一、单独及联合转染survivin和bcl-2反义寡核苷酸诱导胆囊癌细胞凋亡的研究（论文文献综述）
李永红[1]（2020）在《空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中认为研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸（SBOs）调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系（MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化））;RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显着升高（p<0.05）,与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显着降低（p<0.01）,Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低（p<0.001）;与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显着降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显着降低,但胃癌细胞株组间无显着差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）表达显着升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显着下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。
郭园园[2]（2020）在《功能小分子-硫代核酸偶联物的合成及其抗肿瘤应用》文中提出化学偶联策略是构建新型药物制剂的重要手段,例如小分子药物与载体或靶向分子偶联以及基因药物化学修饰等。小分子药物通常与聚合物、单克隆抗体、多肽、脂质分子等偶联以改善其药动学性质、提高稳定性、实现肿瘤组织穿透和靶向作用。然而,传统药物偶联物载体仍存在很多挑战:如分子量不可控、载体潜在毒性、免疫原性、制备工艺复杂、接枝位点和数量不确定、载药量低等问题。除了作为基因药物治疗疾病外,核酸作为天然存在的生物大分子还是理想的药物载体,具有分子结构和序列精准可控、完全生物相容和可降解等优势。因此,研究核酸的化学修饰和分子偶联具有重要意义。目前用于核酸化学修饰和分子偶联的方式通常依赖于固相合成,需要特殊修饰而存在合成复杂、载药量低、影响功能、安全性差等问题。为此,本文基于成熟的硫代核酸修饰技术,利用硫代磷酸酯基团高效接枝不同功能小分子,从而构建了功能小分子-硫代核酸偶联物的通用合成方法。此接枝方法简单高效、不影响核酸碱基互补配对和分子识别特性,且修饰位点和数量精确可控。基于此本研究实现了一系列功能小分子在核酸上的精确接枝偶联,并将其应用于基因调控、药物输送、肿瘤治疗等领域。具体研究内容如下:1.马来酰亚胺-硫代核酸偶联物促进反义寡核苷酸入胞研究反义寡核苷酸药物（antisense oligonucleotides,ASO）由于其合成简单、药效优良而得到广泛应用。但其肿瘤靶向和细胞穿透性差强人意,制约了ASO的成药性和临床应用。通过在ASO末端偶联靶向分子、细胞穿透肽、脂质分子等可以提高入胞效率,但存在合成复杂、偶联产物具有安全性问题等。为此,本课题利用硫代ASO（PS-ASO）的硫代磷酸酯基团与苄溴修饰的马来酰亚胺分子（Mal-Bz-Br）偶联,制备了多个马来酰亚胺分子（Maleimide,Mal）接枝的硫代反义寡核苷酸（nMal-g-ASO）,以促进ASO的肿瘤细胞穿透能力和基因沉默效率。其中,马来酰亚胺的接枝不影响ASO的分子识别性质和生物学功能。所制备的nMal-g-ASO具有较好的生物安全性,并可通过与细胞膜表面巯基发生点击化学反应而促进ASO的非内吞途径依赖的细胞摄取,从而增强ASO的基因沉默效率。2.