及序贯治疗组（0%、0%、0.35±0.141ogIU/ml）（P<0.05）,而三组间ALT复查率、HBVDNA阴转率无统计学差异（P>0.05）。延长治疗组、联合治疗组、序贯治疗组三组比较,延长治疗组ALT复常率（29.2%）、HBVDNA 阴转率（16.7%）低于其他两组（69.6%、66.7%;87.0%、85.2%）（P<0.05）,HBeAg阴转率（12.5%）及血清转换率（12.5%）高于其他两组（13.04%、0%;0%、0%）（P<0.05）。联合治疗组和序贯治疗组比较除HBeAg阴转有统计学差异,前组高于后组（13.04%vs0%）（P<0.05）,其他指标两组均无统计学差异（P>0.05）。3基因型与疗效相关性比较各组中基因B型和C型临床疗效比较无统计学差异（P>0.05）。4 Peg-IFNα-2a治疗影响因素分析以年龄、性别、基线HBVDNA载量、HBV基因型、ALT水平、HBsAg水平共6个因素为自变量（X）,以抗病毒治疗24周HBVDNA下降≥1 log copies/ml应答与否（0=无,1=有）为因变量（Y）进行多因素logistic回归分析,结果为性别与治疗前HBsAg的水平与Peg-IFNα-2a治疗24周时HBVDNA应答有相关性,女性和HBsAg水平≤4 log copies/ml治疗24周时HBVDNA应答高（P<0.05）。5不良反应比较比较常规治疗组、延长治疗组、联合治疗组三组Peg-IFNα-2a治疗不良反应,结果显示,发热、流感样症状、白细胞减少、血小板减少、疲劳、ALT升高、脱发等不良反应三组之间无差异（P值>0.05）,139例患者并未出现严重不良反应而停药。结论对于HBeAg阳性CHB初治患者,如果为女性且治疗前HBsAg水平≤4 logIU/ml可优先选择Peg-IFNα-2a抗病毒治疗,并根据治疗24周HBVDNA应答情况给予患者个体化治疗:如果24周HBVDNA下降≥1logcopies/ml则给予继续原方案治疗;如果下降<1log copies/ml则建议停用Peg-IFNα-2a改为ETV等核苷（酸）类似物单药抗病毒治疗,本研究中对于HBVDNA24周下降<1log copies/ml患者并未发现Peg-IFNα-2a延长疗程和联合ETV方案临床疗效的优势,故不推荐应用。第二部分联合聚乙二酵干扰素α-2a治疗恩替卡韦经治慢性乙型肝炎患者的疗效分析目的探讨联合Peg-IFNα-2a治疗ETV经治CHB患者的疗效;分析与疗效相关的影响因素。方法选择经ETV抗病毒治疗6月以上病毒学阴转且HBsAg定量<1500IU/L CHB患者95例,根据患者意愿分为两组:（1）联合治疗组:共35例,原有ETV基础上联合Peg-IFNα-2a 180ug皮下注射,1次/周,Peg-IFNα-2a治疗达48周,如果出现不良反应,则给予对症处理,严重者则停用。（2）单药组:共60例,继续应用ETV。联合治疗组患者治疗前均留取2ml血标本分离后提取血浆上清液放置-20℃冰箱保存。所有患者均检测HBV基因型,并于治疗前、治疗12周、24周、36周、48周检测HBVDNA、ALT、乙肝五项定量、血常规、甲状腺功能等指标。观察治疗12周、24周、36周、48周HBsAg定量值及阴转率、血清转换率;分析Peg-IFNα-2a联合治疗疗效的相关因素;观察记录治疗中的不良反应。应用统计学方法进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1两组基线特征两组间性别、年龄、ALT水平、HBeAg阳性比例、HBsAg定量水平、基因型比例均无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。2比较两组HBsAg的定量变化、48周HBsAg阴转率及HBsAg血清转换率治疗36周、48周联合治疗组较单药组HBsAg定量水平下降明显（P<0.05）;48周联合治疗组有7例（20%）出现HBsAg血清学阴转,3例（8.57%）出现HBsAg血清转换,单药组无一例HBsAg血清阴转及血清转换,两组间比较有显着性差异（P<0.05）。3 HBsAg下降百分数对Peg-IFNα-2a联合治疗应答的疗效预测建立ROC曲线分析35例联合治疗的患者12周、24周、36周的HBsAg水平下降百分数对48周疗效的预测价值,结果显示24周HBsAg下降百分数曲线下面积0.824（95%CI=0.669～0.999）,最佳Cut-off值为51.52%,此时的敏感性为0.714,特异性为0.893（P<0.05）;36周HBsAg下降百分数曲线下面积为0.878（95%CI=00.699～1）,最佳Cut-off值为90.22%,此时的敏感性为0.857,特异性为0.929（P<0.05）,表明第24周、36周的HBsAg水平下降与48周时HBsAg应答有显着的相关性。4不良反应比较联合治疗组28例（80%）早期出现发热,25例（71.4%）患者出现白细胞、中性粒细胞、血小板计数下降;单药组无一例患者出现不良反应。两组均未因严重不良反应而停药。结论对于通过恩替卡韦实现病毒学抑制且HBsAg定量水平<1500IU/ml的患者,联合有限疗程的Peg-IFNα-2a可以显着提高HBsAg清除率和血清转化率;治疗后24周和36周HBsAg的显着降低可以提示HBsAg清除的可能性,并确定获得最大成功机会的患者。第三部分CYP27B1-1260基因多态性与聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎疗效相关性研究目的探讨CYP27B1-1260基因多态性与Peg-IFNα-2a单药治疗HBeAg阳性CHB患者疗效相关性;探讨CYP27B1-1260基因多态性与Peg-IFNα-2a联合治疗ETV经治的CHB患者疗效相关性。方法对第一部分及第二部分进行Peg-IFNα-2a治疗患者共174例留取的血标本,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法检测Cyp27B1-1260A/C多态性位点。将第一部分研究人群Peg-IFNα-2a单药治疗的疗效判断分为CR、PR、NR三组（同第一部分）;将第二部分研究人群联合治疗患者疗效判断分为两组:（1）HBsAg 阴性组:HBsAg 转阴,肝功能正常、HB VDNA<103copies/ml。（2）HBsAg阳性组:HBsAg未转阴,肝功能正常、HBVDNA<103copies/ml。上述指标进行统计学方法分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果1第一部分研究人群结果139 例患者 CYP27B1-1260 多态性 AA49 例（35.3%）、CC46 例（33.1%）、AC44 例（31.7%）。1.1 CYP27B1-1260多态性和Peg-IFNα-2a治疗24周HBVDNA应答的相关性根据Peg-IFNα-2a应用24周HBVDNA应答情况不同,将研究对象分为两组:HBVDN下降≥1logcopies/ml为下降明显组,HBVDNA<1logcopies/ml为下降不明显组,判断CYP27B1-1260多态性与HBVDNA24周应答有无相关性。结果显示,CYP27B1-1260基因CC型在两组间有统计学差异,24周HBVDNA下降不明显组基因CC型发生频率（33.8%）高于24周下降明显组（32.3%）（P<0.05）。1.2 CYP27B1-1260多态性和Peg-IFNα-2a治疗48周疗效相关性分析分析常规治疗组65例患者（其他组因病例数过少不做分析）,结果显示,CC型在Peg-IFNα-2a治疗无应答组（55.0%）比例中明显高于AA型（20.0%）及 AC 型（25.0%）（P<0.05）。2第二部分研究人群结果选择第二部分研究人群中联合治疗组共35例CHB患者,CYP27B1-1260多态性结果为 AA11 例（31.4%）、AC14 例（40.0%）、CC10 例（28.6%）。2.1 CYP27B1-1260多态性与联合治疗疗效的关系经统计学分析,CYP27B1-1260多态性与联合治疗疗效无相关性（P>0.05）2.2 联合治疗影响因素分析以年龄、性别、CYP27B1-1260基因多态、HBV基因型共4个因素为自变量（X）,以抗病毒治疗48周HBsAg阴转（0=无,1=有）为因变量（Y）进行多因素logistic回归分析,结果为上述各指标与联合治疗48周HBsAg阴转均无相关性（P>0.05）。结论CYP27B1-1260基因多态性可能与Peg-IFNα-2a治疗应答有关,其CC型可能是Peg-IFNα-2a治疗HBeAg阳性初治慢性乙型肝炎应答不佳的影响因素。
陈希[3]（2020）在《外泌体携带的HBV miR-3在乙型肝炎疗效评估中的临床意义研究》文中研究说明HBV miR-3是首个在血浆外泌体中被发现的乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）编码的micro RNA,其可靶向抑制HBV前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）和病毒核心抗原的表达,进而抑制病毒复制。HBV pg RNA是公认的在外周血中反映HBV肝组织病毒储存库活跃程度的指标。HBV miR-3作为另外一种HBV RNA,其临床意义尚不清楚。我们实验发现文献方法存在严重的非特异性反应,为解决该问题,我们设计了25组茎环和定量引物,筛选得到6组特异性较好的引物,结合Taq Man MGB探针评价,确定了高特异性HBV miR-3绝对定量PCR引物探针组。我们进而利用该方法开展了外周血外泌体HBV miR-3的临床队列研究,入组病例包括初诊慢性乙型肝炎（CHB）队列（n=48）,核苷类似物（NAs）治疗（n=20）和NAs序贯干扰素（PEG-IFN）治疗队列（n=40）。我们发现在初诊慢性乙型肝炎（CHB）队列中外泌体HBV miR-3与HBV DNA、pg RNA、HBs Ag和HBe Ag呈正相关。在NAs治疗过程中,血清外泌体HBV miR-3随治疗时间延长无统计学差异。在NAs序贯PEG-IFN治疗过程中,血清外泌体HBV miR-3随治疗时间延长显着下降。在初诊慢性乙型肝炎（CHB）队列中,我们发现外泌体HBV miR-3和HBV pg RNA单阳性病例,说明二者之间存在互补性。综上,本研究开发了一套基于茎环引物探针RT-q PCR法的HBV miR-3绝对定量方法,并从临床队列中展开研究,初步确定血清外泌体HBV miR-3在乙型肝炎治疗中具有疗效评估的意义,是HBV pg RNA的有益补充。
