一、ELISA方法和血清学方法筛选群体反应性抗体的比较（论文文献综述）
朱国强[1]（2021）在《口蹄疫病毒A型牛源单个B细胞中和抗体的筛选及竞争ELISA方法的建立》文中进行了进一步梳理口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease virus,FMDV）是引起牛、猪、羊等偶蹄动物口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）的病原。FMDV为单股正链RNA病毒,具有O、A、C、Asia1、SAT1～3七个血清型,A型是抗原变异性最大的血清型。尽管2018年之后,A型FMDV的发生频率显着下降,但疫源并未完全清除,依然具有威胁性。灭活疫苗是防控FMD的重要工具,如何评价灭活疫苗的质量及免疫效果,是目前FMD防控技术研究的重要课题。单克隆抗体是解析病毒抗原结构,研发诊断检测技术的重要工具。近年来,从易感动物体内分离抗原特异性B细胞,研制单个B细胞抗体,成为研制单克隆抗体的新技术。本研究旨在利用单个B细胞抗体研制技术,从免疫牛体内筛选A型FMDV特异性单个B细胞中和抗体,并以此为基础建立可用于评估A型FMD疫苗免疫效果的ELISA方法。本研究利用生物素标记FMDV A/AF72 146S作为诱饵抗原,PE标记12S作为负筛抗原,通过流式细胞术分选146S特异性单个B细胞,巢式PCR扩增Ig G重链、轻链可变区基因,构建表达质粒。重链、轻链质粒共转染CHO-S细胞进行抗体表达。通过流式分析、间接ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）验证抗体反应特性,通过病毒中和试验（VNT）验证抗体的中和活性。结果表明,共表达纯化得到单个B细胞抗体72株,其中对A型抗原具有反应性的抗体39株,病毒中和抗体29株,可以中和3个谱系病毒的中和抗体6株（编号W2、W21、W125、W145、W151、W153）;通过6株相对广谱中和抗体的反应性与亲合力比较,最终选择W145与实验室保存的具有广谱反应性的单个B细胞抗体E32,建立了检测FMDV A型中和抗体的竞争ELISA方法（NAC-ELISA）。通过检测背景清楚的感染和健康动物血清样本,确定该方法的敏感性为100%,特异性为98.1%,与VNT测定中和抗体水平显着相关（p<0.01,R2=0.876）,与FMDV Asia1、O型无交叉反应。综上所述,本研究筛选到了29株A型FMDV中和抗体,为A型FMDV抗原结构解析提供了非富的抗体工具;建立了一种用于检测A型中和抗体的竞争ELISA方法,为疫苗免疫效果评价提供了一种候选方法。
施磊[2]（2021）在《基于非洲猪瘟病毒p35蛋白间接ELISA方法的建立及单克隆抗体制备》文中研究指明非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是非洲猪瘟病毒（African swine fever vires,ASFV）感染猪引起高度致死的接触性传染病。该病以软蜱为传播媒介,非洲野猪为储存宿主。自非洲猪瘟疫情传入我国以来,给我国养猪业的发展和社会经济的稳定带来严峻的挑战。ASF具有复杂的感染与免疫逃避机制,国内尚未研制出商业化的疫苗预防和控制该病。因此,快速、准确、成本低廉,相对便捷且适合大规模筛查的常规血清学诊断方法的建立,对于ASF疫情的常态化监测显得尤为重要。诊断抗原的抗原性及其有效单克隆抗体的研制,对血清学诊断方法的建立至关重要。以ASFV pp62蛋白作为诊断抗原建立的间接ELISA方法,针对保存较差的田间血清样品,其检测效果显着优于以p30或p54蛋白建立的间接ELISA方法,p35蛋白是pp62多聚蛋白经ASFV S273R蛋白酶水解后形成的成熟蛋白,主要参与ASFV核衣壳的组装和病毒粒子的稳定过程。因此,本研究首次以ASFV p35成熟蛋白为研究靶标,分析了p35蛋白作为诊断抗原的抗原性,并制备了p35蛋白的单克隆抗体。研究内容及结果概括如下:1.为了验证p35蛋白作为诊断抗原的潜力,本研究通过建立酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法,以杆状病毒昆虫细胞表达系统表达的ASFV p30蛋白为参照,首次探讨原核表达系统表达的ASFV p35蛋白作为诊断抗原的抗原性和潜力。间接免疫荧光和免疫印迹结果表明,获得了40 k Da的重组p35蛋白和30 k Da的p30蛋白,两种蛋白与ASFV阳性血清均具有较好的免疫反应原性。分别用重组p30和p35蛋白作为诊断抗原建立ELISA方法,并验证其敏感性、稳定性以及与进口试剂盒的符合率。结果显示,尽管p35-ELISA方法的检测敏感性稍低于p30-ELISA方法,但其敏感性仍可达95.8%,且p35-ELISA方法和p30-ELISA方法的批内和批间变异系数均小于10%。p35-ELISA方法与进口试剂盒比较,符合率达97.2%。结果表明建立的p35-ELISA方法稳定性好且敏感性高,可应用于田间ASFV感染的检测。2.以纯化的p35蛋白作为抗原免疫小鼠,当小鼠血清的抗体效价达到1︰204800时,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用建立的p35-ELISA方法对杂交瘤细胞经过筛选和亚克隆后获得15株稳定分泌p35蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞;免疫印迹和间接免疫荧光方法鉴定其中的杂交瘤细胞2-D7E5和3-F7E8分泌的单克隆抗体,获得的单克隆抗体能够特异地识别p35抗原;抗体亚类鉴定结果表明:两株单抗均为Ig G1型,轻链均是Kappa;间接ELISA方法测定制备的腹水效价均大于214。本研究为p35蛋白功能表位的解析和ASF血清学诊断方法的建立提供重要生物原材料。
孙燕燕[3]（2021）在《基于不同微球标记非洲猪瘟病毒和口蹄疫A型病毒免疫层析检测方法的建立》文中研究指明胶体金颗粒作为功能性载体材料与免疫层析检测技术结合形成的相关诊断方法及产品,具有操作简单、反应快速、特异性高和稳定性好等优点,已被广泛应用于医学检验、食品安全、兽药残留、环境监测等领域。但由于胶体金颗粒本身存在一些灵敏度的限制,目前仅用于定性检测。因此,对于免疫层析技术,突破难以定量分析的瓶颈,建立灵敏、特异、直观、快速的定量检测方法,才会更好的满足基层生产单位的现实需求,具有重大的技术改进价值和应用前景。因此,本论文建立了非洲猪瘟病毒（ASFV）抗体的免疫层析定性检测方法和口蹄疫A型病毒（FMDV-A）的免疫层析定量检测方法,具体研究内容如下:1.ASFV抗体胶体金定性免疫层析检测方法的建立。将重组ASFV p30蛋白（特异性和抗原性已验证）用胶体金颗粒标记,制成捕获金标抗原;将p30蛋白及其多克隆抗体（ASFV-p30-Ab）包被在硝酸纤维素膜（NC）上,分别作为检测线（T线）和质控线（C线）组装试纸条。用该试纸条检测已知的ASFV阳性、阴性血清,检测可在5-10 min完成,灵敏度为1:256。平行检测口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）等常见猪病毒病阳性血清20份,仅ASFV呈阳性反应,与其它血清无交叉,特异性可靠。用同一批次内、不同批次间的试纸条重复性检测ASFV阳性、阴性血清,结果差异不显着,变异系数CV均小于10%,稳定性良好。与进口ASFV竞争ELISA抗体检测试剂盒平行对比检测50份健康猪血清,试纸条检测出阴性结果48份,ELISA检测出阴性结果49份;平行对比检测52份ASFV抗体阳性猪血清,试纸条检出阳性50份,ELISA检出阳性51份。以ELISA方法为参照标准,试纸条的特异性为92.00%,敏感性为92.59%。2.FMDV-A抗体定量免疫层析检测方法的建立。1)抗原筛选。分别对5种备选抗原:纯化的AF/72和Re-A/WH/09毒株146S病毒颗粒及其原核表达VP1蛋白、及原核表达的A/GD/MM/13毒株VP1蛋白,用间接ELISA和胶体金免疫层析（GICA）平行检测100份背景清晰的FMDV-A、O、AsiaⅠ型田间样本血清,基于FMDV-A血清的阳性检出率计算其敏感性,基于对O、AsiaⅠ血清的交叉阳性计算其特异性。结果:AF/72-146S的敏感性和特异性在间接ELISA（90%,95%）和GICA（95%,92.5%）中均为最高,A/GD/MM/13-VP1最低（P/N为1.95）。Re-A/WH/09-146S ELISA（86.67%,87.5%）、GICA（83.33%,87.5%）、AF/72-VP1 ELISA（78.33%,75%）、GICA（90%,62.5%）、Re-A/WH/09-VP1 ELISA（76.67%,70%）、GICA（85%,55%）。AF/72-146S为最合适的诊断用抗原。2)FMDV-A抗体的免疫层析定量检测方法的建立。用抗坏血酸（AA）还原K2Pt Cl4和Na2Pd Cl4,经超声水浴法制备具有氧化还原酶活性的Pt-Pd合金纳米颗粒,作为捕获纳米标记物标记FMDV-AF/72-A-146S,与其抗体（FMDV-AF/72-146S-Ab）同时包被在NC上,分别作为检测线（T线）和质控线（C线）组装试纸条。用该试纸条检测已知的FMDV阳性、阴性血清,检测可在10 min内完成,灵敏度为1:28。取已知液相阻断ELISA（LPB-ELISA）抗体效价为1:64、1:128、1:256和1:512的口蹄疫A型阳性血清,用试纸条进行检测,完成后用金标免疫分析仪扫描读取信号T/C值。以A型阳性血清样品的LPB-ELISA抗体效价为横坐标,金标分析仪读值T/C值为纵坐标作图,建立标准曲线。抗体效价与T/C比值之间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.9692。检测时将待检血清的T/C值带入标准曲线,即可对应获得该份血清的抗体效价。与胶体金试纸条平行比对检测50份FMDV-A血清,Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条可检测出阳性结果49份,胶体金试纸条可检测出阳性结果48份,检测22份阴性血清,Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条和胶体金试纸条均可检测出阴性结果22份,检测36份O、AsiaⅠ血清,Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条可检测出阴性结果34份,胶体金试纸条可检测出阴性结果31份,Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条的敏感性为98%,特异性为94.8%。用同一批次内、不同批次间的试纸条重复性检测不同抗体效价的FMDV-A阳性血清,结果差异不显着,变异系数CV均小于15%,稳定性良好。与LPB-ELISA平行检测102份背景清晰的血清样品,将二者抗体效价（Log10）进行比对,检测结果具有良好的一致性,相关系数R2为0.9112。