光敏剂-硫代核酸偶联物自组装纳米水凝胶的构建及其光动力-免疫联合治疗研究核酸除作为基因药物实现疾病治疗外,还可作为载体材料进行药物递送。为此,我们利用核酸作为载体,进一步在硫代核酸骨架上接枝光敏剂分子进行光动力-免疫联合抗肿瘤研究。光动力-免疫检查点抑制剂联合应用在癌症治疗中发挥重要作用。然而,两者的理化性质和作用位点差别较大,其合理共递送成为一个挑战。研究如何通过纳米药物手段,选择一个安全、生物相容性的载体材料以更好更合理地实现两者的共同递送意义重大。为此,本课题选择DNA作为载体,利用硫代核酸修饰和DNA纳米组装技术共同负载光敏剂（焦脱镁叶绿酸a,PPA）及靶向于程序性死亡蛋白配体-1（PD-L1）的小干扰RNA（anti-PD-L1 si RNA）,制备了光动力-免疫检查点抑制剂共递送纳米凝胶体系。首先通过在四条DNA链上分别进行硫代修饰后偶联PPA以得到亲水性光敏剂-硫代核酸偶联物（PPA-DNA）。亲水性PPA-DNA保持DNA的分子识别功能,可在1×TAE/Mg2+中通过一步退火制备含有粘性末端的载药DNA四面体（tailed-PPA-TET）。进而利用含互补粘性末端的anti-PD-L1 si RNA作为交联剂制备联合递送纳米凝胶（PD-L1/PPA-NG）。光敏剂PPA在光照条件下可引起肿瘤细胞免疫原性死亡（immungentic cell death,ICD）,促进抗原释放;交联剂anti-PD-L1 si RNA可实现肿瘤细胞内PD-L1基因下调从而降低肿瘤细胞表面PD-L1表达,促进细胞毒性T细胞的肿瘤杀伤效应。两者双管齐下,实现良好的免疫增强和肿瘤治疗,显着抑制初级瘤和远端转移瘤生长,为构建药物联合递送体系提供新的方法。3.紫杉醇-硫代核酸偶联物肿瘤靶向多功能球形核酸构建及性能研究上述研究表明,硫代核酸可以实现小分子药物在核酸骨架上偶联的目的。偶联策略在化疗药物递送体系研究中也具有重要意义,而目前核酸载体进行化疗药物递送存在稳定性差、载药量低等问题。此外,纳米药物在体内的被动靶向作用存在很多争议,因此亟需构建具有较高载药量和肿瘤靶向性的化疗药物递送体系。为了进一步体现硫代核酸作为药物载体的普遍性和重要性,以提高载药量和肿瘤靶向性为目的,我们在一条嵌段型DNA(PODNA-b-PSDNA)链一端连续、多个硫代修饰,在硫代修饰位点特异性接枝疏水性化疗药物紫杉醇（paclitaxol,PTX）制备了嵌段型、两亲性紫杉醇-核酸偶联物(PODNA-b-(PSDNA-g-PTX))。将PODNA-b-(PSDNA-g-PTX)在水溶液中透析制备了球形核酸（spherical nucleic acid,SNA）样的载药胶束结构（PTX-SNA）,其中磷酸二酯键核酸部分为胶束外壳,偶联疏水PTX的硫代核酸部分为胶束内核。同时,通过与磷酸二酯核酸部分碱基互补配对或将此部分更换为功能性核酸序列,即可同时赋予PTX-SNA靶向性、肿瘤成像和基因-化疗联合功能,以得到多功能球形核酸结构,从而实现肿瘤靶向、成像以及抗肿瘤耐药的目的。实验结果表明,核酸中硫代磷酸酯基团（PS）可以全部进行药物接枝,提高载药量的同时实现了药物接枝数量的精确可控。通过简单操作即可制备具有靶向作用的多功能载药体系,体系成分简单、安全性高。所制备的多功能球形核酸具有较好的肿瘤靶向、肿瘤治疗和抗肿瘤耐药性质。
刘畅[3]（2020）在《基于纳米抗体靶向性泛素化降解技术的Survivin亚细胞功能探究》文中认为Survivin是凋亡抑制蛋白家族中最小的成员,降低细胞内源性Survivin的表达量可以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡,目前有不少抑制Survivin表达的策略,但是缺乏一种基于抗体蛋白靶向的在蛋白水平上降解Survivin的方法。Survivin普遍存在于癌细胞的细胞质（包括线粒体）和细胞核中,不同亚细胞中Survivin发挥的功能可能也有所不同。因此,本课题的目的是通过建立一种纳米抗体靶向细胞内源性Survivin泛素化降解的方法,来研究Survivin降解后对细胞凋亡和细胞生长方面的影响,进而探究Survivin在不同亚细胞定位中发挥的主要功能。