丁文斌[4]（2020）在《乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究》文中提出乙型肝炎病毒前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）作为乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）的反转录模板以及HBV聚合酶蛋白（polymerase,Pol）和核心抗原（HBV core antigen,HBc Ag）的翻译模板,在HBV的生命周期中发挥了重要作用[1-3]。近年来相关研究发现慢性乙肝（Chronic Hepatitis B,CHB）患者的外周循环血中可以稳定的检测到HBV RNA,且血清HBV RNA主要以pg RNA的形式存在于CHB的外周循环中;在长期服用核苷类似物（Nucleoside analogs,NAs）抗病毒治疗,血清HBV DNA水平在临床上为阴性（即未检出）的CHB患者中,其血清pg RNA表达水平不但与肝内pg RNA水平呈正相关关系,还可以反映出CHB患者肝脏的炎症和纤维化程度[4,5]。此外,还有许多研究提出血清pg RNA可以作为一种潜在的生物学标志物,用于评价NAs抗病毒治疗效果,检测NAs治疗中的病毒突变以及指导NAs治疗的安全停药[6-10]。然而,pg RNA在HBV相关肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发生及进展过程中发挥了何种作用尚不明确。此外,相关研究报道α干扰素2a（Interferon-α-2a,IFN-α-2a）可以抑制pg RNA的转录,且在HBV相关HCC行根治性手术的患者中,术后IFN-α-2a辅助治疗能够降低他们HCC的复发率并提高总体生存率,但具体作用机制仍不明确[11-13]。在本研究中,我们首先探索了pg RNA在HBV相关HCC发生和进展中的作用及机制。其次,我们探索了干扰IFN-α-2a除了直接抗肿瘤作用外,能否通过抑制pg RNA发挥预防HBV相关HCC发生和进展的作用。本研究分为以下两个部分。本研究的第一部分中,我们首先从本中心临床样本库中选取了136例术前服用NAs药物抗病毒治疗至少48周,血清HBV DNA阴性的慢乙肝肝癌患者,对其术前的血清,术中切除的肝癌及癌旁组织中pg RNA的表达量进行检测。结果显示癌旁组织中pg RNA的表达高于癌组织,且血清pg RNA表达与癌旁组织pg RNA表达呈正相关关系（r=0.63,p<0.001）。接下来我们根据患者血清pg RNA的表达水平,使用中位数法把患者分为血清pg RNA高表达组和血清pg RNA低表达组,然后对其基本临床病理学信息进行分析和比较。结果显示血清pg RNA高表达不但与更低的肿瘤分化程度（p=0.014）,更严重的肝脏炎症程度（p=0.006）,纤维化程度（p=0.013）及肝硬化（p=0.040）相关,而且还与HBV e抗原（HBV e antigen,HBe Ag）阳性（p=0.004）和HBV表面抗原（HBV surface antigen,HBs Ag）滴度（p=0.007）密切相关。此外,血清pg RNA高表达在患者的总生存期（Overall survival,OS）更短（p=0.0166）,肝癌的累计复发率（Cumulative recurrence rate,CRR）更高（p=0.0157）。多因素分析表明血清pg RNA高表达是肝癌患者手术后死亡（OS:95%CI=1.197-3.356,p=0.008）和肝癌复发的独立危险因素（CRR:95%CI=1.167-3.058,p=0.010）。对临床数据的分析提示pg RNA可能在HCC发生和进展中发挥了重要作用。接下来我们通过体内体外等功能实验进一步探索pg RNA在肝癌发生和进展中的作用。我们使用pg RNA特异性短发卡RNA（sh-RNA）成功构建了稳定干扰pg RNA的Hep G2.2.15肝癌细胞系。同时,我们使用pg RNA全长过表达质粒成功在肝癌细胞Hep G2.2.15和Huh7中过表达了pg RNA并挑取了稳定过表达单克隆。Cell Counting Kit-8（CCK-8）,克隆形成,Ed U,细胞流式,成球及体内和体外绝对稀释等实验表明敲低pg RNA的表达能够抑制细胞的增殖能力,克隆形成能力,抑制肝癌细胞的抗细胞凋亡能力,同时抑制肝癌细胞的干细胞特性（简称干性）和成瘤能力;而在肝癌细胞中过表达pg RNA后,肝癌细胞的增殖能力,克隆形成能力,抗凋亡能力,干性及成瘤能力进一步增强。体内外功能实验结果进一步证明了pg RNA与HCC的发生及进展密切相关。在探索pg RNA促进HBV相关HCC发生和进展的机制研究过程中,通过RNA pull-down实验[14],银染实验和蛋白质谱分析,我们发现pg RNA可与一个经典的促癌分子胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白3（Insulin-like growth factor 2 m RNA binding protein 3,IGF2BP3）直接结合并相互调节。接下来,我们又通过RNA pull-down和蛋白免疫印迹（Western blot）,RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和RNA原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）共聚焦等实验进一步验证了pg RNA与IGF2BP3的直接相互结合作用,且两者结合后pg RNA的稳定性得到增强。接下来,通过一系列的实验和生物信息学预测分析,我们发现pg RNA通过海绵样吸附mi RNA-let-7e-5p,在转录后修饰水平上调IGF2BP3的表达。此外,通过细胞功能的加减法实验,我们发现过表达pg RNA对肝癌增殖能力和干性的促进作用可以被进一步干扰IGF2BP3所阻断。总之,我们的研究发现在CHB患者体内,pg RNA与IGF2BP3之间存在相互调节作用。一方面,pg RNA与IGF2BP3直接结合,且两者结合后pg RNA的稳定性会升高;另一方面,pg RNA可通过海绵样吸附作用,隔离IGF2BP3抑制性的mi R-let-7e-5p,增加IGF2BP3 m RNA的稳定性,从而在转录后修饰水平上调IGF2BP3蛋白的表达。综上所述,我们第一部分部分的研究发现pg RNA-IGF2BP3信号轴在HBV相关HCC发生和进展过程中发挥了重要作用。本研究的第二部分中,我们探索IFN-α-2a能否通过抑制HBV-pg RNA,进而抑制HBV相关HCC的发生和进展。我们使用IFN-α-2a处理Hep G2.2.15肝癌细胞不同的时间段后,对pg RNA和IGF2BP3的表达变化进行检测。结果显示,当我们使用IFN-α-2a处理细胞0-24 h时,pg RNA和IGF2BP3 m RNA的表达从处理4 h后开始明显下降,但IGF2BP3蛋白水平未明显变化。接下来,我们使用IFN-α-2a处理细胞更长的时间（0-7天）,结果显示pg RNA和IGF2BP3的m RNA的表达水平从处理4 h起开始明显下降,IGF2BP3蛋白水平从处理24 h后开始明显下降。此外,当我们用IFN-α-2a处理不表达pg RNA但遗传背景与Hep G2.2.15相同的Hep G2细胞相同时间后,IGF2BP3无论在m RNA还是蛋白水平均未发生明显变化。这些结果提示IFN-α-2a无法直接下调IGF2BP3的表达,而是通过抑制pg RNA进而下调IGF2BP3的表达,发挥抑制HCC进展的作用。接下来,我们通过体内体外细胞功能加减法实验进一步验证IFN-α-2a是否通过抑制pg RNA发挥抑制HCC发生和复发的作用。首先,我们使用IFN-α-2a和等体积生理盐水分别处理pg RNA过表达单克隆和对应的阴性对照单克隆细胞。结果显示pg RNA的过表达可以在一定程度上逆转IFN-α-2a对肝癌细胞增殖能力和干性的抑制作用。接下来,我们使用pg RNA过表达单克隆和对应阴性对照单克隆细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型,并使用IFN-α-2a或等体积生理盐水分别处理相应的裸鼠。结果显示过表达pg RNA后可以部分逆转IFN-α-2a对皮下荷瘤生长的抑制作用。综上,这些结果提示IFN-α-2a除了直接抗肿瘤生长作用外,在HBV相关HCC中还可以通过阻断pg RNA-IGF2BP3轴从而抑制肝癌细胞的增殖能力和干性,最终发挥抑制HCC进展的作用。相关研究已发现IFN-α-2a可以抑制pg RNA的转录[15]。此外,最近的研究也发现在HBV pg RNA的5’和3’末端茎环结构上存在N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰位点,且m6A修饰程度增强后,HBV的所有转录本（包括pg RNA）的稳定性及相应的翻译产物会被下调[16]。因此,我们接下来探索IFN-α-2a处理对pg RNA稳定性及其m6A修饰的影响。通过放线菌素D（Actinomycin D）转录抑制实验并进一步计算pg RNA半衰期,我们发现经IFN-α-2a处理48 h后,pg RNA的稳定性明显下调。接下来我们通过基因特异性m6A q PCR,进一步验证IFN-α-2a处理对pg RNA的m6A修饰的影响。结果显示,IFN-α-2a处理能够明显增加pg RNA的m6A修饰水平。同时我们也检测了经IFN-α-2a处理后,m6A修饰过程中三个重要蛋白甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）,甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）以及脂肪和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）的表达变化[17]。结果显示,经IFN-α-2a处理的Hep G2.2.15细胞中METTL3和METTL14的表达明显升高,而FTO的表达明显下降。提示IFN-α-2a可能通过上调肝癌细胞中甲基转移酶METTL3和METTL14的表达同时下调去甲基酶FTO的表达,进而增加pg RNA的m6A修饰水平。综上所述,我们该部分的研究发现IFN-α-2a除了直接的抗肿瘤作用外,在HBV相关HCC中还可以通过增加HBV-pg RNA的m6A修饰水平,促进pg RNA的降解,从而抑制pg RNA-IGF2BP3信号轴,发挥预防HCC发展的作用。