杨木娇[4]（2021）在《牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白的表达及诊断方法的初步建立》文中研究表明牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV）在世界范围内广泛流行,可引起牛的以呼吸道疾病为主的多种临床病症,包括严重的呼吸道感染、脓疱性外阴阴道炎、乳腺炎、流产和新生小牛神经系统感染等,给养牛业带来重大的经济损失。IBRV基因缺失疫苗是牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR）防控的有效手段,欧洲一些发达国家通过使用gE基因缺失疫苗并对gE抗体进行检测,在接种gE基因缺失疫苗的牛群中鉴别出感染野生型IBRV的牛,实现了控制并清除IBR的目的。目前,国内尚未开发出优质的商品化IBRV检测试剂盒,进行相关诊断技术的研究和开发势在必行。为了获得具有完整功能重组gE蛋白,本研究采用杆状病毒表达系统表达了IBRV gE基因全长,并在其5′端引入蜂素信号肽（Honeybee Melittin Signal Peptide,HBM）以增加表达蛋白的分泌,在3′端引入6×His标签以方便纯化重组蛋白。将PCR扩增的融合gE基因片段（r HBM-gE）克隆至p Fast Bac1供体质粒中,构建重组质粒p FB-gE。将测序正确的p FB-gE转化至DH10Bac感受态细胞中获得重组杆粒（r Bacmid-gE）,经PCR鉴定后将r Bacmid-gE转染至Sf21细胞,获得重组杆状病毒（r BV）。对不同代次的r BV进行PCR鉴定,结果显示获得了已整合了gE基因并能稳定传代的r BV。间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）结果显示,接种不同代次r BV的Sf21细胞与gE抗体阳性牛血清反应,细胞质和细胞膜均出现绿色荧光信号,而与阴性牛血清不反应,表明gE基因成功在r BV上获得稳定表达。对r BV进行大量培养,收获培养上清液对重组gE蛋白（rgE）进行纯化。Western blot检测结果显示,rgE能与抗6×His标签单抗反应,同时也能与gE抗体阳性兔血清、牛血清和羊血清反应,与阴性兔血清和牛血清均不反应,表明rgE具有较强的反应原性。用rgE对小鼠进行2次免疫,通过间接ELISA方法检测小鼠血清gE抗体,结果发现,rgE可诱导小鼠产生特异性抗体,表明rgE具有良好的免疫原性。本实验采用rgE作为包被抗原,通过对rgE最佳包被量、待检血清和二抗最佳稀释度、最佳封闭条件、待检血清和二抗最佳作用时间等反应条件进行摸索和优化,以求获得较好的敏感性、特异性和重复性,建立了检测IBRV gE抗体的间接ELISA方法。以70份IBRV阴性血清作为标准参考血清进行检测,确定本方法的临界值为0.401。特异性实验结果表明本方法包被的抗原只与IBRV阳性血清反应,而与BTV、BAV、BPV、BVDV、BEV和BPIV3等其他较常见牛的病原的阳性血清不反应,特异性较强。敏感性实验显示,中和抗体滴度为1:8的IBRV阳性牛血清稀释200倍后仍呈现阳性反应,敏感性较高。批内和批间重复试验显示变异系数均小于10%,表明本方法重复性较好。同时用本方法和ID.vet牛传染性鼻气管炎病毒gE抗体检测试剂盒对372份现地血清进行检测,结果显示,本方法的检测结果与ID.Vet试剂盒的检测结果的阳性符合率为97.03%,阴性符合率为80.39%,总符合率为92.47%,可用于现地牛血清gE抗体的初次筛查。本研究还尝试使用环磷酰胺（Cyclophosphamide,CP）减弱小鼠针对IBRV其他蛋白的免疫应答,以制备针对gE的单克隆抗体,即先用纯化后的gE缺失株IBRV-56免疫小鼠,用CP进行免疫抑制后再免疫全病毒IBRV Bartha nu/67株。最后取小鼠的脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer test,IPMA）筛选获得了2株单抗,分别命名为5-E9和6-D7;亚类鉴定结果显示2株单抗的重链均为Ig G1,轻链均为kappa链。所得腹水效价均为104。Western blot结果显示,2株单抗能同时与IBRV-56和Bartha nu/67株反应,都有良好的反应性。IFA结果显示,2株单抗只与接种IBRV的MDBK细胞呈阳性反应,与接种BVDV、BPIV3的MDBK细胞和正常MDBK细胞均不反应,表明2株单抗都有良好的特异性。经Western blot和质谱分析,证明2株单抗均针对IBRV的VP8蛋白。综上所述,本研究获得了抗原性良好的rgE,以rgE为包被抗原,建立了检测gE抗体的间接ELISA方法,该方法具有较好的敏感性、特异性、可重复性,可用于现地牛血清gE抗体的初次筛查,为从接种IBRV gE缺失疫苗的牛群中鉴别出野生型IBRV感染的牛提供了物质基础。另外,获得了2株具有良好反应性和特异性的针对IBRV VP8蛋白的单抗,分别命名为5-E9和6-D7。本研究为IBRV gE缺失疫苗的研制及推广应用提供了技术支持,为IBRV的防控提供了一定的技术保障,为gE和VP8蛋白的结构和功能研究奠定了一定的物质基础。
伍春平[5]（2021）在《A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定》文中研究说明A型塞内卡病毒（Senecavirua A,SVA）属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属,能引起各日龄的猪群出现类似口蹄疫等水泡性疾病样临床症状,并造成新生仔猪急性死亡,严重危害我国养猪业的发展。由于塞内卡病毒病是一种新发的传染病,以往的研究主要集中在其生物学特性上,而关于SVA疫苗、侵入机制和免疫机理等方面的研究甚少。VP1、VP2和VP3是SVA表面的结构蛋白,其既包含介导病毒入侵宿主细胞的受体结合域,也包含激发机体免疫应答产生中和抗体的抗原表位。因此,本研究对SVA这3个结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定,为SVA的病原学、诊断方法、抗原结构和新型表位疫苗的研究奠定了基础。本实验室前期利用分离获得的SVA田间流行毒株CH-FJ-2017制备了SVA灭活疫苗,并以此免疫猪群,获得免疫血清SOW6-1、PC6-2和PC4-3。本研究首先对3个免疫血清的生物学特性进行了分析鉴定。间接ELISA试验结果表明这些免疫血清与SVA的结构蛋白均具有良好的亲和性,Western Blotting（WB）和间接免疫荧光试验（Indirect Immunofluorescence Assay,IFA）结果表明这些血清与SVA及其结构蛋白均具有良好的免疫反应性,病毒中和试验（Virus Neutralization Test,VNT）结果表明这些血清对SVA流行毒株的中和效价大于1024。然后结合生物信息学预测法和交叠多肽生物合成法,并利用免疫血清对SVA 3种结构蛋白的B细胞抗原表位进行了筛选与鉴定。通过Protparam和PSIPRED在线软件对这3种结构蛋白的理化特性和二级结构进行分析。利用Bcepred、ABCpred、Bepipred、IEDB、SVMpred、Ellipro和SEPPA2.0等7种生物信息预测软件,对各结构蛋白的B细胞抗原表位进行综合分析。合成预测的抗原表位,并通过ELISA试验进行验证。最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出3、6和3个B细胞抗原表位。为进一步提高鉴定的准确性,基于这3种结构蛋白的氨基酸序列,构建96个带GST188标签的交叠16肽,相邻交叠多肽之间重叠8个氨基酸残基,并将这些肽段克隆至pXXGST-1原核表达载体,进行大肠杆菌表达。通过WB试验分析这些交叠多肽与血清的免疫反应性,最终在VP1、VP2和VP3蛋白上分别鉴定出7、13和5个阳性片段。最后对筛选的B细胞抗原表位进行了免疫原性分析。根据以上两种方法的筛选结果,选择并合成两种方法鉴定一致性较好的抗原表位,将这些抗原表位分别与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联,并通过豚鼠免疫试验制备血清。这些免疫血清与SVA结构蛋白具有良好的免疫反应性和较高的亲和力,且能特异性识别IBRS-2细胞中感染的SVA。综上所述,本研究鉴定出SVA VP1蛋白2个线性B细胞抗原表位VP1-1（6-21 aa）和VP1-2（221-233 aa）,VP2蛋白4个线性B细胞表位VP2-1（5-16 aa）、VP2-2（35-57 aa）、VP2-3（175-187aa）和VP2-4（267-282 aa）,VP3蛋白1个线性B细胞抗原表位VP3-1（135-153 aa）,并且这些表位都具有能激发机体免疫应答的能力,为进一步研究VP1、VP2和VP3蛋白的功能、诊断方法和新型SVA表位疫苗的研究奠定了基础。
施鹏飞[6]（2021）在《犬瘟热病毒H蛋白和犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的筛选》文中研究指明犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）和犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）当前是威胁宠物健康和毛皮动物养殖的重要病毒性疾病。犬瘟热血凝素蛋白（hemagglutinin protein）是CDV趋向性中起主要作用的蛋白,可以诱导宿主产生中和抗体。犬细小病毒VP2基因大多数非同义突变影响CPV的抗原性和宿主范围,依据VP2蛋白的氨基酸位点突变,病毒被划分为CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、New CPV-2a、New CPV-2b等基因型。关键性位点的突变可能对现有诊断方法造成影响。因此对CDV H蛋白,CPV VP2蛋白单克隆抗体的制备和线性表位的鉴定有助于相关疾病抗体诊断试剂的研发。本研究以亚洲I型CDV毒株H基因为模板扩增5’端612bp,将该片段连接到原核表达载体中。测序正确的阳性质粒诱导表达,纯化目的蛋白经过蛋白电泳和考马斯亮蓝染色鉴定结果显示重组H蛋白约30k Da,Western blot的特异性条带进一步验证了截短H蛋白具有良好的免疫反应性。随后以纯化的H蛋白免疫BALB/c小鼠,三次免疫后进行细胞融合,筛选之后进行扩大培养。制备的2株CDV H蛋白单抗1A5,2B8可以和CDV-PS、CDV-R毒株特异性反应。单抗1A5和CDV3毒株没有特异型结合条带产生,单抗1A5识别的抗原表位是178ARGDIFPPY186,表明CDV不同亚型毒株的178-186位氨基酸存在着决定性的突变,导致了识别区域的性质改变;血清学实验和蛋白结构学分析显示两个表位都有较高的实用价值。犬瘟热单抗2B8抗原表位是120QKTNFFNPNREFDFR134。抗原表位比对和保守性分析表明,在多个不同亚型毒株中单抗1A5的抗原表位均有突变,可能和表位所在蛋白的相关区域有关;在Asia-1型、Asia-2型、America-1型、America-2型、Europe型、Arctic型毒株中120-134氨基酸序列高度保守。针对CPV VP2采取相同的策略,采取原核表达并且纯化蛋白,制备了VP2蛋白的单克隆抗体5B18。单克隆抗体5B18均能与我国境内不同地域分离的CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、FPV毒株产生了预期的特异性条带。将VP2分段表达后,检测MAb 5B18识别表位所在区域,然后间接ELISA鉴定出线性表位140SFEQEIFNVVLKTV153,在不同犬细小病毒亚型中高度保守,这个表位在跨物种细小病毒检测方面有很大的潜力。本研究共获得2株抗CDV H蛋白和1株抗CPV VP2蛋白单克隆抗体,鉴定出2个犬瘟热H蛋白表位和1个犬细小VP2蛋白表位。为进一步研究蛋白的功能和疾病的检测净化提供了相应的工具。保守性高的表位在检测不同亚型和宿主来源的样品中有很大的应用潜力。
罗煜杭[7]（2021）在《戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用》文中研究表明戊型肝炎（Hepatitis E）是一种由戊型肝炎病毒（HEV）引起的自限性疾病。大多数个体感染后若干周内能够自行康复,但在器官移植患者、血液肿瘤患者和HIV感染者中,HEV感染后将会引起慢性肝炎,并迅速发展为肝纤维化和肝硬化,同时伴有病毒性脑炎、后循环缺血、周围神经病变等肝外症状。在我国,HEV-1和HEV-4是造成戊型肝炎的主要病原体。其中,HEV ORF3蛋白在病毒感染早期表达且会引起体内抗体的产生,因此抗ORF3蛋白抗体的滴度检测可以作为早期急性感染、慢性感染或准包膜状态的辅助诊断指标。目前市面上HEV商品化检测试剂盒主要利用间接ELISA方法进行检测,其灵敏性和特异性较高,可以同时检测HEV-1到4型,但该方法对包被抗原的纯度要求较高,且无法进行不同基因型鉴别诊断。基于此,本研究选取基因1型HEV的代表株SAR55,利用原核表达系统表达可溶性HEV-1 ORF3SAR55重组蛋白,并利用该蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤融合技术筛选制备了抗HEV-1的ORF3蛋白的单克隆抗体,并通过与HEV-3和HEV-4 ORF3抗原交叉反应筛选得到1株抗HEV-1 ORF3蛋白特异性的单抗,并进行HRP标记,利用标记的HRP蛋白建立了检测人血清中抗HEV抗体的竞争ELISA,为HEV感染的临床诊断提供了新方法。本研究的主要内容和结果如下:1.成功构建了pET-21b-ORF3SAR55重组质粒,将其导入表达菌BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明成功表达出与预期大小一致14 k Da的可溶性ORF3SAR55重组蛋白;利用Ni柱亲和层析法进行纯化,得到了纯度较高的ORF3SAR55重组蛋白,产量约为32 mg/L。2.利用ORF3SAR55重组蛋白免疫Balb/c小鼠,冲击免疫一周后采集脾脏进行细胞融合,并通过i ELISA及亚克隆筛选,获得3株稳定分泌ORF3SAR55抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C11,1D2和8H8。将杂交瘤细胞腹腔注射给小鼠10天后收集腹水,利用Protein G beads纯化后成功获得了单克隆抗体,同时对单抗亚型进行鉴定,结果显示3C11属于Ig G2b,1D2和8H8均属于Ig G2a,且与HEV-3和HEV-4 ORF3蛋白交叉反应显示,单抗1D2与HEV-1 ORF3蛋白特异反应,不同其它基因型的反应。3.将单抗1D2与HRP进行体外标记,然后利用HRP-1D2为竞争试剂,ORF3SAR55蛋白为包被抗原,建立了HEV抗体检测的竞争ELISA。该方法的抗原最佳包被量为50μg/孔,HRP-1D2（1 mg/m L）最佳稀释度为1:1000,血清最佳稀释比为1:10,反应时间为37℃1 h;其敏感性为100%,特异性为99.2%;板内板间变异系数为1.38%～7.13%。并且与基因3型HEV抗体阳性兔血清和4型阳性猪血清无竞争性。综上所述,本研究成功筛选和制备了抗基因1型HEV ORF3蛋白的单抗,并成功偶联HRP,利用该HRP标记单抗建立了检测人血清中HEV抗体的竞争ELISA方法,为临床中HEV感染的检测提供了新的方法。