基于上述目的,本研究获得了以下结果与结论:首先,建立了由泛素连接酶TRIM21介导细胞内源性Survivin降解的方法,利用Survivin的纳米抗体Nb4A对Survivin的靶向性,以及抗体Fc区与TRIM21羧基末端PRYSPRY结构域特异性结合的能力,构建了 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21系统。通过Western blot分析发现,Nb4A-Fc-T2A-TRIM21能大量降解细胞内源性Survivin蛋白,其降解Survivin的能力是Nb4A的3.72倍,TRIM21的2.84倍;并且利用蛋白酶体抑制剂MG132验证了该方法对Survivin的降解是由泛素-蛋白酶体途径介导的。其次,流式检测细胞凋亡结果显示,Nb4A-Fc-T2A-TIRM21对MCF-7细胞的凋亡率达到58.52%,然而对Survivin低表达的L-02细胞的凋亡率仅为14.56%,表明Nb4A-Fc-T2A-TIRM21可以通过降解癌细胞中的Survivin进而促进细胞凋亡。Western blot分析发现促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达量与Survivin的表达量均成反比,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达与Survivin的表达水平无显着相关性,可以初步证明Survivin是通过直接或间接地抑制Caspase途径来发挥抗凋亡功能的,是区别于Bcl-2抗凋亡蛋白家族的抗凋亡途径。最后,将Nb4A-Fc-T2A-TRIM21融合核定位信号NLS,以靶向降解细胞核Survivin。通过比较细胞凋亡率发现,Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对MCF-7细胞的促凋亡能力约是Nb4A-Fc-NLS-T2A-TRIM21-NLS 的 2.37 倍。MTT 实验发现Nb4A-Fc-NLS-T2A-TRIM21-NLS作用于MCF-7细胞48 h后,细胞存活率仅为49.44%,低于Nb4A-Fc-T2A-TRIM21组的细胞存活率（60.45%）,而其对L-02细胞的增殖活性无显着影响。通过对MCF-7细胞的细胞周期分布情况以及Cyclin D1表达水平的分析发现,靶向降解细胞核Survivin后,加速了 G1期向S期的转变,而且阻滞在S期和G2期,从而抑制了细胞分裂,并且细胞核Survivin的下调很大程度上会下调Cyclin D1的表达,但降解细胞质中的Survivin却没有明显影响细胞周期的进程。综上结果表明,Survivin的双重作用与其定位息息相关,细胞质Survivin主要发挥抗凋亡功能,而细胞核Survivin主要是促进细胞增殖并且参与细胞周期的调控。本研究为精准靶向Survivin的肿瘤治疗提供了新的策略与研究基础。
潘青山[4]（2020）在《基于介孔硅/MOF和DNA折纸的智能响应纳米平台用于癌症治疗的研究》文中认为随着纳米技术的蓬勃发展,癌症的诊断与治疗的技术也是日新月异,由于纳米材料具有一些特殊的性质,如:尺寸效应,界面效应,特别是对肿瘤组织的高穿透性和滞留效应,使得纳米材料在癌症的诊断与治疗领域的应用越来越广泛。由于癌症的复杂性,普通的癌症治疗方法靶向性差,容易引起对人体的副作用,而且容易出现肿瘤的转移与复发,普通纳米材料越来越难以满足对癌症的高效治疗。而肿瘤分子生物学的发展使得人们对于癌症的发生与发展机制有了更深入的研究与理解,医学近期发展到可以在分子水平上高精度进行诊断和治疗的地步,出现了“精密医学”的新领域,具有特定的临床意义和挑战,需要开发一些新颖的纳米材料来解决这些挑战,基于此,构建合适的纳米材料发展具有癌细胞靶向性、癌症标志物响应或肿瘤微环境响应的精准医疗是未来肿瘤治疗的主要发展方向之一。介孔硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticle,MSN）具有一些优良的特点,例如高比表面积,可调孔径,易于表面功能化以及出色的生物相容性,使其成为刺激性药物输送载体开发的理想材料。