马宁[5]（2020）在《候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究》文中提出第一部分候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析目的:本部分的研究目的:1.应用3种遗传模型分析干扰素及其受体系列基因（IFNA1、IFNA2、IFNA5、IFNL4、IFNLR1、IFNAR2）、氧化应激系列基因（CYBA、NCF4、NOX4、SOD2、GCLM）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）及lnc-RP11-150O12.3外显子区的rs2275959位点和HBV慢性肝病发生发展的关联。2.分析同一染色体上物理位置接近的SNPs构成的单倍体型和HBV慢性肝病发生发展的关联。3.应用3种统计方法分析各个系列SNPs的交互作用和HBV慢性肝病发生发展的关联。方法:1. 候选基因SNPs的选择。Pubmed数据库检索功能SNPs或者区域,这些SNPs或者区域可能会影响和HBV感染有关基因的m RNA的转录、蛋白质的表达,继而影响HBV慢性肝病的发生发展。然后通过UCSC数据库和Ensemble数据库检索其具体物理位置和在中国北方汉族人群中的罕见等位基因频率（MAF）,Hapmap数据库查询单倍体型信息,SNPinfo Web Server预测SNPs的功能。共21个SNPs（IFNA1-rs1332190、rs1831583,IFNA2-rs649053,IFNA5-rs7031048、rs3758236,IFNAR2-rs1051393、rs12233338,IFNLR1-rs10903035、rs11249006、rs7525481、rs4649203,IFNL4-rs12971396、rs8113007、rs7248668,CYBA-rs4673,NCF4-rs1883112,NOX4-rs1836882、rs3017887,SOD2-rs4880,GCLM-rs41303970,RP11-150O12.3-rs2275959）纳入本研究。2.样本收集。从石家庄市第五医院以及河北医科大学第一、二、四附属医院中选择符合纳入标准的研究对象3128例,包括:阴性对照者（Negative Control,Ne C）840例,HBV自然清除者（Natural Clearance,NC）496例、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B,CHB）691例、HBV相关肝硬化（Liver Cirrhosis,LC）680例、HBV相关性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者421例,其中CHB组、LC组和HCC组统称为HBV相关肝病组（HBV-induced liver diseases,HLD）。抽取研究对象空腹静脉抗凝血备用,同时以问卷形式收集研究对象的基线资料、检查结果、患病情况。3.基因分型。从抗凝全血中提取DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption/ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS）检测方法对21个候选基因的SNPs进行分型检测。4.统计学分析。多组计量资料的比较采用单因素方差分析（正态分布且方差齐）或K-W H秩和检验（正态分布方差不齐/非正态分布）,两个或多个样本率或构成比的比较采用χ2检验。用非条件Logistic回归分析SNPs和疾病发生发展的关联性,并计算比值比（odds ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）。分析研究对象的基线资料与HBV慢性肝病发生发展的关系。应用共显性、显性和隐性模型分析21个SNPs与HBV慢性肝病易感性（HBV相关肝病组vs.阴性对照组）、HBV自然清除（HBV相关肝病组vs.HBV自然清除组）、HCC易感性（HCC组vs.LC+CHB组,HCC组vs.阴性对照组）的关联。以P≤0.05为差别有统计学意义,检验水准均为双侧,采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理和分析。Haplo View软件进行单倍体型和疾病的关联分析。SNPStats软件对阴性对照个体21个位点的基因型频率行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验。广义多因子降维法（Generalized Multifactor Dimensionality Reduction,GMDR）、Logistic回归分析（相乘模型）、叉生分析法（相加模型）进行基因-基因交互作用分析。结果:1 21个SNPs的等位基因频率符合H-W遗传平衡定律（P>0.05）,证明研究对象具有群体代表性。2 干扰素及其受体系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系2.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示共显性模型下有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393GT/TT vs.GG（P=0.001,OR=1.430;P=0.006,OR=1.471）、IFNLR1-rs4649203GG vs.AA（P=0.002,OR=1.676）、IFNLR1-rs7525481TT vs.CC（P=0.002,OR=5.907）,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006AG/GG vs.AA（P=0.000,OR=0.228;P=0.00234,OR=0.130）、IFNAR2-rs122333338CC vs.TT（P=0.003,OR=0.115）。显性模型中,有4个位点进入方程,其中危险因素有3个:rs1051393（GT+TT）、rs4649203（AG+GG）、rs7525481（CT+TT）,其OR值分别为1.372、1.222、3.975;保护性因素有1个:rs11249006（AG+GG）,OR=0.239。隐性模型中有2个位点进入方程:rs4649203GG和AA+AG比较属于危险因素:OR=1.478;rs122333338CC和TT+TC比较属于保护性因素:OR=0.185。以HBV慢性肝病作为病例组,阴性对照个体为对照组,IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单体域,单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素（P=0.0038,OR=1.208）,CAG是疾病的保护性因素(P=3.428×10-32,OR=0.116)。GMDR结果提示rs7525481、rs11249006、rs10903035构成的3因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照3因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.186（1.672,2.858）倍。相乘交互作用结果提示rs7525481＿T和rs11249006＿A的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=2.258、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.240,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.240倍。和rs649053＿G的主效应导致疾病发生的危险度分别是OR=1.513、OR=1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.364,二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.364倍。rs7525481＿T和rs10903035＿G存在负相加交互作用,归因于两个位点的交互作用导致疾病发生的超额相对危险度是-2.67[RERI=-2.670（-4.670,-0.670）],两因素同时存在时（CT+TT、AG+GG）发病的危险性是它们各自单独存在时危险性之和的0.389倍[S=0.389（0.267,0.568）]。2.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:显性模型中IFNLR1-rs4649203AG+GG和野生型纯合体AA相比,属于危险因素（P=0.008,OR=1.344）,携带AG及GG基因型的群体不易清除HBV。未发现与HBV清除能力相关的单倍体型。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV持续感染的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.658,故二者呈正相乘交互作用,致使疾病发生的可能性额外增加了0.658倍。10对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。2.3 与HBV相关性肝细胞癌（HBV-HCC）进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,将干扰素及其受体系列的14个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共18个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有2个位点进入方程:携带rs1051393TT的个体比携带GG基因型的个体更容易由HBV慢性肝病发展为HCC（P=0.021,OR=1.497）;rs7248668GA和GG相比,属于危险基因型（P=0.002,OR=1.876）。显性模型中,仅1个位点进入方程:rs7248668GA+AA和GG相比属于危险因素,有更大的可能发展为HCC（P=0.006,OR=1.720）。隐性模型中有2个位点进入方程:rs1051393TT和GG+TG比较属于危险因素:（P=0.006,OR=1.512）;rs649053GG和AA+AG比较属于危险因素:（P=0.019,OR=1.421）。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668＿A构成单体域,单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素（P=0.0362,OR=1.440）,CAG是保护性因素（P=0.0423,OR=0.721）。GMDR的方法未发现最佳交互模型。相乘交互作用结果提示rs1051393＿T和rs7031048＿G的主效应导致HBV-HCC发生的危险度均为1,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=2.325,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了1.325倍。rs4649203＿A和rs7248668＿A的主效应导致HBV-HCC发生的危险度分别为OR=1、OR=1.774,归因于二者的交互作用导致疾病发生的危险度为OR=1.995,故二者呈正相乘交互作用,致使HCC发生的可能性额外增加了0.995倍。14对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作用。3 氧化应激系列基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关系3.1 与HBV慢性肝病易感性有关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,阴性对照组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。共显性模型中有3个位点进入程:突变型杂合体rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.01,OR=1.412）;携带rs1883112AG/GG的个体与携带AA基因型的个体相比更不易患病（P=0.011,OR=0.783;P=0.007,OR=0.672）;突变型纯合体rs41303970AA和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.027,OR=1.951）。