郝文君[8]（2020）在《牛传染性胸膜肺炎抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用》文中认为牛传染性胸膜肺炎（CBPP）是由丝状支原体丝状亚种（Mmm）引起的一种危害严重的接触性传染病,被世界动物卫生组织（OIE）列为需要上报传染病。我国于2011年5月被世界动物卫生组织（OIE）宣布为无牛肺疫国家,为保持无疫状态我国每年都会按OIE要求在全国范围内开展CBPP血清学监测。在进行CBPP的血清学检测时,由于没有国产化的试剂盒,因此只能使用进口竞争ELISA（c ELISA）试剂盒开展检测。进口试剂盒其检测成本较高、供货期长,不能满足该病大规模监测及有效防控的要求。虽然我国目前未发现CBPP感染病例,但该病在我国周边国家仍存在流行,传入我国的风险很大。因此,本研究围绕CBPP的血清学诊断方法开展研究,以期为我国CBPP大规模监测提供经济有效的检测手段,也为CBPP传入我国的风险评估和应急防控提供有效技术储备。由于支原体没有细胞壁,其锚定于质膜胞外的表面脂蛋白与宿主直接相互作用,引发机体强烈的免疫反应。表面脂蛋白在支原体诊断和致病性方面都引起了极大的关注,已被报道具有诊断抗原的潜能。因此本实验室通过生物信息学分析,初步筛选到12个脂蛋白进行后续研究。利用原核表达系统获得各候选脂蛋白,通过初步ELISA检测和Western Blot分析,筛选到特异性和抗原性较好的rP0308。将纯化的rP0308作为包被抗原,通过优化反应条件和确定临界值建立基于rP0308的间接ELISA方法。通过试验确定ELISA的最适工作条件,结果显示抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL;血清1:80稀释37℃作用1h;最佳封闭条件为1%的鱼明胶4℃封闭过夜;二抗最佳工作条件为酶标二抗1:5000稀释37℃作用45min;最佳显色时间是TMB37℃显色10min;阴阳性临界值为0.36。为进一步评价其性能,对该方法的敏感性、特异性、灵敏性、交叉反应性、重复性及与OIE推荐的检测试剂盒的符合率等进行了分析。结果显示:该方法的敏感性为92%,最低检出上限为1280倍;特异性为96%,与其他几种常见的牛源性呼吸道疾病的阳性血清无交叉反应。批内和批间变异系数分别为2.41%-6.03%和2.94%-6.59%,均小于10%,重复性较好。利用本方法和OIE推荐的竞争ELISA试剂盒分别对实验室保存的1648份临床样品进行检测,两种方法的总符合率为88.7%。组装试剂盒4℃密封保存8个月性能良好。上述结果表明,该方法的敏感性、特异性、重复性均良好,具有一定的应用前景,为进一步开发CBPP检测试剂盒提供实验室依据。
何吉鑫[9]（2020）在《检测滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的研制和间接ELISA方法的建立》文中研究说明滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）是危害家禽养殖业的重要病原之一。家禽感染后呈长期带菌状态,导致生产性能下降,造成严重经济损失。目前针对MS抗体的检测方法主要有血凝抑制试验（Hemagglutination inhibition test,HI）及酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）等方法。HI 试验操作简便、成本低、特异性高,但目前缺少可长期稳定保存的商品化抗原;ELISA灵敏度高、适合大量样品的检测,但进口商品化试剂盒的价格昂贵,检测成本较高。为了给我国MS感染的综合防控与净化提供技术支持,本研究拟研制一种可长期稳定保存的MS冻干血凝抑制试验抗原;同时,以基因工程表达的重组MSPB抗原（rMSPB）作为包被抗原,建立一种可替代国外同类产品的检测MS抗体的间接ELISA方法。1冻干MS血凝抑制试验抗原的研制及应用从本实验室MS流行菌株库中筛选出一株复制能力强、血凝特性稳定的分离株JS2018-4,通过优化抗原灭活工艺、浓缩工艺和冻干工艺,研制出一种稳定性好、特异性强的MS冻干血凝抑制试验抗原,进而优化确定了检测MS抗体的HI试验方法。使用本方法检测了 148份参考血清样品（包含47份SPF鸡阴性血清样品和101份经MS人工感染SPF鸡制备的阳性血清样品）,通过受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）分析结果,确定了相应的判定标准:HI效价≥1:80,判为阳性;1:40≤HI效价<1:80,判为疑似阳性;HI效价<1:40则判为阴性。经检验,该冻干血凝抑制试验试验抗原具有良好的特异性和稳定性,与鸡毒支原体（MG）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）多种病原阳性血清均不发生交叉反应,且于4℃条件下保存12个月仍可维持效价不变。使用该血凝抑制试验抗原建立的HI试验方法和商品化ELISA试剂盒平行检测453份临床血清样品和40份不同抗体滴度的血清样品,结果显示,两者阴阳性符合率分别为100%和77.07%;且两者检测结果呈现的抗体高低趋势一致,表明本研究建立的HI试验方法具备较高的临床应用价值。2基于重组蛋白rMSPB的MS抗体间接ELISA检测方法的建立通过对MS流行株JS2018-4的vlhA基因序列以及氨基酸序列进行分析,选取了抗原性较好的MSPB（6aa-312aa）和MSPA（485aa-720aa）分别进行PCR扩增。通过pET表达系统进行原核表达,获得了 2个携带His标签的融合蛋白。SDS-PAGE鉴定结果显示,2个融合蛋白在BL21（DE3）中均以包涵体形式表达,大小分别为54 kDa和46 kDa,与预期相符;Western-Blot鉴定显示两者均能与MS单因子阳性血清发生特异性反应,分别命名为rMSPB和rMSPA。经过变性、纯化、复性,获得高纯度的重组蛋白作为包被抗原进行ELISA方法的建立。通过比较,使用rMSPB作为包被抗原检测效果优于rMSPA。将重组蛋白rMSPB作为包被抗原,经条件优化建立了检测MS抗体的间接ELISA方法。并制备了 MS标准血清和用于ELISA试验的阴阳性对照样品。使用本方法检测了 676份参考血清样品,通过ROC曲线分析确定了 S/P判定阴阳性的最佳临界值为:S/P=0.45;使用终点滴定法测定其中65份参考血清样品,通过回归分析获得样品最佳稀释倍数处的S/P值与抗体滴度的直线方程:Log10（抗体滴度）=1.148×Log10（1:800 处 S/P 值）+3.247（R2=0.9030）,从而实现了对样品中 MS 抗体的快速定量检测。经检验,该方法具有良好的特异性和重复性,与MG、AIV、NDV、IBV等多种病原阳性血清均不发生交叉反应,批内重复和批间重复变异系数均小于10%。使用本方法和商品化抗体检测试剂盒平行检测178份临床血清样品和207份同一鸡群不同日龄的血清样品,结果显示,两者阴阳性符合率分别为99.04%和98.65%;抗体消长趋势基本一致,表明该方法具备良好的检测效果。
孙瑶[10]（2020）在《以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究》文中指出阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种进行性发展的神经退行性疾病,是当代社会中老年人口中最常见的痴呆形式。AD的神经病理学特征包括由淀粉样蛋白（Aβ）形成的细胞外斑块、过度磷酸化微管相关蛋白（tau）积累形成的细胞内神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）和广泛的神经元丢失。长久以来,“淀粉样蛋白级联假说”认为Aβ肽的异常积累是AD发病的关键。然而,迄今为止,集中于减少Aβ沉积的Aβ免疫疗法均未产生临床上有意义的结果。因此,单纯通过消除Aβ病理学不足以达到治愈AD的效果,而开发靶向tau病理学的治疗手段也成为了一种非常有潜力的治疗策略之一。Tau蛋白是哺乳动物神经系统中的一种主要的微管相关蛋白（由microtubule-associated protein（MAPT）基因编码）,在生理条件下调节微管的组装和稳定性以及轴突运输。然而,在病理生理条件下,在AD和相关的病理性疾病（包括皮质基底变性（CBD）,进行性核上麻痹（PSP）,Pick病（PD）和额颞叶痴呆（FTLD））中,大量毒性表位的tau出现了异常高水平的磷酸化,如Ser202、Thr205、Ser238、Ser404等。MATP基因编码缺陷和tau蛋白过度磷酸化引起的疾病统称为tau蛋白病。迄今为止,散发性tau病中tau蛋白过度磷酸化的主要原因仍不确定。在家族性tau蛋白病患者中,已经鉴定出的包括G272V,P301L,P301S,V337M和R406W在内的遗传突变,易使tau蛋白过度磷酸化,从而损害了tau促进微管组装的能力。这些突变促进tau的聚集,形成成对的螺旋丝（PHF）和神经原纤维缠结（NFT）。为了研究tau病理在体内的病理过程和开发基于tau病理的药物,科学家们开发了一系列表达人突变tau基因的模型动物。这些tau转基因小鼠模型具有一些重要的AD病理特征,包括突触病理学、NFT形成和神经元丢失,已经成为探索tau功能障碍的机制和开发神经退行性疾病疗法的重要工具。其中TauP301S（PS19系）就是一种被广泛使用的阿尔茨海默tau病理小鼠模型。P301S转基因小鼠脑内人源tau蛋白表达水平比内源性tau小鼠高约5倍,从而导致P301S小鼠在脑内快速产生较为严重的tau病。P301S转基因小鼠在6月龄时产生tau纤维并逐渐发育,其在9-12月龄是逐渐富集并伴有明显的神经元死亡和脑萎缩。除此之外,tau转基因小鼠也存在肌肉萎缩和运动功能失调等行为学异常。然而,虽然目前P301S小鼠被广泛应用于AD药物的临床前评价中,普遍采用行为学和病理学等实验对药物的有效性进行评价,但对该小鼠模型的行为学、病理学、血清学等指标随年龄变化的趋势以及他们之间的关系知之甚少。另外,在老年痴呆疾病的流行病学研究中发现,男性和女性人群的AD发病率、发病症状、生存期等方面存在明显差异,但性别差异在以P301S小鼠为模型的药物研究中并未受到关注。在本研究中,我们首先系统地考察了不同性别和年龄的Tau P301S转基因小鼠在行为学、tau病理学、以及血浆和脑生物标志物方面的差异,并探究了tau蛋白病进程中这些因素之间的相关性,也筛选到了一些可以指示P301S小鼠tau病理发展的潜在的生物标记物指标。结果表明,与野生型同窝小鼠相比,雄性P301S转基因小鼠在体重、存活率、后肢夹紧评分、脊柱后凸评分、复合表型评分总分、筑巢能力、脑中pTau（S202/T205）和胶质细胞水平方面表现出显着变化。相比之下,雌性P301S转基因小鼠仅对水迷宫实验和实验开放旷场实验敏感。