在第2章中,我们利用ZIF-8纳米材料在中性环境下（p H=7.4）稳定,而在偏酸性环境（p H<6.0）下易降解的性质,开发了一种ZIF-8包裹介孔硅的复合纳米颗粒用于构建p H响应型药物输送载体,我们首先合成了直径～80 nm的介孔硅纳米颗粒,然后通过优化介孔硅表面的官能团及反应温度与时间,成功的在介孔硅表面原位合成了一层超薄的ZIF-8壳,从而制备得到了具有超薄ZIF-8包裹介孔硅的核壳复合纳米颗粒MSN@ZIF-8。该复合纳米材料可用于装载化疗药物Dox并具有p H响应释放药物的性能,可用于构建肿瘤微环境响应的药物输送载体（drug delivery system,DDS）用于可控的药物释放。肿瘤多药耐药性（multidrugresistance,MDR）是导致化疗失败的主要原因,在第3章中我们设计了p H响应的MSN-COOH@ZIF-8纳米颗粒用于共输送化疗药物Dox和小分子干扰RNA（siRNA）用于耐药癌细胞的增强治疗,由于介孔硅具有优良的生物相容性和药物存储性能,而ZIF-8具有强的正电荷,一方面可以有效吸附负电荷的siRNA,另一方面可以通过空间位阻效应防止siRNA被核酸酶降解,特别是利用ZIF-8酸降解的性能可以使得该纳米颗粒具有p H响应释放药物的性能,因此,结合这两种纳米材料的优良性能,构建一种MSN-COOH@ZIF-8复合纳米颗粒,用介孔硅纳米颗粒装载化疗药物阿霉素（Dox）,然后采用ZIF-8封装介孔硅的表面孔道,并利用ZIF-8层吸附Bcl-2 siRNA,用于共输送化疗药物分子Dox和Bcl-2 siRNA来克服多药耐药肿瘤细胞的耐药性,对耐药癌细胞的化疗具有明显增强的效果。DNA origami是一种非常优异的用于构建多功能化纳米装置的平台,在第4章中我们设计了一种基于DNA折纸的纳米机器人用于信号放大检测miR-21并释放反义DNA货物,该DNA折纸机器人由DNA矩形折纸和基于DNA zyme底物切割自驱动的DNA walker组成,在miR-21的触发下,DNA折纸上起始点的的Mg Z robot被激活,并开始不断循环切割底物链产生绿色荧光信号（FAM）,切割过程Mg Z robot实现了沿着路径行走并到达目的地点释放Bcl2反义DNA,产生红色荧光信号（Cy5）,因此,在miR-21的触发下,该DNA折纸机器人（DNA origami nanorobot,DONR）可以被激活,实现信号放大检测miR-21并同时释放反义核酸货物（Bcl2antisense）的双重功能。在第5章,我们将上一章中设计的纳米机器人DONR（DNA origami nanorobot）应用于癌细胞的精准诊断与治疗。在实验中,我们将DONR用于癌细胞（MCF-7,Hela）与正常细胞L02的智能诊断与治疗,由于癌细胞MCF-7和Hela中miR-21表达较高,而正常细胞L02为miR-21阴性表达细胞,在肿瘤标志物miR-21的触发下,该纳米机器人可以运行产生荧光信号实现对癌细胞和正常细胞的分辨,而且还可以释放Bcl2反义DNA链用于癌细胞的治疗,从而实现了智能纳米机器人对癌细胞智能的辨别与精准的治疗。该纳米机器人为发展基于DNA纳米机器的智能诊疗平台提供了一定的研究基础。反义寡核苷酸（ASOs）是用于耐药癌细胞协同治疗非常有效的一种技术,在第6章中,我们设计了一种基于DNA origami的纳米载药平台共输送化疗药物Dox和基因药物ASOs用于对耐癌细胞的增强治疗。通过在DNA origami两侧边缘的staple链上伸出MUC1 aptamer,可以赋予该纳米平台对癌细胞的靶向性,为了沉默耐药基因Bcl2和P-gp ASOs,我们在DNA origami上设计了两种用于分别负载Bcl2和P-gp ASOs的锚定链,通过DNA链杂交反应可以非常容易的将大量的Bcl2和P-gp ASOs负载在DNA origami上,另外,通过在Bcl2和P-gp ASO上修饰二硫键,可以在谷胱甘肽（GSH）存在的条件下,将反义寡核苷酸从origami上快速释放,由于癌细胞内的GSH的浓度比正常细胞高很多,因此可以通过GSH刺激-响应释放ASOs。此外,origami通过静电吸附可以负载化疗药物Dox,从而可以将Dox与ASOs共同输送到癌细胞内部,通过协同作用可以对耐药癌细胞达到增强治疗的效果。