显性模型中,有3个位点进入方程,其中保护性因素有2个:rs1883112（AG+GG）、rs1836882（TC+CC）,其OR值分别为0.755、0.831;危险因素有1个:rs4673（AG+AA）,其OR值为1.358。隐性模型中有3个位点进入方程:rs1883112GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.755;rs4880GG和AA+AG比较属于保护性因素:OR=0.507;携带rs41303970AA的个体比携带AG+GG的个体容易患病:OR=1.991。未发现与HBV慢性肝病易感性相关的单倍体型。GMDR结果提示rs1883112、rs1836882、rs4880、rs3017887构成的4因子模型是和HBV慢性肝病相关的最佳互作模型,按照4因子交互组合将研究对象重新划分为患病的“高危”人群和“低危”人群,“高危”人群患病的风险是“低危”人群的2.029（1.479,2.782）倍。rs1836882＿A和rs1883112＿T在导致HBV慢性肝病发生中存在正相乘交互作用趋势（P=0.061,OR=1.200）。15对SNPs位点间未显示出基于相加模型的交互作3.2 与机体清除HBV能力相关的SNPs位点以HBV慢性肝病组作为病例组,HBV自然清除组为对照组进行病例对照研究,将氧化应激系列的6个位点连同吸烟、饮酒、性别、年龄共10个因素引入非条件Logistic逐步回归模型。结果显示仅1个位点和机体清除HBV的能力有关:共显性模型中突变型杂合体CYBA-rs4673AG和野生型纯合体GG相比,属于危险因素（P=0.045,OR=1.398）。该系列另5个位点均和HBV自发清除能力无关。3.3 与HBV-HCC进展有关的SNPs位点以HBV-HCC为病例组,CHB及LC为对照组进行病例对照研究,结果未发现与HBV-HCC有关的SNPs位点。4 RP11-150O12.3-rs2275959T与HBV慢性肝病发生发展的关系以CHB与LC为对照组,HCC为病例组,分析rs2275959T与HBV-HCC之间的相关性,结果表明共显性模型下CT、TT与CC相比均为HCC易感性的危险因素（P=0.016,OR=1.427;P=0.006,OR=1.561）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.005,OR=1.477）。以阴性对照组为对照组,HCC为病例组,共显性模型下该位点的TT与CC相比为HCC易感性的危险因素（P=0.003,OR=1.748）;显性模型下CT+TT和CC相比是危险因素（P=0.016,OR=1.463）;隐性模型下TT和CC+CT相比是危险因素（P=0.014,OR=1.459）。结论:1.干扰素及其受体系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有3个:IFNAR2-rs1051393T、IFNLR1-rs4649203G、IFNLR1-rs7525481T,保护性SNPs有2个:IFNLR1-rs11249006G、IFNAR2-rs122333338C。rs4649203G同时和HBV自然清除有关。IFNAR2-rs1051393T、IFNL4-rs7248668A、IFNA2-rs649053G是HBV-HCC的危险因素。2.IFNLR1基因附近的3个位点rs7525481＿T,rs10903035＿G和rs11249006＿G构成单倍体型TAA是HBV慢性肝病的危险因素。IFNL4基因附近的3个位点rs12971396＿G,rs8113007＿T和rs7248668A构成的单倍体型GTA是HBV-HCC的危险因素。3.干扰素及其受体基因的SNPs存在交互作用,可能对HBV慢性肝病的发生发展起重要作用。4. 氧化应激系列有5个位点和HBV慢性肝病易感性有关,其中危险性SNPs有2个:CYBA-rs4673A、GCLM-rs41303970A,保护性SNPs有3个:NCF4-rs1883112G、NOX4-rs1836882C、SOD2-rs4880G。rs4673A同时和HBV自然清除有关。5. Rs2275959T与HBV-HCC的发生有关。第二部分lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与mi R-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响目的:探索RP11-150O12.3多态性位点rs2275959T对HCC发生发展作用的分子机制。方法:1.生信分析。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构;Lnc RNASNP2数据库检索通过rs2275959位点和RP11-150O12.3结合的mi RNA及RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织的表达情况;UCSC数据库下载RP11-150O12.3在肝癌及癌旁组织中的表达量数据。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测4株肝癌细胞株及LO2肝细胞中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量,细胞爬片荧光探针原位杂交（Fish）实验在4株细胞株中对RP11-150O12.3进行定位;q RT-PCR检测RP11-150O12.3和mi R-6739-3p在30对肝癌及其癌旁组织中的表达量;数量性状分析肝癌组织中RP11-150O12.3、mi R-6739-3p的表达量是否会因为rs2275959基因型的不同而改变,相关性分析不同rs2275959基因型个体肿瘤组织中RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的表达量是否具有相关性;荧光素酶报告基因检测技术验证RP11-150O12.3及mi R-6739-3p的海绵吸附作用;最后利用q RT-PCR方法检测RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的结合是否影响RP11-150O12.3的表达量。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。利用慢病毒包装及感染技术构建RP11-150O12.3稳定过表达及敲减的QGY7703肝癌细胞系;在体外利用MTT及克隆形成实验,在体内利用裸鼠皮下成瘤实验检测RP11-150O12.3对肝癌细胞QGY7703增殖能力的影响;利用Transwell小室法检测过表达及敲减RP11-150O12.3后QGY7703细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用流式细胞术分析RP11-150O12.3是否影响细胞周期与细胞凋亡。结果:1.生信分析结果。RNASNP数据库检索RP11-150O12.3的局部二级结构显示,rs2275959野生型碱基C附近的序列（ACAGAACAAA）较易和其它核酸互补结合,而突变碱基U位于茎-环交界处,其下游序列（AAAUGCAUG）存在6对A-U对及3对C-G对会形成稳定的氢键,增加分子间作用力,使分子更稳定。Lnc RNASNP2数据库显示当rs2275959为野生型C时RP11-150O12.3和mi R-6739-3p有海绵吸附作用,当rs2275959突变为U时,该吸附作用会消失。Lnc RNASNP2数据库显示RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于癌旁组织,从UCSC数据库下载的原始数据支持这一结论。2.细胞和组织实验验证rs2275959 C介导的RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR检测发现RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞系中的表达量显着高于LO2正常肝细胞(P=1.7×10-4,P=2.6×10-5,P=0.002)。Fish实验检测RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep3B 3株肝癌细胞及LO2正常肝细胞中的表达,均主要定位于细胞浆中。mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均显着低于LO2正常肝细胞（P=0.000）。在30对新鲜肝癌组织及其癌旁组织中检测RP11-150O12.3的表达量,结果表明其在肝癌组织中的表达量显着高于癌旁组织(Z=-3.898,P=9.7×10-5)。Rs2275959基因型不同,肝癌组织中RP11-150O12.3的表达量亦不同,从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=1.765）到携带CT基因型的个体（Median=4.496）再到携带TT基因型的个体（Median=5.836）其表达量有逐渐升高的趋势(PCC-CT=0.348,PCC-TT=0.040)。而mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于癌旁组织（Z=-3.363,P=0.001）。从携带rs2275959CC基因型的个体（Median=2.848）到携带CT基因型的个体（Median=1.459）再到携带TT基因型的个体（Median=1.106）其表达量有逐渐降低的趋势(PCC-CT=0.203,PCC-TT=0.045)。携带rs2275959CC及CT基因型个体的癌组织中两种RNA的表达量呈负相关关系(rs=-0.734,P=3.5×10-4),携带TT基因型个体的癌组织中二者表达量没有相关性（rs=0.009,P=0.979）。双萤光素酶报告基因技术结果提示rs2275959-C能介导RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的海绵吸附作用。q RT-PCR实验结果进一步说明这种吸附作用能够导致RP11-150O12.3表达量下降。3.细胞和动物实验研究RP11-150O12.3对QGY7703肝癌细胞生物学功能的影响。本研究成功构建了过表达及敲减RP11-150O12.3的稳定细胞系。MTT实验结果显示:过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞与空载质粒对照细胞（Control）相比,培养48h后增殖能力增强（P=0.04）;将QGY7703细胞的RP11-150O12.3敲减后,与无关序列对照组（sh Control）相比,48h后细胞增殖能力下降（P=0.042）。过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的相对克隆形成率显着高于Control组（P=0.005）,而将RP11-150O12.3敲减后,QGY7703细胞的相对克隆形成能力明显下降(P=4.26×10-4)。