此外,我们发现了血浆中巨噬细胞炎症蛋白（MIP-3α）缺乏和干扰素（IFN-γ）、白介素-5（IL-5）、IL-6上调,这些因子可以作为潜在的AD生物标志物。目前靶向磷酸化tau的主动免疫疗法是新型的AD治疗方法。然而现在处于临床前或临床阶段的Tau表位疫苗最多携带两个磷酸化位点,治疗效果有限。主动疫苗如何在体内维持高水平、长时程的抗体也有待探究。另外,疫苗的作用机制也未得到深入研讨。为解决这些问题,我们研发了一种以诺如病毒P颗粒为载体的靶向磷酸化tau病理位点的主动疫苗,并在P301S小鼠中进行免疫原性、安全性和有效性的评估。为了筛选出最优的tau疫苗的磷酸化表位,我们对AD患者中最易出现高度磷酸化tau位点的附近的截短的多肽进行组合,并筛选出了具有Ser202、Thr205、Ser396、Ser404磷酸化靶点的pTau31多肽抗原表位,该多肽可在在体内诱导产生针对四种磷酸化表位的特异性抗体,且不会产生针对磷酸化和非磷酸化tau蛋白的T细胞免疫反应。随后,我们将合成的pTau31多肽通过半胱氨酸/空气氧化法偶联到诺如病毒P颗粒蛋白载体上,成功获得以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗,PP-pTau31。我们在几种候选佐剂中筛选了能引起高抗体水平的、诱导的抗体持续时间长且无T细胞免疫反应风险的CpG和AS02佐剂组合用于主动疫苗的免疫。我们在P301S转基因小鼠中对PP-pTau31疫苗的免疫原性、安全性和有效性等方面进行考察。结果显示,PP-pTau31疫苗可成功降低P301S小鼠脑内磷酸化tau蓄积、降低脑内胶质细胞增生、缓解tau相关的运动功能障碍及改善认知水平,且不会诱发针对磷酸化和非磷酸化tau的T细胞免疫反应、无体内炎症因子和趋化因子异常,无脏器毒性。另外,我们还对PP-pTau31疫苗诱导的抗体的作用机制进行了探讨。结果表明,pTau31特异性抗体可能通过多种途径降低tau病理的影响:（1）血液中抗体通过结合血中游离的pTau造成血/脑中pTau浓度差,促进脑内病理tau蛋白外排入血,从而降低脑中磷酸化tau蛋白含量;（2）部分血液中的抗体跨越血脑屏障,结合脑中游离的病理tau蛋白,抑制其对神经元的毒性作用;（3）部分血液中的抗体跨越血脑屏障,与脑中的NFT结合形成抗体-抗原复合物,使其降解从而降低tau病理。综上,我们成功完成对TauP301S转基因鼠的行为学、病理学、血清学等方面的研究,掌握了各指标与发病进程的相关性,并发现了MIP-3α等潜在的生物标志物。在此基础上,我们也完成了一种以诺如病毒P颗粒为载体的Tau表位疫苗的开发,PP-pTau31。结果表明该疫苗可在TauP301S模型小鼠中产生高水平、长时间存在的pTau特异性抗体,在行为学、病理学等方面降低发病特征,并无T细胞免疫反应、细胞因子异常及脏器损伤等安全风险。
二、ELISA方法和血清学方法筛选群体反应性抗体的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、ELISA方法和血清学方法筛选群体反应性抗体的比较（论文提纲范文）
（1）口蹄疫病毒A型牛源单个B细胞中和抗体的筛选及竞争ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口蹄疫研究进展 |
| 1.1.1 口蹄疫流行概况 |
| 1.1.2 口蹄疫病毒抗原结构 |
| 1.2 口蹄疫疫苗质量评价方法 |
| 1.3 单克隆抗体的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 FMDV A型抗原特异性单个B细胞抗体的制备 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验细胞及毒株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2 FMDV146S、12S抗原的制备及鉴定 |
| 2.2.3 牛外周血单个核细胞的分离 |
| 2.2.4 特异性单个淋巴细胞的分选 |
| 2.2.5 单个B细胞PCR扩增 |
| 2.2.6 表达载体的构建 |
| 2.2.7 单个B细胞抗体的表达纯化 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 FMDV 146S、12S抗原的制备及鉴定 |
| 2.3.2 特异性单个淋巴细胞的分选 |
| 2.3.3 巢式PCR扩增IgG VH、VL链 |
| 2.3.4 单个B细胞抗体的表达及鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 单个B细胞抗体反应特性研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 细胞及毒株 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 流式分析检测抗体反应性 |
| 3.2.2 146S特异性验证 |
| 3.2.3 病毒中和试验(VNT)检测抗体中和活性 |
| 3.2.4 间接ELISA检测抗体的反应活性 |
| 3.2.5 间接免疫荧光试验(IFA)验证广谱中和抗体反应性 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 流式分析验证抗体反应性 |
| 3.3.2 146S抗原特异性验证 |
| 3.3.3 单个B细胞抗体的中和性验证 |
| 3.3.4 中和抗体的结合活性检测 |
| 3.3.5 中和抗体的反应性验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 FMDV A型竞争ELISA方法的建立 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 生物素标记单个B细胞抗体W145 |
| 4.2.2 FMDV A型 NAC-ELISA方法最佳反应条件的确定 |
| 4.2.3 临界值的确定及特异性、敏感性测定 |
| 4.2.4 NAC-ELISA交叉反应性试验 |
| 4.2.5 NAC-ELISA与 VNT相关性试验 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 反应条件的优化结果 |
| 4.3.2 临界值的确定及特异性、敏感性测定 |
| 4.3.3 NAC-ELISA交叉反应性试验 |
| 4.3.4 NAC-ELISA与 VNT相关性试验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）基于非洲猪瘟病毒p35蛋白间接ELISA方法的建立及单克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 ASFV概况 |
| 1.2 ASF病原学检测技术 |
| 1.2.1 病毒分离(VI)和血细胞吸附(HAD)试验 |
| 1.2.2 抗原检测技术 |
| 1.2.3 ASFV基因组检测 |
| 1.3 血清学诊断技术 |
| 1.3.1 酶联免疫吸附试验 |
| 1.3.2 免疫印迹试验(WB) |
| 1.4 单克隆抗体技术 |
| 1.4.1 单克隆抗体的原理 |
| 1.4.2 单克隆抗体在ASF诊断和防治中的应用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 非洲猪瘟病毒P35 蛋白间接ELISA方法的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、细胞、菌株/毒株及动物 |
| 2.1.2 主要药品及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ASFV p35 基因和p30 基因的获取 |
| 2.2.2 ASFV p35 重组蛋白的制备 |
| 2.2.3 ASFV p30 重组杆状病毒的制备 |
| 2.2.4 ASFV p35和p30 重组蛋白的免疫印迹和间接免疫荧光鉴定 |
| 2.2.5 p35-ELISA 方法和p30-ELISA 方法的建立 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.3.2 重组蛋白的表达和鉴定 |
| 2.3.3 p35-ELISA 方法和p30-ELISA 方法的建立及比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 非洲猪瘟病毒P35 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 引物 |
| 3.1.2 质粒、菌株、细胞及动物 |
| 3.1.3 主要药品及试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫原的制备 |
| 3.2.2 小鼠免疫及抗体效价测定 |
| 3.2.3 ASFV p35 重组杆状病毒的制备 |
| 3.2.4 SP2/0 骨髓瘤细胞的制备 |
| 3.2.5 免疫脾细胞的制备 |
| 3.2.6 饲养细胞的制备 |
| 3.2.7 细胞融合及筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 3.2.9 小鼠腹水制备 |
| 3.2.10 单克隆抗体的效价测定 |
| 3.2.11 单克隆抗体的亚类鉴定 |
| 3.2.12 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 p35 重组杆状病毒的构建 |
| 3.3.2 p35 蛋白免疫小鼠血清效价检测 |
| 3.3.3 细胞融合与亚克隆 |
| 3.3.4 Western-blot检测 |
| 3.3.5 间接免疫荧光分析 |
| 3.3.6 单克隆抗体亚类鉴定和腹水效价测定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）基于不同微球标记非洲猪瘟病毒和口蹄疫A型病毒免疫层析检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 英文缩略表 |
| 第一篇 综述 |
| 1 研究目的与意义 |
| 1.1 胶体金免疫层析技术在非洲猪瘟病毒抗体检测中的应用 |
| 1.2 以纳米颗粒为标记物的免疫层析技术在口蹄疫病毒抗体定量检测中的应用 |
| 2 动物疫病诊断技术研究现状 |
| 2.1 新一代测序技术 |
| 2.2 液相阻断ELISA |
| 2.3 间接血凝试验 |
| 2.4 病毒分离 |
| 2.5 RT-PCR |
| 2.6 生物传感器技术 |
| 3 免疫层析技术简介 |
| 3.1 免疫层析检测试纸条原理 |
| 3.2 免疫层析检测试纸条特点 |
| 4 胶体金免疫层析技术 |
| 4.1 胶体金标记技术经历的发展阶段 |
| 4.2 胶体金颗粒的结构和特性 |
| 4.3 胶体金颗粒制备方法 |
| 4.4 免疫胶体金的制备 |
| 5 纳米标记物新型免疫层析检测技术 |
| 5.1 新型纳米标记物的种类 |
| 5.2 具有类酶活性的纳米材料的结构及特点 |
| 5.3 具有类酶活性的合金纳米颗粒的制备 |
| 5.4 免疫合金纳米颗粒的制备 |
| 第二篇 试验部分 |
| 第一章 非洲猪瘟病毒抗体胶体金定性免疫层析检测方法的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 ASFV p30 基因重组质粒和血清样品 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 ASFV 重组 p30 蛋白的表达纯化及鉴定 |
| 2.4 猪抗ASFV p30 蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.5 猪抗ASFV p30 蛋白抗体的纯化 |
| 2.6 胶体金颗粒的制备 |
| 2.7 ASFV p30 蛋白胶体金颗粒标记及纯化 |
| 2.7.1 蛋白最适标记量 |
| 2.7.2 蛋白最适标记p H |
| 2.8 试纸条组装及诊断方法的建立 |
| 2.9 特异性试验 |
| 2.10 敏感性试验 |
| 2.11 重复性试验 |
| 2.12 ASFV抗体检测试纸条与ELISA方法平行比对试验 |