王莹[5]（2017）在《SM-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞的抑制作用及机制研究》文中认为恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命健康的疾病。在各种疾病中,恶性肿瘤的死亡率高居第二位,仅次于心脑血管病。其中肝癌和结直肠癌分别位列恶性肿瘤发病率的第三、第四位。临床上针对此类实体瘤主要以手术、介入治疗及大剂量化疗为主,但传统化疗药物的长期应用使肿瘤细胞耐药现象越来越普遍,这大大影响了化疗药物的临床应用。因此,解决化疗中的耐药问题和优化化疗方案显得尤为必要。同时肿瘤的发生、发展是一个多基因、多因素和多阶段参与的复杂病理过程,单一疗法通常不能取得满意效果,综合治疗是目前肿瘤治疗的主要研究方向。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）是嘧啶类抗代谢药,在体内转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸（Fd UMP）,抑制胸苷酸合成酶（TS）的活性,进而阻断脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP）转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）,干扰DNA合成。5-FU对消化道肿瘤及其他实体瘤有良好疗效。其缺点是缺乏对肿瘤细胞的选择性、毒性大、副作用多、久用易耐药等。Caspase家族属于半胱氨酸天冬氨酸-特异性蛋白酶,其家族成员在细胞凋亡过程中起重要作用。其中caspase-3做为细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,负责整个凋亡级联反应过程的最终实施。正常情况下,胞质内caspase-3以无活性的酶原形式存在（procaspase-3）,只有当细胞发生凋亡时才被激活为有活性的caspase-3。肿瘤细胞的抗凋亡特性,导致细胞内procaspase-3含量显着高于正常细胞,因此,靶向于procaspase-3药物对肿瘤细胞具有理想的选择性。半胱氨酸蛋白酶原活化物-1（简称PAC-1）,在体外能够迅速活化procaspase-3为caspase-3并引起肿瘤细胞凋亡,并且对多种体内皮下移植瘤具有较好的抑制作用。SM-1为PAC-1的结构类似物,具有较好的抗肿瘤活性,有望成为新的靶向procaspase-3的抗肿瘤药物。本课题旨在研究靶向药物SM-1与化疗药物5-FU联合应用对人肝癌细胞及结肠癌细胞在体内外的协同抑制作用,并探讨其可能的作用机制。从而为两药联合应用提供依据。具体研究内容如下:第一部分sm-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞的体外增殖抑制作用目的:考察5-fu联合sm-1对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞株hct116、lovo的体外增殖抑制作用。方法:1采用mtt法测定5-fu、sm-1单独应用及二者联合应用时对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞株hct116、lovo的抑制率。2依据chou-talalay中效原理,以联合给药分析软件calcusyn2.1计算协同作用指数（ci）值,评价联合作用效果。结果:1mtt结果显示5-fu、sm-1单药对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3的抑制作用具有浓度依赖性。二者联合作用72h后,细胞抑制率明显升高,抑制作用增强。