裸鼠成瘤实验结果显示,皮下注射过表达RP11-150O12.3T的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着高于皮下注射Control组细胞的小鼠(Pweight=0.004),皮下注射敲减RP11-150O12.3的QGY7703细胞的Balb/c小鼠其肿瘤生长速度及终重量显着低于皮下注射sh Control组细胞的小鼠(Pweight=0.011)。Transwell小室法检测RP11-150O12.3过表达或敲减后QGY7703细胞迁移与侵袭能力的变化,结果显示,RP11-150O12.3T过表达组细胞的迁移和侵袭能力均显着高于Control组（P=0.028,P=0.010）,RP11-150O12.3敲减组细胞的迁移和侵袭能力均显着低于sh Control组（P=0.002,P=0.024）。流式细胞术检测细胞周期结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703细胞过表达RP11-150O12.3T后G0/G1期的比例明显下降（P=0.001）,S期的比例明显升高(P=1.9×10-4),说明RP11-150O12.3T能促进细胞周期从G0/G1期向S期转变。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3表达量下调的QGY7703细胞G0/G1期的比例升高(P=1.13×10-4),S期比例明显下降（P=0.049）,使细胞阻滞于G0/G1期。细胞凋亡实验结果显示:和Control组细胞相比,QGY7703过表达RP11-150O12.3T后细胞凋亡比例明显降低（P=0.0011）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异更加明显(P=1.12×10-4)。相反,和sh Control组比较,RP11-150O12.3下调的QGY7703细胞凋亡比例明显增高（P=0.003）,两组细胞用5-Fu处理后这种差异也有所提高（P=0.001）。结论:1.RP11-150O12.3在BEL7402、QGY7703、Hep G2肝癌细胞中的表达量高于LO2正常肝细胞,其表达位置在细胞浆。而mi R-6739-3p在BEL7402、QGY7703、Hep G2、Hep3B肝癌细胞中的表达量均低于LO2正常肝细胞。2.RP11-150O12.3在肝癌组织的表达量高于其对应的癌旁组织,从携带rs2275959CC基因型的个体到携带CT基因型的个体再到携带TT基因型的个体肝癌组织中RP11-150O12.3表达量有逐渐升高的趋势,mi R-6739-3p表达量有逐渐降低的趋势,并且mi R-6739-3p在肝癌组织中的表达量低于其癌旁组织。携带CC及CT基因型个体的癌组织中RP11-150O12.3和mi R-6739-3p表达量呈负相关关系。3.RP11-150O12.3与mi R-6739-3p的相互作用依赖于rs2275959C碱基且导致RP11-150O12.3的表达量下调。4.RP11-150O12.3作为一个促癌基因,在体外能促进HCC细胞增殖、迁移与侵袭,促进细胞周期的进展,并抑制细胞凋亡;在体内能促使裸鼠成瘤。
巫智勇[6]（2020）在《国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较》文中进行了进一步梳理目的:了解Roche公司Cobas PCR试剂与国产HBV荧光定量PCR试剂对HBV DNA检测的差异性,以更好地指导抗病毒治疗。方法:收集安医大一附院2019年3月至2019年6月期间门诊和住院的未经和已经进行核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化患者的血清70份,采用相关性分析来评价Cobas检测和国产检测对不同HBV DNA载量标本的精确性。HBV DNA定量检测:HBV DNA分别用Cobas定量试剂（Roche）和上海之江生物科技股份有限公司试剂（ZJ）进行检测。扩增反应分别在Cobas Taq Man 48 PCR仪和美国Applied Biosystem公司生产的ABI 7500基因扩增仪进行。同一份标本采用2种试剂进行平行检测,具体操作和结果判定参照试剂盒说明进行。结果:1.上海之江生物科技股份有限公司生产的试剂ZJ试剂检测结果与Roche检测结果的总体相关系数r=0.612,P=0.004,说明两者之间存在显着的线性相关。2.国产试剂对于病毒载量低于106 copy/ml的标本检测结果的问题突出体现在三个方面:1)检测结果准确性差;2)相当比例的标本国产试剂出现检测值≤1000copy/ml,病毒载量越低,出现检测值低于下限的比例越高。3)病毒载量低于106 copy/ml的标本,国产试剂检测结果的重复性差,同一标本不同批次的检测结果可以相差1个数量级。在103<HBV DNA≤106范围内,P值大于0.05,提示两种检验方法间不存在显着相关性,在HBV DNA>107copy/ml范围以上,两种检验方法间存在显着的线性相关。3.ZJ试剂检测结果≤1000copy/ml而Roche检测结果>1000copy/ml的,即ZJ试剂检测结果呈假阴性的标本有16例,占37.2%。结论:1.国产试剂与Roche试剂具有较好的相关性,表明国产试剂总体来说反映了标本中的病毒载量水平,可以用于常规检测。国产试剂与Roche试剂在病毒载量高于107 copy/ml以上时具有较好的相关性,在病毒载量低于≤106 copy/ml范围内的检测精度相关性差。2.血清HBV DNA高滴度或低滴度持续存在是乙型肝炎病情进展和肝癌发生的危险因素,血清HBV DNA的高精度检测至关重要,建议对于HBV DNA低于106 copy/ml的标本,尤其是经过抗病毒治疗后国产检测低于检测下限的,应当使用用Cobas高精度病毒载量检测系统进行检测或复测,尽量避免假阴性结果而延误患者病情。
范晶华[7]（2019）在《慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究》文中进行了进一步梳理[目 的]前期研究聚焦早期准种变化对短期（一般3年或以下）抗病毒治疗疗效的影响。本研究前瞻性观察慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者（慢性乙型肝炎及乙肝病毒相关肝硬化患者）核苷（酸）类似物（NAs）长期（近10年）抗病毒治疗过程中的疗效及对临床结局的影响,研究抗病毒治疗关键时间节点的乙型肝炎病毒准种异质性及其进化机制,进一步明确抗病毒治疗效果差异的病毒学机制。[方法]本研究的第一部分纳入107例接受核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者开展为期111.83月的前瞻性、开放性、观察性的真实世界研究。入组患者随机分为恩替卡韦组（治疗药物为恩替卡韦）和非恩替卡韦组（治疗药物为拉米夫定、阿德福韦酯或替比夫定）。每24～48周进行一次随访,收集患者临床资料,分析长期抗病毒治疗后病毒学、生化及血清学应答情况及对临床结局的影响。本研究第二部分采用第一部分的24例慢乙肝患者进行HBV准种研究。首先,我们将研究对象分为三组（三组间无配对关系）,即未治疗组、治疗1年组和治疗10年组（病毒学突破组）,分别取不同时期的患者血清进行HBV准种研究。对于治疗1年组,我们根据患者治疗1年以后病毒应答的时间情况,分为A组（1年<HBV应答时间<3年）和B组（3年<HBV应答时间<6年）。采用PCR产物克隆测序的方法对逆转录酶（reverse transcriptase,RT）区准种进行分析,比较不同治疗时间点的HBV准种差异,探讨核苷（酸）类似物治疗1年时HBV准种的特征与之后病毒学应答的关系及RT基因的准种进化规律。本研究第三部分对一例乙肝病毒表面抗原（Hepatitis B surface Antigen,HBsAg）和抗-HBs共存的HBV准种基因组进行克隆、测序、生物信息学比较及荟萃分析。[结 果]第一部分:经过长期NAs抗病毒治疗,HBVDNA的对数值（log10 IU/mL）治疗后降为 1.28（1.28,1.40）IU/mL 低于治疗前的 6.92（5.06,7.89）IU/mL（P<0.05）,恩替卡韦组较非恩替卡韦治疗组下降幅度更大（P<0.05）。随访结束时,病毒学突破人数为28人,突破率为26.17%,恩替卡韦组与非恩替卡韦组无差异（P>0.05）。治疗1年时HBV DNA不可测为病毒学突破的保护因素（HR=0.235（0.103,0.538）,P<0.05）。67.9%患者 HBsAg 定量低于 1500 IU/ml,6.54%（7例）患者HBsAg消失并于治疗24～48周时获得早期病毒学应答。乙肝病毒e抗原（Hepatitis B e Antigen,HBeAg）消失率为 71.21%,血清转换率为 40.91%。患者HBeAg消失与基线HBV DNA、ALT水平、HBV DNA转阴时间无关（P>0.05）。6 例患者（5.61%,6/107）发生恶性肿瘤,其中 3 例（2.80%,3/107）发生肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、均为恩替卡韦治疗患者。APRI指数治疗后为 0.44（0.31,0.56）,低于治疗前 1.05（0.53,1.75）（P<0.01）,随访结束后患者肝硬度值为4.9（4.0,6.2）KPa。第二部分:我们采用24例慢乙肝患者451条HBV RT克隆序列用于下游分析,研究不同抗病毒效果患者的病毒学机制,结果如下:1.A组40%（2例）患者检测到耐药突变,B组75%（6例）患者检测到耐药突变,治疗10年组50%（3例）患者检测到耐药突变。B组和治疗10年组均有50%的患者积累了插入、缺失或终止密码子突变。2.在RT基因的核苷酸和氨基酸水平,治疗1年组的复杂度均显着高于未治疗组（P<0.05）,而且治疗1年或10年组的平均遗传距离均显着高于未治疗组（P<0.05）。在RT基因的核苷酸水平,A组复杂度（Sn=0.9734）均显着高于 B 组（Sn=0.8875,P=0.0393）和治疗 10 年组（Sn=0.8524,P=0.0141）。A组和B组的平均遗传距离、平均同义替换数目及平均非同义替换数目水平相当,均低于治疗10年组,但无统计学意义（P>0.05）。在RT基因的氨基酸水平,A组复杂度（Sn=0.8874）显着高于治疗10年组（Sn=0.7098,P=0.0473）,但三组间的平均遗传距离无显着差异（P>0.05）。3.与治疗1年组（A组和B组）相比,未治疗组和治疗10年组的系统进化树具有较为简单的拓扑结构。治疗1年组（A和B组）平均枝长（0.0029±0.00029）显着大于未治疗组（0.0012±0.0003,P=0.0137）。A 组平均枝长（0.0028±0.0005）和 B 组的平均枝长（0.003±0.0004）均显着大于治疗10年组（0.002±0.0004）（P<0.001）,但A组和B组的平均枝长差异不显着（P=0.6368）。4.我们对三组患者HBVRT的选择压力（ω=dN/dS）进行分析。结果表明,三组患者HBV均经历了正选择,治疗10年组积累了更多的正选择信号。在基因型B、C及B/C中,三组患者具有相似的ω值分布趋势。在B/C基因型中,A组的选择压力（ω=0.296±0.0332）和B组的选择压力（ω=0.291±0.0469）没有差异,均低于治疗10年组（ω=0.5679±0.1722）。5.治疗1年时RT准种复杂度（核苷酸水平）与相应的HBV DNA载量呈负相关（P=0.0163,R=-0.6493）。RT的准种复杂度（核苷酸和氨基酸水平）与相应的ALT 水平呈负相关（P=0.0437,R=-0.5661;和 P=0.0117,R=-0.673）。平均遗传距离、平均同义替换数和平均非同义替换数与相应的HBV DNA载量、ALT水平无统计学相关性。第三部分:本研究分析1例HBsAg和抗-HBs共存的基因型为Ⅰ型的慢性乙型肝炎患者HBV准种基因组特征,该病毒准种基因组具有高度复杂的准种异质性和高频的HBsAg突变,其中69%的克隆发生PreS缺失和HBsAg氨基酸变异。Meta分析结果表明,PreS缺失与HBsAg和抗-HBs共存具有相关性,总体风险估值为 4.09（95%CI（2.18,7.68））。[结 论]NAs长期抗病毒治疗可以使患者不同程度获益,与HBV准种异质性密切相关。在抗病毒药物压力下,HBVRT准种的异质性与核苷（酸）类似物抗病毒治疗应答早晚有关,该基因的准种的高复杂度可能提示治疗应答佳。在治疗1年时,高复杂度的HBV准种,有利于HBV DNA和ALT水平下降,但低水平的ALT反而不利于HBVDNA清除。抗病毒治疗效果差的患者积累了较多的耐药突变、缺失、或终止密码子突变,提示这些突变不利于病毒学应答,可能与免疫逃逸有关。治疗10年组具有较为简单的进化模式与更多的正选择信号,提示这些变化可能与病毒学突破有关。个案HBV基因组准种分析与Meta分析表明,高频的preS1缺失,与HBsAg与抗-HBs共存相关。