| 2.13 稳定性试验 |
| 2.14 临床应用评价试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 ASFV重组p30 蛋白的鉴定和纯化 |
| 3.2 猪抗 ASFV 重组 p30 蛋白抗体的纯化 |
| 3.3 胶体金颗粒紫外吸收光值以及电镜结果 |
| 3.4 p30 蛋白胶体金颗粒最适标记条件 |
| 3.4.1 非洲猪瘟病毒p30 蛋白最适标记量 |
| 3.4.2 最佳pH的选择 |
| 3.5 免疫胶体金的制备 |
| 3.6 反应时间的确定以及阴、阳性判定标准的建立 |
| 3.7 特异性试验结果 |
| 3.8 敏感性试验结果 |
| 3.9 重复性试验结果 |
| 3.10 试纸条与进口竞争 ELISA 方法平行比对试验结果 |
| 3.11 稳定性实验结果 |
| 3.12 临床应用评价试验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 口蹄疫A型病毒抗体定量免疫层析检测方法的建立 |
| 第一节 抗原筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 抗原 |
| 2.1.2 检测血清 |
| 2.1.3 主要试剂和仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 口蹄疫 A 型病毒 AF/72、Re-A/WH/09 株 146S 抗原的制备 |
| 2.2.2 口蹄疫 A 型病毒 AF/72、Re-A/WH/09、A/GD/MM/13 株原核表达 VP1 蛋白纯化与鉴定 |
| 2.2.3 抗原筛选实验 |
| 2.2.3.1 抗原活性比较实验 |
| 2.2.3.2 间接ELISA方法建立 |
| 2.2.3.3 间接ELISA方法对不同抗原免疫反应验证 |
| 2.2.3.4 GICA方法建立 |
| 2.2.3.5 GICA方法对不同抗原免疫反应验证 |
| 3 结果 |
| 3.1 口蹄疫A型病毒AF/72、Re-A/WH/09株146S抗原含量 |
| 3.2 AF/72、Re-A/WH/09、A/GD/MM/13 株原核表达 VP1 蛋白鉴定结果 |
| 3.3 抗原筛选结果分析 |
| 3.4 建立间接ELISA方法检测血清样本结果分析 |
| 3.5 建立GICA方法检测血清样本结果分析 |
| 4 讨论 |
| 第二节 FMDV-A抗体的免疫层析定量分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 抗原和血清样品 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.3 FMDV标记抗原与检测抗原的制备 |
| 2.3.1 病毒液PEG浓缩 |
| 2.3.2 病毒液脱脂处理 |
| 2.3.3 病毒液超速离心浓缩 |
| 2.3.4 蔗糖密度梯度离心纯化 |
| 2.3.5 146S 病毒颗粒提取与含量测定 |
| 2.4 兔抗口蹄疫A型病毒抗体的制备与纯化 |
| 2.4.1 兔抗口蹄疫A型病毒抗体制备及检验 |
| 2.4.2 兔抗口蹄疫A型病毒抗体的纯化 |
| 2.4.2.1 盐析 |
| 2.4.2.2 脱盐 |
| 2.4.2.3 亲和层析 |
| 2.4.2.4 纯化抗体含量测定 |
| 2.5 Pt-Pd合金纳米颗粒的制备 |
| 2.6 Pt-Pd合金纳米颗粒最适标记条件与标记量 |
| 2.6.1 Pt-Pd合金纳米颗粒最适缓冲体系的确定 |
| 2.6.2 Pt-Pd合金纳米颗粒最适标记抗原量的确定 |
| 2.7 Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条的制备 |
| 2.8 样品检测及结果判定 |
| 2.8.1 定性检测 |
| 2.8.2 定量检测 |
| 2.8.2.1 判定值(CUT-OFF)的确定 |
| 2.8.2.2 定量检测结果判定 |
| 2.8.2.3 定量检测重复性试验 |
| 2.9 敏感性与特异性试验 |
| 2.10 Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条与LPB-ELISA抗体效价相关性分析 |
| 2.11 稳定性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 FMDV纯化146S抗原含量的确定 |
| 3.2 兔抗口蹄疫A型病毒抗体的制备及检验 |
| 3.3 纯化抗体含量测定 |
| 3.4 Pt-Pd合金纳米颗粒的电镜结果 |
| 3.5 最适标记条件的确定 |
| 3.6 检测线与质控线最佳包被量的确定 |
| 3.7 金标垫、检测线与质控线最佳点喷量的确定 |
| 3.8 试纸条结果判定 |
| 3.8.1 定性检测结果判定标准 |
| 3.8.2 定量标准曲线建立 |
| 3.8.3 定量检测结果判定标准 |
| 3.9 重复性试验结果 |
| 3.10 敏感性与特异性结果 |
| 3.11 灵敏度最低检测限试验结果 |
| 3.12 Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条与LPB-ELISA比对实验相关性分析 |
| 3.13 稳定性试验结果 |
| 3.13.1 37℃加速实验 |
| 3.13.2 4℃保存期实验 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（4）牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白的表达及诊断方法的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛传染性鼻气管炎概述 |
| 1.2 IBRV病原学研究 |
| 1.2.1 分类 |
| 1.2.2 形态结构及理化特性 |
| 1.3 IBRV的主要基因及其编码蛋白 |
| 1.4 致病性研究 |
| 1.5 IBRV诊断方法 |
| 1.5.1 病毒分离 |
| 1.5.2 核酸检测 |
| 1.5.3 病毒抗原检测 |
| 1.5.4 血清学检测 |
| 1.6 疫苗研究进展 |
| 1.6.1 灭活疫苗 |
| 1.6.2 亚单位疫苗 |
| 1.6.3 基因缺失标记疫苗 |
| 1.6.4 IBR的防控 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 第二章 牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白在重组杆状病毒中的表达及抗原性鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞、病毒、质粒、感受态细胞和动物 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 2.1.3 主要的仪器设备 |
| 2.1.4 血清样品 |
| 2.1.5 目的基因的扩增 |
| 2.1.6 目的基因的克隆及鉴定 |
| 2.1.7 重组杆粒(r Bacmid-gE)的构建及鉴定 |
| 2.1.8 重组杆状病毒(rBV)的获得及初步鉴定 |
| 2.1.9 rBV的间接免疫荧光(IFA)鉴定 |
| 2.1.10 rgE的大量制备、纯化及其表达量测定 |
| 2.1.11 rgE的 Western blot鉴定 |
| 2.1.12 rgE的免疫原性鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的基因的PCR扩增结果 |
| 2.2.2 rBacmid-gE的构建与鉴定结果 |
| 2.2.3 rBV的 PCR鉴定结果 |
| 2.2.4 rBV的 IFA鉴定结果 |
| 2.2.5 rgE的纯化及其表达量的测定结果 |
| 2.2.6 rgE的 Western blot鉴定结果 |
| 2.2.7 rgE的免疫原性鉴定结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 牛传染性鼻气管炎病毒gE-间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 病毒和血清样品 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.1.3 血清中和抗体测定方法 |
| 3.1.4 gE-间接ELISA方法的建立 |
| 3.1.5 临界值的确定 |
| 3.1.6 特异性试验 |
| 3.1.7 敏感性试验 |
| 3.1.8 重复性试验 |
| 3.1.9 符合率试验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 rgE包被量及待检血清最佳稀释度的确定 |
| 3.2.2 最佳包被条件的确定 |
| 3.2.3 最佳封闭液和封闭条件的确定 |
| 3.2.4 一抗、二抗最佳稀释液的确定 |
| 3.2.5 血清最佳作用时间的确定 |
| 3.2.6 二抗最佳稀释倍数的确定 |
| 3.2.7 二抗最佳作用时间的确定 |
| 3.2.8 显色液最佳作用时间的确定 |
| 3.2.9 临界值的确定 |
| 3.2.10 特异性试验结果 |
| 3.2.11 敏感性试验结果 |
| 3.2.12 重复性试验结果 |
| 3.2.13 符合率实试验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞、病毒和动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 病毒的培养纯化、灭活及乳化 |
| 4.1.5 动物免疫 |
| 4.1.6 阳性杂交瘤细胞筛选方法(IPMA)的建立 |
| 4.1.7 细胞融合 |
| 4.1.8 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.1.9 单抗特异性鉴定 |
| 4.1.10 单抗针对的目的蛋白的鉴定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 病毒纯化结果 |
| 4.2.2 小鼠免疫的结果 |
| 4.2.3 阳性杂交瘤细胞筛选方法(IPMA)的建立 |
| 4.2.4 单抗的筛选结果 |
| 4.2.5 单抗亚类鉴定 |
| 4.2.6 腹水纯化 |
| 4.2.7 腹水效价测定结果 |
| 4.2.8 Western blot鉴定结果 |
| 4.2.9 单抗5-E9和6-D7的IFA鉴定结果 |
| 4.2.10 质谱分析结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 A型塞内卡病毒研究概况 |
| 1.1.1 A型塞内卡病毒的分子特征 |
| 1.1.2 A型塞内卡病毒流行病学 |
| 1.1.3 A型塞内卡病毒病临床症状及病理特征 |
| 1.1.4 A型塞内卡病毒诊断与防控 |
| 1.2 抗原表位研究进展 |
| 1.2.1 抗原表位的概述 |
| 1.2.2 抗原表位的研究方法 |
| 1.2.3 表位的应用 |
| 1.2.4 A型塞内卡病毒抗原表位研究进展 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第二章 表位预测法鉴定A型塞内卡病毒B细胞抗原表位 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要溶液配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SVA灭活疫苗免疫血清的鉴定 |
| 2.2.2 SVA结构蛋白生物信息学分析 |
| 2.2.3 潜在表位的合成及纯度分析 |
| 2.2.4 潜在表位间接ELISA分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SVA灭活疫苗免疫血清的鉴定结果 |
| 2.3.2 VP1、VP2和VP3 蛋白生物信息学分析结果 |
| 2.3.3 ELISA分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 交叠多肽生物合成法鉴定A型塞内卡病毒B细胞抗原表位 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 交叠多肽原核表达质粒构建 |