应用calcusyn2.1软件分析协同效果,二者在很大范围内具有协同作用。2mtt结果显示5-fu、sm-1单药对人结肠癌细胞株hct116、lovo的抑制作用具有浓度依赖性。二者联合作用72h后,细胞抑制率明显升高,抑制作用增强。应用calcusyn2.1软件分析协同效果,二者在很大范围内具有协同作用。结论:5-fu和sm-1联合给药对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞hct116、lovo的增殖表现出协同抑制作用。第二部分sm-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞抑制作用的机制研究目的:考察5-fu联合sm-1对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞株hct116、lovo协同抑制的作用机制。方法:1hochest33342染色观察联合用药对细胞形态的影响。2annexinv/pi考察联合用药对细胞凋亡的影响。3jc-1检测联合用药对线粒体膜电位的影响。4荧光定量pcr检测凋亡相关rna:bax、bcl-2、survivin、xiap以及parp。5westernblot检测凋亡相关蛋白:caspase-3、bcl-2、bax、survivin及parp。6transwell及划痕实验检测联合用药对细胞侵袭、迁移能力的影响。结果:1hochest33342染色结果显示,5-fu联合sm-1组细胞出现明显的凋亡特征,较单药处理组及对照组相比,有更多的典型凋亡细胞出现。2annexinv/pi双染结果显示,联合处理组细胞凋亡率较单独给药组明显增加。3jc-1检测结果显示,联合给药组细胞表现出绿色荧光增强,红色荧光减弱,线粒体膜电位较单独给药组显着降低。4荧光定量pcr结果显示:与对照组相比,各处理组中bax和parp基因表达显着升高,其中联合给药组升高最显着。bcl-2、survivin、xiap基因表达显着降低,联合给药组降低最明显。5westernblot结果显示:caspase-3蛋白在单药组及联合组的表达显着高于对照组,且联合给药组表达明显高于单药组。各处理组bcl-2及survivin蛋白表达较对照组低,且两药联合应用后蛋白表达较单药组明显降低。各处理组bax、parp蛋白表达较对照组增加,且联合给药组bax及parp蛋白表达也较单药组明显增加。6transwell及划痕实验显示联合用药显着降低肝癌细胞hepg2的侵袭和迁移能力。结论:5-fu和sm-1联合给药对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞株hct116、lovo的凋亡具有协同作用。协同诱导凋亡的机制可能是通过活化caspase-3,上调bax/bcl-2比例,下调survivin、xiap来实现的。第三部分sm-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞抑制作用的体内研究目的:建立人肝癌细胞裸鼠原位肿瘤模型和人结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型考察5-fu联合sm-1的体内抗肿瘤效果。方法:1建立人肝癌细胞hepg2、mhcc97h裸鼠肝原位模型,给药结束后颈部脱臼处死动物,解剖取出瘤块,称重。通过瘤重反应5-fu、sm-1及二者联合应用的体内抗肿瘤作用效果。通过观察裸鼠的行为、活动及体重的变化来评估用药的安全性。2活体生物发光成像。建立稳定表达pcdh-gfp-luc的lm3-gfp/luc细胞。建立lm3-gfp/luc细胞裸鼠肝原位模型,通过小动物活体成像系统采集肿瘤自发荧光信号变化趋势及瘤重来考察5-fu、sm-1及二者联合应用的体内抗肿瘤作用效果。通过观察裸鼠的行为、活动及体重的变化来评估用药的安全性。3建立人结肠癌细胞hct116、lovo裸鼠皮下移植瘤模型,分组给药,每三天称体重、测量肿瘤体积。实验结束后颈部脱臼处死动物,解剖取出瘤块称重。通过肿瘤体积的变化趋势及瘤重来比较5-fu、sm-1及二者联合应用的体内抗肿瘤作用效果。