徐由立[8]（2019）在《慢性乙型肝炎脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道菌群的变化及其与甲基化相关蛋白的关联性研究》文中认为目的:观察慢性乙型肝炎脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者的肠道菌群变化情况,初步探讨肠道差异菌群与甲基化相关蛋白之间的关系。方法:采用病例--对照研究的方案,从四川省成都市郫县中医院门诊招募慢性乙肝患者12例,其中脾胃湿热证有5例、肝郁脾虚证7例,正常健康对照组由6名健康志愿者构成,采用16SrDNA高通量测序技术观察三组样本的菌群多样性和丰度变化情况,比较各组菌群结构特征;全自动生化仪检测肝功能指标;Elisa法检测甲基化感染相关蛋白DNMT1、MeCp2、E-cad、P53的浓度;Pearson相关系数分析肠道菌群与DNMT1、MeCp2、E-cad、P53之间的关系。结果:1.本次研究的三组18个样本DNA共检测出1980988条高质量的Clean reads,得到8352条OTUs,这些OTUs分属于11个菌门,19个纲,25个目,45个科,89个种,146个属,其中健康对照组（3399）>脾胃湿热组（2654）>肝郁脾虚组（2299）,三组样本共有的OTUs有263个,健康对照组和脾胃湿热组之间有469个交叉OTU,和肝郁脾虚组之间有445个交叉OTU,脾胃湿热组和肝郁脾虚组两组共有419个OTU,各组特有的OTU个数分别为健康对照组2748,脾胃湿热组1674,肝郁脾虚组2053。2.门水平上:本次研究三组样本均以拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌,与健康对照组相比较,脾胃湿热组和肝郁脾虚组拟杆菌门丰度降低,厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门丰度升高,B/E值下降;科、属水平上,与健康对照组相比较,慢性乙肝证候组普雷沃菌属（Prevotella）、萨特菌属（Sutterella）、多尔氏菌属（Dorea）、毛螺旋菌下菌属（LachnospiraceaeUCG-008）、瘤胃梭菌属（Ruminiclostridium9）、阿里松氏菌属（Allisonella）、Anaeroglobus属丰度升高,食物谷菌属（Victivallis）丰度降低,且脾胃湿热组检出链型杆菌属（Catenibacterium）和丛毛单胞菌属（Comamonas）两个菌属,肝郁脾虚组检出泰泽属（Tyzzerella）;与脾胃湿热组比较,肝郁脾虚组检出放线杆菌属（Actinobacillus）,而链型杆菌属（Catenibacterium）、Intestinibacter菌属消失。经LEfSe分析,脾胃湿热组和肝郁脾虚组在变形菌门（Proteobacteria）上差异显着。3.与健康对照组比较慢性乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证ALT、AST、GGT、TBIL、DBIL、TBA明显升高,HBV-DNA拷贝数高于检测下限（>1.0E+3）,（P<0.05）;与脾胃湿热组比较,肝郁脾虚组AST、GGT有所降低（P<0.05）。4.与健康对照组相比较慢性乙肝脾胃湿热组与肝郁脾虚组DNMT1、E-cad、P53、MeCp2浓度明显升高（P<0.05）;与脾胃湿热组相比较,肝郁脾虚组E-cad、P53、DNMT1、MeCp2浓度有所上升,差异无意义（P>0.05）。5.脾胃湿热组DNMT1与B/E呈较强相关（r=0.772）,E-cad、P53、MeCp2与B/E无明显相关（r<0.3,P>0.05）,肝郁脾虚组E-cad与B/E呈较弱相关性（r=0.601）,DNMT1、P53、MeCp2与B/E无相关性（r<0.4,P<0.05）。6.脾胃湿热组DNMT1与Proteobacteria呈较弱相关性（r=-0.589）,E-cad、P53、MeCp2与Proteobacteria无明显相关性;肝郁脾虚组E-cad、P53、MeCp2、与Proteobacteria无相关性（r<0.5,P>0.05）。结论:1.本次研究证实慢性乙肝患者与健康人群肠道微生物存在明显差异性;2.本次研究证实慢性乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道具有各自的优势菌种;3.本次研究证实慢性乙肝的进展与宿主的DNA甲基化有关,DNMT1、E-cad、MeCp2、P53在影响宿主甲基化的同时可能也参与了慢性乙肝的进程;4.慢性乙肝状态下机体存在免疫功能紊乱,肠道微生态失调和甲基化修饰,B/E值、差异菌Proteobacteria与甲基化蛋白DNMT1、E-cad、MeCp2、P53呈一定相关性,很有可能是肠道菌群通过甲基化修饰的方式干预了某些特定基因的表达,从而在慢性乙肝中发挥作用,但其具体机制有待进一步研究。
郭健慧[9]（2019）在《寻找影响HBeAg阳性CHB患者IFNα疗效的相关基因及其机制研究》文中研究说明【目的】干扰素α（IFNα）治疗慢性乙型肝炎（CHB）患者的疗效具有个体化差异,本课题拟从筛选与IFNα疗效相关的单核苷酸多态性（SNP）位点和挖掘疗效相关的差异表达基因两个方面入手,寻找与IFNα疗效相关的SNP位点或基因以预测其临床疗效,并通过细胞学实验进一步探讨它们影响IFNα抗乙型肝炎病毒（HBV）作用的机制,以期为预测CHB患者IFNα的疗效奠定基础,实现精准诊疗。【方法】1.收集124例HBV基因型为B/C的HBeAg阳性CHB患者,其中IFNα治疗完全应答（CR）组38例,应答不佳（SR）组86例。用Infinium?Asian Screening Array（ASA）和Massarray技术对IFNα通路内/外的基因进行SNP分型,统计出在CR/SR组中分布有差异的位点;用实时荧光定量PCR法检测具有差异SNPs的基因在不同应答组和不同基因型中的m RNA表达量;观察不同基因型与IFNα治疗过程中的HBV DNA、HBs Ag和HBeAg水平的关系;探讨不同基因型对IFNα诱导抗病毒蛋白和干扰素刺激基因（ISGs）表达的影响。2.从GEO Data Sets上查找用IFNα治疗的HBeAg阳性CHB患者肝组织m RNA芯片,通过聚类分析、GO功能注释和KEGG通路富集,挖掘出不同疗效组间的差异表达基因;在HepG2细胞中验证HBV对差异基因表达的影响;构建干扰和过表达基因的慢病毒载体,作用于HepG2.2.15细胞后观察HBV的复制情况;加入IFNα刺激,观察IFNα信号通路中信号传导及转录活化因子1（STAT1）和STAT2蛋白的磷酸化水平是否发生改变以及抗病毒蛋白—寡腺苷酸合成酶1（OAS1）、干扰素刺激基因—泛素特异性多肽酶18（USP18）等的表达情况。【结果】1.APOB、ZNF350/ZNF350-AS1基因多态性与IFNα的疗效有关1.1.确定APOB rs1367117、APOB rs10199768、ZNF350/ZNF350-AS1 rs2278420和ZNF350-AS1 rs6509607为研究对象124例样本用Asian Screening Array和Massarray法检测出483500个位点。通过卡方检验和数据的多重检验校正,得到P<0.05的位点23672个,P<0.01的位点4381个（基因1265个）,P<10-5的位点51个（基因20个）。实时荧光定量PCR检测P<10-5的基因和锌指蛋白（ZNF）家族基因的m RNA,ZNF350基因的m RNA在SR组[40.98（17.43-64.93）]中的表达高于CR组[15.62（10.99-25.68）],差异具有统计学意义（P=0.018）。载脂蛋白B（APOB）的蛋白表达量在CR/SR组中有统计学差异（P<0.05）。确定APOB rs1367117、APOB rs10199768、ZNF350/ZNF350-AS1 rs2278420和ZNF350-AS1 rs6509607为目的研究对象。1.2.rs1367117、rs10199768、rs2278420和rs6509607四个位点的基因型与IFNα的疗效有关rs1367117、rs10199768、rs2278420和rs6509607的基因型在CR/SR组之间的分布具有统计学差异（P=0.029,P=0.036,P=0.000和P=0.000）;SR组中的rs1367117 GG基因型和G等位基因频率显着高于CR组（P=0.021和P=0.017）;SR组中的rs10199768 CC基因型和C等位基因频率显着高于CR组（P=0.036和P=0.040）。SR组中的rs2278420 AA基因型和A等位基因频率显着高于CR组（P<0.001和P<0.001）;SR组中的rs6509607 AA基因型和A等位基因频率显着高于CR组（P<0.001和P<0.001）。1.3.rs1367117、rs10199768、rs2278420和rs6509607不同基因型患者的实验室指标随IFNα治疗过程的变化情况观察IFNα治疗的第12、24、36、48周。HBV DNA、HBs Ag和HBeAg在APOB rs1367117 GG型和AG型患者之间的分布没有显着差异。在治疗12周时APOB rs10199768 AC型患者的HBeAg浓度较CC型低（P=0.017）。单倍型分析显示,IFNα治疗第12周和第24周时rs1367117A/rs10199768A患者的HBeAg浓度较rs1367117G/rs10199768C患者低（P=0.033和P=0.023）,和A基因型与CR相关的结果一致。在IFNα治疗12周、36周和48周时ZNF350/ZNF350-AS1 rs2278420 AG型患者的HBeAg浓度较AA型低（P=0.007,P=0.002和P=0.024）。