| 3.2.2 重组质粒的鉴定与交叠多肽的表达 |
| 3.2.3 WB分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 交叠多肽的表达与鉴定 |
| 3.3.2 抗原表位WB鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 A型塞内卡病毒抗原表位免疫原性分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 仪器 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 抗原表位肽的KLH偶联 |
| 4.2.2 KLH偶联表位多肽免疫豚鼠 |
| 4.2.3 免疫血清ELISA分析 |
| 4.2.4 免疫血清的WB分析 |
| 4.2.5 免疫血清的IFA分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 免疫血清的抗体水平检测和抗体亲和力分析 |
| 4.3.2 免疫血清的免疫反应性分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A GST-188 蛋白的核苷酸序列 |
| 附录B SVACH-FJ-2017(ID: KY747510)核苷酸序列 |
| 附录C SVA结构蛋白的核苷酸序列 |
| 附录D SVA结构蛋白的核苷酸序列 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）犬瘟热病毒H蛋白和犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 犬瘟热病毒概述 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 分子生物学 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 检测与诊断 |
| 1.2 犬细小病毒概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 分子生物学 |
| 1.2.3 流行病学 |
| 1.2.4 犬细小病毒的预防 |
| 1.3 抗原表位鉴定方法的研究进展 |
| 1.3.1 生物信息学预测技术 |
| 1.3.2 合成肽扫描技术 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术 |
| 1.3.4 免疫亲和质谱技术 |
| 1.3.5 流式细胞仪检测技术 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 犬瘟热病毒H蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 实验细胞、病毒、载体及实验动物 |
| 2.1.2 实验设备及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 CDV H表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.2 CDV重组H蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.3 重组H蛋白的免疫反应性实验 |
| 2.2.4 动物免疫程序 |
| 2.2.5 细胞融合实验 |
| 2.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.2.7 杂交瘤细胞腹水的制备 |
| 2.2.8 单克隆抗体效价的测定 |
| 2.2.9 单克隆抗体特性鉴定 |
| 2.2.10 ELISA初步筛选H蛋白的抗原表位 |
| 2.2.11 精确鉴定H蛋白抗原表位 |
| 2.2.12 H蛋白抗原表位反应活性 |
| 2.2.13 H蛋白抗原表位的生物信息学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 重组质粒的鉴定 |
| 2.3.2 重组蛋白的表达与纯化结果 |
| 2.3.3 重组蛋白的免疫反应性结果 |
| 2.3.4 阳性杂交瘤的筛选结果 |
| 2.3.5 单克隆抗体的效价 |
| 2.3.6 单克隆抗体的特性 |
| 2.3.7 CDV H蛋白抗原表位鉴定 |
| 2.3.8 H蛋白抗原表位反应活性的分析 |
| 2.3.9 抗原表位的生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定 |
| 3.1 材料与方试剂 |
| 3.1.1 实验细胞、病毒、载体及实验动物 |
| 3.1.2 实验设备及试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 犬细小VP2蛋白表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2.2 犬细小重组VP2蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.3 重组VP2蛋白的免疫反应性实验 |
| 3.2.4 动物免疫程序 |
| 3.2.5 细胞融合实验 |
| 3.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.7 杂交瘤细胞腹水的制备 |
| 3.2.8 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.2.9 单克隆抗体特性鉴定 |
| 3.2.10 VP2蛋白抗原表位的初步确定 |
| 3.2.11 精确鉴定VP2蛋白抗原表位 |
| 3.2.12 VP2蛋白抗原表位反应活性 |
| 3.2.13 VP2蛋白抗原表位的生物信息学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的鉴定 |
| 3.3.2 重组蛋白的表达与纯化结果 |
| 3.3.3 重组蛋白的免疫反应性结果 |
| 3.3.4 杂交瘤细胞的筛选和单克隆抗体的效价 |
| 3.3.5 单克隆抗体的特性 |
| 3.3.6 VP2蛋白抗原表位的初步确定 |
| 3.3.7 精确鉴定VP2 蛋白抗原表位 |
| 3.3.8 VP2蛋白抗原表位反应活性 |
| 3.3.9 VP2蛋白抗原表位的生物信息学分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 研究中涉及到的毒株信息 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 戊型肝炎研究进展 |
| 1.1.1 戊型肝炎的分类 |
| 1.1.2 戊型肝炎的危害 |
| 1.1.3 病毒形态及理化特性 |
| 1.1.4 病毒的基因组结构 |
| 1.1.5 戊型肝炎病毒的检测方法 |
| 1.2 单克隆抗体技术 |
| 1.3 目的和意义 |
| 第二章 HEV-1 ORF3 蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 基础试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组表达载体的构建 |
| 2.2.2 ORF3~(SAR55)重组蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.3 ORF3~(SAR55)重组蛋白的纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ORF3~(SAR55)重组表达载体的构建 |
| 2.3.2 SDS-PAGE分析HEV-ORF3~(SAR55)重组蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.3.3 SDS-PAGE分析ORF3~(SAR55)重组蛋白的纯化情况 |
| 2.3.4 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 抗HEV-1 ORF3 蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验相关蛋白和细胞 |
| 3.1.2 试验相关试剂耗材 |
| 3.1.3 试验相关仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Balb/c小鼠的免疫与血清抗体效价检测 |
| 3.2.2 细胞融合 |
| 3.2.3 间接ELISA法筛选阳性克隆 |
| 3.2.4 细胞亚克隆 |
| 3.2.5 腹水的制备与纯化 |
| 3.2.6 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.2.7 间接ELISA检测单抗与免疫原的反应性 |
| 3.2.8 Western Blot检测单抗与免疫原的反应性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫后小鼠血清效价 |
| 3.3.2 腹水纯化单克隆抗体 |
| 3.3.3 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.3.4 间接ELISA检测单抗与抗原反应性 |
| 3.3.5 单克隆抗体的免疫印迹分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 抗HEV-1 ORF3 单克隆抗体竞争ELISA方法的建立与评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 相关血清 |
| 4.1.2 试验相关试剂耗材 |
| 4.1.3 试验相关仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂配置 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 人HEV阳性血清筛选 |
| 4.2.2 单克隆抗体的HRP标记 |
| 4.2.3 HRP标记的单克隆抗体与抗原的反应性 |
| 4.2.4 HRP标记的单克隆抗体与其他基因型HEV ORF3 蛋白的交叉反应性 |
| 4.2.5 基于HRP-IgG抗体的竞争ELISA方法的建立 |
| 4.2.6 竞争ELISA方法评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 人HEV阳性血清筛选 |
| 4.3.2 HRP标记的单克隆抗体效果检测 |
| 4.3.3 HRP标记的单克隆抗体与ORF3 抗原的反应性 |
| 4.3.4 基于ORF3~(SAR55)单克隆抗体的竞争ELISA方法的建立 |
| 4.3.5 竞争ELISA方法评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）牛传染性胸膜肺炎抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 支原体概述 |
| 1.2 牛传染性胸膜肺炎概述 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行历史和流行病学 |
| 1.2.3 临床症状和病理变化 |
| 1.2.4 防控 |
| 1.3 诊断方法 |
| 1.3.1 病原分离培养 |
| 1.3.2 分子生物学诊断 |
| 1.3.3 血清学诊断 |
| 1.4 表面膜蛋白相关研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 CBPP特异性抗原的筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、血清和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液及其配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 CBPP基因组的提取 |