通过观察裸鼠的行为、活动及体重的变化来评估用药的安全性。4肿瘤组织经石蜡包埋、切片,通过he染色、观察病理变化。结果:15-fu、sm-1及二者联合用药均可对hepg2、mhcc97h裸鼠原位移植瘤生长起到抑制作用。其中,联合给药对瘤重的抑制率最高,分别达到70.07%和86.74%。与对照组相比,5-fu、sm-1单独给药及二者联合给药均未对荷瘤裸鼠的行为、活动及体重产生明显影响。25-fu、sm-1及二者联合用药均可对lm3-gfp/luc裸鼠原位移植瘤生长起到抑制作用,其中,5-fu联合sm-1给药对瘤重的抑制率最高,达到75.11%。小动物活体成像系统显示,联合给药组肿瘤的自发荧光强度显着低于对照组（p<0.05）。与对照组相比,5-fu、sm-1单独给药及二者联合给药均未对荷瘤裸鼠的行为、活动及体重产生明显影响。35-fu、sm-1及二者联合用药均可对hct116、lovo裸鼠移植瘤生长起到抑制作用,其中,5-fu联合sm-1给药对肿瘤体积及瘤重的抑制率最高,对于hct116模型,瘤体积抑制率达到70.42%,瘤重抑制率为69.14%。对于lovo模型,瘤体积抑制率达到78.07%,瘤重抑制率为73.09%。与对照组相比,5-fu、sm-1单独给药及二者联合给药均未对荷瘤裸鼠的行为、活动及体重产生明显影响。4 HE染色结果显示:对照组肿瘤细胞结构完整。5-FU组、SM-1组及联合给药组肿瘤细胞均呈现不同程度的皱缩变圆、核固缩,以联合给药组的肿瘤细胞破坏最严重,凋亡最明显。结论:5-Fu和SM-1联合给药对人肝癌细胞HepG2、MHCC97H、LM3-GFP/Luc裸鼠原位肿瘤模型及人结肠癌细胞HCT116、LoVo裸鼠皮下移植瘤模型的生长具有协同抑制作用。
流小舟[6]（2016）在《Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究》文中认为研究背景作为一种恶性的成骨性肿瘤,骨肉瘤的主要来源是骨组织,通常其多见于骨生长活跃的年轻人当中,由于其恶性程度高,侵犯范围较大,而且容易发生早期肺部的转移,因此往往治愈难度大,过去单一治疗效果不够理想,五年内存活率不足两成,尽管有关新辅助化疗以及保肢手术的探究日益深化,愈来愈多的骨肉瘤病患能够保留自身的肢体,延续自己的生命年限。但是在诊断方面,到目前仍然没有可识别性标志物,在骨肉瘤分化比较差的时候仅仅通过观察形态来作出诊断,因此病理判断的精确性不够。同时肿瘤的复发和转移等恶性生物学行为仍然是很大程度上影响着患者的预后、导致骨肉瘤患者生存率不理想,进而导致骨肉瘤患者治疗失败的主要因素。目前相关的基础研究对骨肉瘤病因及转移发展机制仍未有重要的突破,在临床上也没有新的药物和新的治疗模式产生,因此寻找新的研究突破点、探讨人骨肉瘤的侵袭和转移机制显得至关重要。既往针对肿瘤细胞的杀伤主要包括化疗和放疗介导的细胞凋亡,而这正是由肿瘤细胞可以抑制自身凋亡、促进自身存活力增强的共同特征所决定的。正常细胞的凋亡机制受到抑制导致肿瘤的发生,而肿瘤细胞的凋亡机制紊乱导致肿瘤的不断增殖是困扰和限制临床治疗及肿瘤基础学研究进一步发展的核心问题。究其根本,包括IAPs家族在内的多种凋亡抑制基因参与其中、相互协调作用是该问题的关键。IAPs家族负责编码一组结构相似、功能相关的蛋白,这一家族的大多数成员可以借助直观层面的联合与阻止特定的Caspase来抑制细胞凋亡,是调控启动Caspase和效应Caspase的唯一内源性蛋白。迄今为止,在人体新发现的IAPs家族有8个成员,即NAIP、XIAP（ILP-1/MIHA）、cIAP-1（HIAP-2/MIHB）、Survivin（TIAP）、Apollon（Bruce）、cIAP-2（HIAP-1/MI-HC）、ILP-2（Ts-IAP）与Livin（ML-IAP/KIAP）。其中Survivin是近几年发现的一个IAPs家族中的成员,因其在正常人体的组织内均无明显表达,而在恶性肿瘤组织中呈特异性高表达,因此将Survivin作为连接细胞凋亡和细胞周期的纽带,同时作为促进骨肉瘤细胞凋亡、治疗骨肉瘤组织生长的针对性靶点是我们未来研究骨肉瘤靶向疗法的潜在性突破口和该领域研究的热点。