在IFNα治疗12周、36周时ZNF350-AS1 rs6509607 AG型患者的HBeAg浓度较AA型低（P=0.016和P=0.002）。单倍型分析显示,在IFNα治疗12周、36周和48周时,rs2278420G/rs6509607G患者的HBeAg浓度都较rs2278420A/rs6509607A患者低（P=0.007,P=0.002和P=0.029）,和G基因型与CR相关的结果一致。1.4.APOB和ZNF350基因多态性位点的相关功能学实验在探索rs1367117、rs10199768、rs2278420和rs6509607不同基因型影响IFNα抗病毒的机制中,未经任何抗病毒治疗的HBV感染者PBMC在IFNα作用后,用实时荧光定量PCR法检测IFNα信号通路基因、ISGs和抗病毒蛋白的m RNA在不同基因型感染者中的表达情况。rs10199768 AC型感染者的STAT1和CXCL10的m RNA表达水平较CC型高（P=0.002和P=0.027）;单倍型分析结果显示,rs1367117A/rs10199768 A感染者的STAT1、CXCL10和ISG15的表达水平较rs1367117G/rs10199768C高（P=0.004,P=0.044和P=0.020）,与A等位基因与CR有关的结果一致。同样的,rs2278420 AA型感染者的IFNα通路负调控基因SOCS1、SOCS3和PIAS1表达水平较AG型高（P=0.017,P=0.011和P=0.010）;rs6509607 AA型感染者的PIAS1、PTPN6的表达水平较AG型高（P=0.022,P=0.004和P=0.041）,与A等位基因与SR有关的结果一致。2.LCK基因表达差异影响HBeAg阳性CHB患者IFNα疗效2.1.通过基因芯片挖掘差异表达基因对IFNα治疗的HBeAg阳性CHB患者肝组织m RNA表达芯片GSE27555（应答vs.应答不佳）和GSE66698（治疗前vs.治疗后）进行数据挖掘和分析后,筛选出淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）基因。2.2.HBV DNA与LCK表达有相互促进作用培养液加入CHB患者血清（HBV DNA>106 IU/ml）促进HepG2细胞中LCK的表达（P=0.010）。进一步探究发现,在HepG2细胞中,重组HBs Ag（r HBs Ag）对LCK表达无影响（P>0.05）,而r AAV1.3HBV可显着促进LCK的表达（P=0.008）。对Hep AD38细胞进行LCK的过表达后,上清液中HBs Ag和HBeAg含量升高（P<0.001和P=0.002）。2.3.LCK抑制抗病毒蛋白表达体外应用IFNα刺激LCK干扰后的HepG2.2.15细胞,发现干扰素基因刺激蛋白（STING）、含三角形四肽重复序列的干扰素诱导蛋白3（IFIT3）、干扰素刺激基因15（ISG15）、腺苷脱氨酶（ADAR）、ISG20、OAS1、USP18基因的m RNA表达增高（P值均小于0.05）,而过表达LCK时无显着差异;同时Western-blot法检测到过表达LCK后OAS1蛋白的表达降低,干扰LCK后OAS1、USP18和ISG15蛋白表达增高。进一步探究LCK作用于IFNα信号通路的机制中发现,LCK过表达时STAT1和STAT2蛋白磷酸化水平降低。【结论】1.APOB和ZNF350/ZNF350-AS1基因多态性与IFNα治疗HBeAg阳性CHB患者的疗效有关:rs1367117和rs10199768携带次要等位基因A与IFNα疗效呈正相关;rs2278420和rs6509607携带次要等位基因G与IFNα疗效呈正相关,有助于在治疗前筛选出对IFNα应答较好的患者。2.LCK促进HBV复制、抑制IFNα应答:LCK基因表达与HBV复制相互促进,LCK通过抑制STAT1和STAT2蛋白磷酸化下调抗病毒蛋白OAS1的表达,对IFNα的抗HBV作用具有抑制作用。
王永力[10]（2019）在《慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测及临床应用》文中提出目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA,cccDNA）是乙肝病毒前基因组RNA（Pregenomic RNA,pg RNA）复制的原始模板,对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。以往文献报告了多种进行HBV cccDNA定量检测的方法,各有其利弊。本研究拟采用荧光定量聚合酶链反应即荧光定量PCR（Fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）的检测方法进行HBV cccDNA定量检测,初步探讨HBV cccDNA荧光定量检测方法在慢性乙型肝炎患者肝组织中的临床应用及意义。方法:通过使用HBV cccDNA、HBV Total DNA以及HBV pg RNA的特异性引物和探针,将含有HBV基因的p HBV1.3-B6质粒作为标准品,根据HBV质粒的不同拷贝数,建立FQ-PCR检测的标准曲线,通过实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA、BV Total DNA以及HBV pg RNA含量;用Jukart细胞DNA作为检测管家基因β-actin的标准品,根据人类基因组DNA（Human genomicDNA,hg DNA）的不同拷贝数,建立FQ-PCR检测的标准曲线,通过实时荧光定量PCR检测β-actin基因含量,计算肝细胞数,并对每个肝细胞内含有的HBV cccDNA、HBV Total DNA以及HBV pg RNA进行标准化;并在He PGAD38细胞和THP-1细胞中验证该方法。检测HBV感染患者肝组织HBV cccDNA定量,包括终末期肝病患者（包括肝硬化和肝癌）11例和核苷酸类似物（Nucleos（t）ide analogs,NAs）经治的慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者5例（于基线和继续NAs治疗48周时肝穿刺活检取样）。通过检测患者肝组织的相关病毒学指标,分析肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量在临床实践中的意义。结果:1.在He PGAD38细胞中成功检测到HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA,其含量分别为3.89 copies/cell（IQR 3.44-4.49）、1289.43 copies/cell（IQR859.96-6038.50）、6.42 copies/cell（IQR 5.06-7.85）,而阴性对照的THP-1细胞未能检查到相关指标。2.HBe Ag阴性的终末期肝病患者中,未经抗病毒治疗的患者肝细胞HBV cccDNA和HBV Total DNA水平显着高于已接受抗病毒治疗的患者（分别为P<0.0001,P=0.0004）;在HBe Ag阴性的核苷类似物经治的终末期肝病患者中,血清HBV DNA阳性的患者肝细胞HBV cccDNA水平明显高于血清HBV DNA转阴的患者（P=0.0238）,而肝细胞HBV Total DNA定量水平两组无显着性差异（P>0.05）。3.本研究3例HBe Ag阳性核苷经治患者基线时肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量分别为0.93 copies/cell、1.62 copies/cell、0.05 copies/cell（均取中位数）;2例HBe Ag阴性患者肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量分别为0.05 copies/cell、0.38 copies/cell、0.01 copies/cell（均取中位数）。HBe Ag阳性患者肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA含量均高于HBe Ag阴性患者,两组比较没有统计学差异（P>0.05）。继续NAs抗病毒治疗48周后肝组织检测,3例HBe Ag阳性肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量的中位数分别为0.31 copies/cell、0.22 copies/cell、0.06 copies/cell;2例HBe Ag阴性患者肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA的含量分别为0.05copies/cell、0.22 copies/cell、0.00 copies/cell。治疗48周后,HBe Ag阳性患者肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA含量均较基线时降低（无统计学差异,P>0.05）。HBe Ag阴性患者HBV Total DNA和HBV pg RNA定量中位数在48周较基线时有所下降（无统计学差异）,但HBV cccDNA定量无变化。结论:成功建立了慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测的荧光定量PCR方法。抗病毒治疗可显着降低HBe Ag阴性的终末期肝病患者肝细胞HBV cccDNA和HBV Total DNA水平。肝细胞HBV cccDNA定量是可用于评价临床慢乙肝患者抗病毒疗效较为精确可靠的指标之一,本研究不足之处在于样本量较小,需要进一步扩大样本研究。
二、HBV DNA荧光定量PCR与干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV DNA荧光定量PCR与干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的关系（论文提纲范文）
（1）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）CYP27B1-1260多态性与干扰素单药/联合治疗慢性乙型肝炎应答的相关性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词汇对照表 |
| 研究背景 |
| 第一部分 聚乙二醇干扰素α-2a治疗HBeAg阳性初治慢性乙型肝炎患者的个体化研究 |
| 一、引言 |
| 二、资料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第二部分 联合聚乙二醇干扰素α-2a治疗恩替卡韦经治慢性乙型肝炎患者的疗效分析 |
| 一、引言 |
| 二、资料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 第三部分 CYP27B1-1260基因多态性与聚乙二醇干扰素α-2a治疗慢性乙型肝炎疗效相关性研究 |
| 一、引言 |
| 二、资料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 单核苷酸多态性与干扰素治疗慢性乙型肝炎相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（3）外泌体携带的HBV miR-3在乙型肝炎疗效评估中的临床意义研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 研究意义 |