| 2.2.2 候选基因的克隆及重组质粒的构建 |
| 2.2.3 重组质粒的表达与纯化 |
| 2.2.4 候选抗原的特异性分析 |
| 2.2.5 rP0308的免疫反应原性鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 候选基因的克隆及重组质粒的构建 |
| 2.3.2 重组质粒的表达与纯化 |
| 2.3.3 候选抗原的特异性分析 |
| 2.3.4 rP0308的免疫反应原性鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 间接ELISA方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 菌株和血清 |
| 3.1.3 生物信息学分析软件 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 主要溶液及其配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 间接ELISA相关试验条件的确定 |
| 3.2.2 阴阳临界值的确定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 CBPP抗体ELISA方法的建立 |
| 3.3.2 阴阳性临界值的确定 |
| 3.3.3 组装试剂盒 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 ELISA试剂盒的性能评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 ELISA试剂盒 |
| 4.1.2 血清样品 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 敏感性和灵敏性试验 |
| 4.2.2 特异性和交叉反应性试验 |
| 4.2.3 重复性试验 |
| 4.2.4 与商品化试剂盒的符合率 |
| 4.2.5 保存期试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敏感性和灵敏性试验 |
| 4.3.2 特异性和交叉反应性试验 |
| 4.3.3 重复性试验 |
| 4.3.4 与商品化试剂盒的符合率 |
| 4.3.5 保存期试验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）检测滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的研制和间接ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 滑液囊支原体感染净化监测技术研究进展 |
| 1 病原学概述 |
| 2 致病性及其危害 |
| 3 流行病学 |
| 4 防控与净化措施 |
| 4.1 疫苗免疫 |
| 4.2 种群净化 |
| 4.3 健全生物安全体系 |
| 4.4 药物防治 |
| 5 检测技术 |
| 5.1 分离鉴定 |
| 5.2 分子生物学检测 |
| 5.3 血清学检测 |
| 5.3.1 血清平板凝集试验 |
| 5.3.2 血凝抑制试验 |
| 5.3.3 酶联免疫吸附试验 |
| 6 MS感染净化监测技术研究展望 |
| 第一章 冻干MS血凝抑制试验抗原的研制及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 其他生物材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 菌种复苏 |
| 1.2.2 血凝抑制试验抗原备用菌株的筛选 |
| 1.2.3 血凝抑制试验抗原的制备 |
| 1.2.3.1 菌液培养时间的确定 |
| 1.2.3.2 灭活方式的筛选 |
| 1.2.3.3 浓缩方式的优化 |
| 1.2.3.4 冻干保护剂的初筛 |
| 1.2.3.5 冻干抗原的制备 |
| 1.2.3.6 抗原成品的检验 |
| 1.2.4 HI试验方法的优化 |
| 1.2.5 血凝抑制试验抗原在临床样品检测中的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 血凝抑制试验抗原制备条件的确定 |
| 2.1.1 血凝抑制试验抗原备用菌株的筛选 |
| 2.1.2 菌液培养时间的确定 |
| 2.1.3 灭活方式的确定 |
| 2.1.4 冻干抗原成品检验 |
| 2.1.4.1 物理性质检验 |
| 2.1.4.2 效价测定 |
| 2.1.4.3 特异性检验 |
| 2.1.4.4 稳定性检验 |
| 2.2 HI试验方法的优化 |
| 2.3 血凝抑制试验抗原在临床样品检测中的应用 |
| 3 讨论 |
| 第二章 基于重组蛋白rMSPB的MS抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与载体 |
| 1.1.2 MS分离株 |
| 1.1.3 主要生物试剂 |
| 1.1.4 主要实验仪器 |
| 1.1.5 其他生物材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 MSPB和MSPA蛋白的原核表达 |
| 1.2.1.1 引物设计 |
| 1.2.1.2 基因组的提取 |
| 1.2.1.3 MSPB和MSPA片段的扩增 |
| 1.2.1.4 MSPB和MSPA蛋白原核表达质粒的构建 |
| 1.2.1.5 rMSPB和rMSPA蛋白的诱导表达 |
| 1.2.1.6 rMSPB和rMSPA蛋白的纯化、鉴定以及复性 |
| 1.2.1.7 rMSPB和rMSPA蛋白的Western-Blot鉴定 |
| 1.2.2 检测MS抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 1.2.2.1 包被抗原的选择 |
| 1.2.2.2 抗原包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 1.2.2.3 封闭液和封闭条件的确定 |
| 1.2.2.4 抗体稀释液的确定 |
| 1.2.2.5 一抗孵育时间的确定 |
| 1.2.2.6 酶标二抗工作浓度和孵育时间的确定 |
| 1.2.2.7 显色时间的确定 |
| 1.2.2.8 阴阳性临界值的初步确定 |
| 1.2.3 酶标板的储存条件优化 |
| 1.2.3.1 干燥方式优化 |
| 1.2.3.2 储存条件优化 |
| 1.2.4 MS多抗血清和阴性血清的制备 |
| 1.2.5 MS标准血清的标定和阴性血清的检验 |
| 1.2.5.1 ELISA效价测定 |
| 1.2.5.2 交叉反应性测定 |
| 1.2.5.3 Western-Blot分析 |
| 1.2.6 ELISA试验阴阳性对照样品的制备 |
| 1.2.6.1 防腐剂的筛选 |
| 1.2.6.2 阴阳性对照样品的制备 |
| 1.2.6.3 对照样品重复性检验 |
| 1.2.7 阴阳性临界值的确定 |
| 1.2.8 终点滴度的测定 |
| 1.2.9 特异性试验 |
| 1.2.10 重复性试验 |
| 1.2.11 间接ELISA方法在临床样品检测中的应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSPB和MSPA基因片段的原核表达 |
| 2.1.1 MSPB和MSPA基因片段的扩增 |
| 2.1.2 原核表达质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.3 诱导表达的SDS-PAGE鉴定 |
| 2.1.4 rMSPB和rMSPA蛋白的纯化鉴定 |
| 2.1.5 rMSPB和rMSPA蛋白的Western-Blot鉴定 |
| 2.2 检测MS抗体的间接ELISA方法的建立 |
| 2.2.1 包被抗原的确定 |
| 2.2.2 抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定 |
| 2.2.3 封闭液和封闭条件的确定 |
| 2.2.4 抗体稀释液的确定 |
| 2.2.5 一抗孵育时间的确定 |
| 2.2.6 酶标二抗工作浓度和孵育时间的确定 |
| 2.2.7 显色时间的确定 |
| 2.2.8 阴阳性临界值的初步确定 |
| 2.3 酶标板的储存条件优化 |
| 2.3.1 干燥方式优化 |
| 2.3.2 储存条件优化 |
| 2.4 MS标准血清的标定及阴性血清的检验 |
| 2.4.1 ELISA效价测定 |
| 2.4.2 交叉反应性测定 |
| 2.4.3 Western-Blot分析 |
| 2.5 ELISA试验阴阳性对照样品的制备 |
| 2.5.1 ELISA对照样品防腐剂的筛选 |
| 2.5.2 对照样品重复性检验 |
| 2.6 临界值的确定 |
| 2.7 终点滴度测定方法的建立 |
| 2.8 特异性试验 |
| 2.9 重复性试验 |
| 2.10 间接ELISA方法在临床样品检测中的应用 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（10）以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 关键词及缩写 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 阿尔茨海默病 |
| 1.1.1 阿尔茨海默病研究发展进程 |
| 1.1.2 阿尔茨海默病的流行病学 |
| 1.1.3 阿尔茨海默病发病机制研究 |
| 1.1.3.1 Aβ 蛋白级联假说 |
| 1.1.3.2 Tau蛋白致病假说 |
| 1.2 阿尔茨海默病动物模型研究 |
| 1.2.1 转基因啮齿类动物模型 |
| 1.2.1.1 Aβ 病理转基因鼠 |
| 1.2.1.2 Tau病理转基因鼠 |
| 1.2.2 非人灵长类动物模型 |
| 1.3 阿尔茨海默病治疗现状 |
| 1.3.1 阿尔茨海默病治疗策略及分类 |
| 1.3.2 以tau为靶点的阿尔茨海默病疗法 |
| 1.3.2.1 主动免疫疗法 |
| 1.3.2.2 被动免疫疗法 |
| 1.3.2.3 微管稳定剂类 |
| 1.3.2.4 Tau聚集抑制剂类 |
| 1.3.2.5 调节tau磷酸化水平 |
| 1.4 靶向tau的免疫治疗方法的机制 |
| 1.5 诺如病毒P颗粒疫苗载体系统 |
| 1.5.1 诺如病毒 |
| 1.5.2 诺如病毒P颗粒 |
| 1.5.3 基于诺如病毒P颗粒蛋白载体的疫苗研究现状 |
| 1.6 研究意义与实验设计 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 实验思路与设计 |
| 1.6.2.1 P301S模型小鼠跟踪部分 |
| 1.6.2.2 AD疫苗部分 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌种、质粒载体与细胞 |
| 2.1.3 多肽合成 |
| 2.1.4 实验设备 |
| 2.1.5 实验试剂与耗材 |
| 2.1.6 溶液配制 |
| 2.1.6.1 鼠尾消化液 |
| 2.1.6.2 TAE缓冲液 |
| 2.1.6.3 PBS |
| 2.1.6.4 变性电泳缓冲液(SDS-running buffer) |
| 2.1.6.5 非变性电泳缓冲液(native running buffer) |
| 2.1.6.6 电转缓冲液 |
| 2.1.6.7 考马斯亮蓝染色液 |
| 2.1.6.8 脱色液 |
| 2.1.6.9 Basal buffer |
| 2.1.6.10 10×DNA loading buffer |
| 2.1.6.11 5×蛋白loading buffer |
| 2.1.6.12 5×蛋白native loading buffer |
| 2.1.6.13 戊巴比妥钠溶液 |
| 2.1.6.14 4%多聚甲醛溶液 |
| 2.1.6.15 分化液 |
| 2.1.6.16 返蓝液 |
| 2.1.6.17 柠檬酸抗原修复液 |
| 2.1.6.18 TBS与TBST |
| 2.1.6.19 PMSF母液 |
| 2.1.6.20 Na F母液 |
| 2.1.6.21 钒酸钠母液 |
| 2.1.6.22 焦磷酸钠(Na2P2O4)母液 |
| 2.1.6.23 RAB buffer |
| 2.1.6.24 RIPA buffer |
| 2.1.6.25 Urea buffer(脑匀浆用) |
| 2.1.6.26 30%丙烯酰胺溶液 |
| 2.1.6.27 氨苄青霉素溶液 |
| 2.1.6.28 卡那霉素溶液 |
| 2.1.6.29 氯霉素溶液 |
| 2.1.6.30 L-阿拉伯糖溶液 |
| 2.1.6.31 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) |
| 2.1.6.32 (亲和层析)平衡液 |
| 2.1.6.33 (亲和层析)咪唑洗脱液 |
| 2.1.6.34 抗原包被液 |
| 2.1.6.35 连接反应用碳酸氢铵溶液 |
| 2.1.6.36 R10培养基 |
| 2.1.6.37 ACK(红细胞裂解液) |
| 2.1.6.38 (293T)细胞复苏液 |
| 2.1.6.39 (293T)细胞培养基 |
| 2.1.6.40 胰酶 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 动物饲养及动物伦理 |
| 2.2.2 P301S转基因小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.4 小鼠行为学实验 |
| 2.2.4.1 握力实验 |
| 2.2.4.2 加速转棒实验 |
| 2.2.4.3 步幅长度 |
| 2.2.4.4 复合表型评分系统(肢体协调综合评分) |
| 2.2.4.5 筑巢实验 |
| 2.2.4.6 旷场实验 |
| 2.2.4.7 水迷宫实验 |
| 2.2.5 动物血浆及组织样本取材与保存 |
| 2.2.5.1 血浆样本取材与保存 |
| 2.2.5.2 血清样本取材与保存 |
| 2.2.5.3 组织样本取材与保存 |
| 2.2.6 组织切片与染色 |
| 2.2.6.1 石蜡切片的制备 |
| 2.2.6.2 HE染色 |
| 2.2.6.3 甲苯胺蓝染色 |
| 2.2.6.4 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.2.7 脑匀浆制备 |
| 2.2.8 蛋白电泳 |
| 2.2.8.1 SDS-PAGE(变性)电泳 |
| 2.2.8.2 Native PAGE(非变性)电泳 |
| 2.2.9 考马斯亮蓝染色 |
| 2.2.10 免疫印迹实验 |
| 2.2.10.1 Western blot |
| 2.2.10.2 Dot blot |
| 2.2.11 质粒构建 |
| 2.2.11.1 pCold Ⅳ-PP-3C质粒构建 |
| 2.2.11.2 pET20b-Tau质粒构建 |
| 2.2.11.3 pCDNA3.1-YFP /pCDNA3.1-CFP质粒构建 |
| 2.2.11.4 pCDNA3.1-RD(WT)-(HA)质粒构建 |
| 2.2.11.5 pCDNA3.1-LM-(HA)/pCDNA3.1-△K-(HA)质粒构建 |
| 2.2.11.6 pCDNA3.1-△K-YFP /pCDNA3.1-△K-CFP质粒构建 |
| 2.2.12 蛋白原核表达与纯化 |
| 2.2.12.1 PP-3C蛋白纯化 |
| 2.2.12.2 Tau蛋白的纯化 |
| 2.2.13 疫苗制备 |
| 2.2.13.1 多肽疫苗的制备 |
| 2.2.13.2 PP-pTau31疫苗的制备 |
| 2.2.13.3 佐剂使用 |
| 2.2.14 ELISA |
| 2.2.14.1 血浆/脑匀浆tau含量测定 |
| 2.2.14.2 血清抗体含量测定 |
| 2.2.14.3 血清抗体分型实验 |
| 2.2.15 硫酸铵沉淀法纯化血清蛋白 |
| 2.2.16 ELISPOT |
| 2.2.17 细胞培养 |
| 2.2.18 质粒转染 |
| 2.2.19 FRET实验 |
| 2.2.20 统计学方法 |
| 第三章 实验结果与讨论:P301S转基因小鼠行为学、病理学及血清学跟踪研究 |
| 3.1 行为学研究 |
| 3.1.1 体重 |
| 3.1.2 生存期 |
| 3.1.3 握力实验 |
| 3.1.4 加速转棒实验 |
| 3.1.5 步幅长度 |
| 3.1.6 复合表型评分系统(肢体协调综合评分) |
| 3.1.7 水迷宫实验 |
| 3.1.8 旷场实验 |
| 3.1.9 筑巢实验 |
| 3.1.10 小结 |
| 3.2 病理学研究 |
| 3.2.1 免疫印迹实验(western blot) |
| 3.2.2 免疫组织化学染色(IHC) |
| 3.2.3 脏器变化 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 血清学研究 |
| 3.3.1 血浆中人源tau蛋白变化 |
| 3.3.2 血浆炎症因子和趋化因子变化 |
| 3.3.3 脑匀浆炎症因子和趋化因子变化 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 检测因子相关性分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 实验结果与讨论:以诺如病毒P颗粒为载体的磷酸化tau表位疫苗对AD治疗效果和作用机制研究 |
| 4.1 磷酸化tau表位疫苗磷酸化表位筛选 |
| 4.1.1 候选重组磷酸化tau多肽的设计 |
| 4.1.2 候选重组磷酸化tau多肽的免疫原性分析 |
| 4.1.3 优选重组磷酸化tau多肽表位pTau31的安全性分析 |
| 4.1.4 小结 |
| 4.2 以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗的制备与表征 |
| 4.2.1 PP-pTau31表位疫苗的设计 |
| 4.2.2 诺如病毒P颗粒蛋白基因突变与构建 |
| 4.2.3 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C的表达与纯化 |
| 4.2.4 重组诺如病毒P颗粒蛋白PP-3C理化性质分析 |
| 4.2.4.1 PP-3C蛋白分子量及聚体形式分析 |
| 4.2.4.2 透射电镜(TEM)对重组诺如病毒P蛋白形态分析 |
| 4.2.5 重组诺如病毒P颗粒蛋白与pTau31多肽连接工艺与连接效率研究 |
| 4.2.6 小结 |
| 4.3 磷酸化tau表位疫苗PP-pTau31的免疫原性与优选佐剂研究 |
| 4.3.1 PP-pTau31的免疫原性评价 |
| 4.3.1.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计 |
| 4.3.1.2 PP-pTau31免疫原性评价 |
| 4.3.2 优选疫苗佐剂筛选 |
| 4.3.2.1 在C57BL/6 小鼠中的免疫设计 |
| 4.3.2.2 免疫原性评价 |
| 4.3.3 PP-pTau31疫苗诱导的T细胞免疫反应分析 |
| 4.3.4 小结 |
| 4.4 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫效果研究 |
| 4.4.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫方案设计 |
| 4.4.2 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中的免疫原性分析 |
| 4.4.3 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后的行为学变化研究 |
| 4.4.3.1 P301S转基因鼠体重变化 |
| 4.4.3.2 P301S转基因鼠生存期变化 |
| 4.4.3.3 P301S转基因鼠运动相关行为学变化 |
| 4.4.3.4 P301S转基因鼠认知行为学变化 |
| 4.4.4 P301S转基因鼠在PP-pTau31疫苗免疫后脑中蛋白水平变化研究 |
| 4.4.4.1 P301S转基因鼠脑匀浆中tau蛋白水平变化 |
| 4.4.4.2 P301S转基因鼠脑海马区tau蛋白水平变化 |
| 4.4.4.3 P301S转基因鼠脑海马区胶质细胞水平变化 |
| 4.4.5 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中治疗的安全性分析 |
| 4.4.5.1 PP-pTau31疫苗在P301S转基因鼠中诱导的T细胞免疫反应分析 |
| 4.4.5.2 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠血清中细胞因子的变化 |
| 4.4.5.3 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的脑匀浆细胞因子变化 |
| 4.4.5.4 PP-pTau31疫苗免疫后P301S转基因鼠的组织病理变化 |
| 4.4.6 小结 |
| 4.5 PP-pTau31疫苗的免疫作用机制研究 |
| 4.5.1 免疫治疗后P301S转基因鼠血浆tau蛋白水平变化 |
| 4.5.2 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性分析 |
| 4.5.2.1 FRET检测游离tau蛋白活性方法建立 |
| 4.5.2.1.1 质粒构建 |
| 4.5.2.1.2 质粒表达验证 |
| 4.5.2.1.3 FRET检测方法适用性评估 |
| 4.5.2.3 免疫治疗后P301S转基因鼠脑匀浆tau蛋白传播活性检测 |
| 4.5.3 PP-pTau31疫苗诱导的抗体性质分析 |
| 4.5.3.1 血清抗体结合NFT效果研究 |
| 4.5.3.2 血清抗体对脑匀浆中tau蛋白传播活性的抑制效果研究 |
| 4.5.4 小结 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及攻读博士学位期间科研成果 |
| 致谢 |
四、ELISA方法和血清学方法筛选群体反应性抗体的比较（论文参考文献）
- [1]口蹄疫病毒A型牛源单个B细胞中和抗体的筛选及竞争ELISA方法的建立[D]. 朱国强. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]基于非洲猪瘟病毒p35蛋白间接ELISA方法的建立及单克隆抗体制备[D]. 施磊. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]基于不同微球标记非洲猪瘟病毒和口蹄疫A型病毒免疫层析检测方法的建立[D]. 孙燕燕. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [4]牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白的表达及诊断方法的初步建立[D]. 杨木娇. 中国农业科学院, 2021(09)
- [5]A型塞内卡病毒结构蛋白B细胞抗原表位的鉴定[D]. 伍春平. 中国农业科学院, 2021(09)
- [6]犬瘟热病毒H蛋白和犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的筛选[D]. 施鹏飞. 中国农业科学院, 2021(09)
- [7]戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用[D]. 罗煜杭. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [8]牛传染性胸膜肺炎抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用[D]. 郝文君. 中国农业科学院, 2020(01)
- [9]检测滑液囊支原体抗体的冻干血凝抑制试验抗原的研制和间接ELISA方法的建立[D]. 何吉鑫. 扬州大学, 2020
- [10]以诺如病毒P颗粒为载体的pTau31表位疫苗对阿尔茨海默症的治疗研究[D]. 孙瑶. 吉林大学, 2020(08)