| 1.2 科学问题 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 本研究所用细胞系未受支原体污染 |
| 3.2 HBV阳性细胞系基因组含HBV miR-3 前体序列 |
| 3.3 Yang等报道的方法存在非特异扩增 |
| 3.4 SYBR Green法筛选茎环引物组 |
| 3.5 结合TaqMan MGB特异性探针确定最佳引物探针组 |
| 3.6 血清外泌体携带HBV miR-3(EXO-HBV miR-3)的临床队列研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 茎环引物RT-qPCR方法可在临床上实现对HBV miR-3 定量 |
| 4.2 EXO-HBV miR-3 具有与血清pg RNA不同的临床意义 |
| 4.3 EXO-HBV miR-3 的疗效评估意义归纳 |
| 4.4 展望 |
| 全文总结与创新性说明 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 基于微流控技术分离细胞外囊泡 |
| 参考文献 |
| 在学期间成果 |
| 致谢 |
（4）乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 HBV-pgRNA通过与IGF2BP3相互调控,促进HBV相关HCC的发生和进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 第二部分 IFN-α-2a通过增加pgRNA的m6A修饰降低其稳定性,阻断pg RNA-IGF2BP3 信号轴,抑制HCC的进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 乙型肝炎病毒前基因组 RNA 在乙肝相关疾病发病机制及临床应用中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 候选基因单核苷酸多态性及其交互作用与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc-RP11-150O12.3多态性位点rs2275959 C与 miR-6739-3p结合对肝细胞癌发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 宿主基因多态性对乙型肝炎病毒慢性感染易感性及疾病进展的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 慢性乙型肝炎的病毒学检测及预后 |
| 参考文献 |
（7）慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 核苷(酸)类似物长期抗病毒治疗疗效分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 HBV RT区准种进化模式与核苷类药物抗病毒治疗应答关系的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 HBsAg和抗-HBs共存乙肝病毒基因型Ⅰ感染者HBV准种特征及相关文献回顾Meta分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 慢性乙型肝炎患者病毒准种的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）慢性乙型肝炎脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道菌群的变化及其与甲基化相关蛋白的关联性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 中医学对乙肝的认识 |
| 1.1 病名认识 |
| 1.2 病因病机概述 |
| 1.3 证候探索 |
| 1.4 中医药治疗 |
| 2 现代医学对乙肝的认识 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 发病机制 |
| 2.4 治疗 |
| 3 肠道菌群的研究概况 |
| 3.1 肠道菌群的结构 |
| 3.2 肠道菌群的主要功能 |
| 3.3 影响肠道菌群结构的因素 |
| 3.4 肠道菌群研究方法 |
| 4 肠道菌群在乙肝中的研究现状 |
| 5 肠道菌群应用于中医证候的研究现状 |
| 5.1 脾虚证的微生态研究 |
| 5.2 湿热证的微生态研究 |
| 5.3 肾阳虚证的微生态研究 |
| 5.4 其它证型的微生态研究 |
| 第二部分 实验部分 |
| 一.利用16SrDNA测序技术对慢性乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道菌群结构的实验研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究对象 |
| 2.1 病例来源及分组 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 排除纳入标准 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 粪便标本采集 |
| 4.2 肠道菌群DNA的提取 |
| 4.3 肠道菌群DNA的 PCR扩增 |
| 4.4 PCR产物的混样和纯化 |
| 4.5 文库构建和上机测序 |
| 4.6 测序数据处理 |
| 4.7 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 一般资料 |
| 5.2 肠道菌群检测结果 |
| 5.3 OTU聚类分析 |
| 5.4 Alpha多样性分析 |
| 5.5 Beta多样性分析 |
| 5.6 组间显着性差异metastats分析 |
| 5.7 群落结构分析与热图 |
| 5.8 群落相似度比较 |
| 5.9 LEfSe分析 |
| 二.肠道菌群与DNA甲基化相关指标的关联研究 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 血液标本采集 |
| 3.2 血清生化指标检测 |
| 3.3 ELISA法检测血浆HBV慢性感染相关指标 |
| 4 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 HBV-DNA定量 |
| 5.2 肝功能检测结果 |
| 5.3 DNA甲基化相关蛋白检测结果 |
| 5.4 肠道菌群与DNA甲基化相关指标的关联性分析 |
| 第三部分 综合讨论 |
| 1 四川地区慢性乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证现状分析 |
| 2 慢性乙肝相关菌属分析 |
| 3 慢性乙肝不同证型相关菌属分析 |
| 3.1 脾胃湿热证菌群分析 |
| 3.2 肝郁脾虚证肠道菌群分析 |
| 4 DNA甲基化相关蛋白分析 |
| 5 DNA甲基化与中医证型分析 |
| 6 肠道菌群与甲基化相关蛋白的关联性分析 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）寻找影响HBeAg阳性CHB患者IFNα疗效的相关基因及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 第一部分:探讨APOB、ZNF350/ZNF350-AS1基因多态性与HBe Ag阳性CHB患者IFNα疗效的关系 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分:LCK基因表达差异影响HBe Ag阳性CHB患者IFNα疗效的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| References |
| 致谢 |
（10）慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测及临床应用（论文提纲范文）
| 英文缩略语对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 慢性乙型肝炎患者肝组织HBV CCCDNA定量的检测方法 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 慢性乙型肝炎患者肝组织HBV CCCDNA定量检测方法的临床应用 |
| 1.前言 |
| 2.研究对象 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学方法 |
| 5.结果 |
| 6.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 乙型肝炎病毒CCCDNA的临床应用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、HBV DNA荧光定量PCR与干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效的关系（论文参考文献）
- [1]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]CYP27B1-1260多态性与干扰素单药/联合治疗慢性乙型肝炎应答的相关性研究[D]. 徐静. 山东大学, 2021(11)
- [3]外泌体携带的HBV miR-3在乙型肝炎疗效评估中的临床意义研究[D]. 陈希. 暨南大学, 2020(12)
- [4]乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究[D]. 丁文斌. 中国人民解放军海军军医大学, 2020
- [5]候选基因单核苷酸多态性与HBV慢性肝病发生发展的关联性分析及其生物学功能研究[D]. 马宁. 河北医科大学, 2020(01)
- [6]国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较[D]. 巫智勇. 安徽医科大学, 2020(02)
- [7]慢性乙肝病毒感染者核苷（酸）类似物长期抗病毒治疗疗效与乙肝病毒准种异质性及进化机制研究[D]. 范晶华. 昆明医科大学, 2019(02)
- [8]慢性乙型肝炎脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道菌群的变化及其与甲基化相关蛋白的关联性研究[D]. 徐由立. 成都中医药大学, 2019
- [9]寻找影响HBeAg阳性CHB患者IFNα疗效的相关基因及其机制研究[D]. 郭健慧. 福建医科大学, 2019(07)
- [10]慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测及临床应用[D]. 王永力. 华中科技大学, 2019(03)