Survivin基因由Ambrosini等借助ECPR1内的cDNA自人类基因库内选取,该基因全长15kb,其位置在17q25染色体上,存在的外显子数量是4个,内含子的数量是3个,在进行一定的编码程序以后,就会产生内含142个氨基酸的Survivin蛋白,有别于IAP家族的其他成员,截止到目前,Survivin不仅是家族中最新发现,也是分子量最低的凋亡抑制蛋白。因此其在功能上也一定程度的有别于IAP家族的其他成员,即:干预细胞凋亡的同时也参与细胞有丝分裂及其他细胞阶段性的周期变化,还在肿瘤滋养血管出现和转移性生长进入其它器官的过程中发挥作用:（1）遏制细胞凋亡的功效:①Survivin借助BIR功能区的妨碍凋亡相关的氨基酸残基Trp67、Pro33和Cys84直接作用于Caspase-3、Caspase-7,在干扰他们活力的同时可以进一步起到干扰凋亡的作用。②Survivin借助和细胞附件控制因子CDK4产生Survivin-CDK4,这种混合产物可以使P21自CDK4内能够被释放出来,而P21可以和Caspase-3发生关联,进而能够对Caspase产生一定的约束性,防止细胞出现凋敝的情况。③近几年研究指出,Survivin是周期蛋白激酶p34cdc-cyclinBl在有丝分裂阶段中形成的底物,磷酸化Survivin Thr34之后可以再和Caspase-9发生关联,防止依赖于Caspase-9发挥作用的相关细胞凋亡因子的转导传输。（2）调节细胞周期的功效:Survivin与CDK4结合后,竞争性地抑制CDK4/p16（INK4a）复合物的形成,活化CDK2/cyclin E,磷酸化Rb,从而加快G1期向S期的转换。在G2/M期特异性表达,Survivin因其羧基末端无RING锌指结构,代之以一个长度为6.5nm、由40个氨基酸组成的α螺旋结构,在有丝分裂的初期,Survivin借助这一架构和有丝分裂纺锤体内存在的microtubule结构发生特定可饱和作用,加速有丝分裂、促进恶性肿瘤细胞繁殖的同时避免因先天遗传或后天突变引起的细胞自然或非自然死亡。（3）参与血管形成的功效:VEGF在肿瘤组织中可以导致肿瘤滋养血管的生成,而Survivin在该过程中具有保障血管内皮组织与新生血管出现的关键价值。0’ Connor等指出血管内皮细胞中的Survivin可以在VEGF与bFGF的介导下较呈现高表达状态。Tran等分析认为,在稳定细小血管网架构、保障血管内皮细胞性能、使肿瘤血管内皮细胞产生化疗药物耐药性等方面,Survivin均发挥了一定的作用。Coma等制备了针对Survivin的反义寡核苷酸,在沉默Survivin的表达后发现由TNF介导的VEGF的抗凋亡活性降低,而Survivin的表达与VEGF的表达又呈正相关,提示二者在骨肉瘤的血管生成过程中发挥协同作用。由此可见,肿瘤尤其是骨肉瘤的发生、发展及转移的确是一个十分复杂的过程,目前骨肉瘤发生及转移原因尚未得到阐明。细胞凋亡作为一种高度保守的细胞死亡机制,又被称为程序性细胞死亡,其具有组织、生化和形态学方面特性。由于肿瘤的生长和发展取决于肿瘤细胞的增殖率与凋亡率之间的平衡,这种平衡一旦打破,一方面,那些在生理状态下需要及依赖于凋亡程序发挥作用的组织内环境稳定性及胚胎细胞发育过程会发生紊乱。而另一方面,干扰细胞的凋亡又能够导致细胞存活时间很大程度延长,基因突变体的聚积从而诱发肿瘤的形成、促进肿瘤转移、增强肿瘤化疗耐药性。因此伴随着肿瘤分子遗传学、分子生物学,特别是靶向肿瘤分子学的进步,找到细胞凋亡机制中作用于骨肉瘤的发生、发展、侵袭、转移全过程的有效靶点是现今从事骨肉瘤研究的学者们迫切希望解决的重中之重。从当前的研究我们能够看出,骨肉瘤组织里的Survivin基因的异常表达有可能促使肿瘤细胞脱离生长监控的范围,克制肿瘤细胞的凋亡。有学者提出,Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。还有的研究利用Cox多变量回归模型展开剖析,对骨肉瘤病患的Survivin表达程度配合化疗前化疗敏感性的预期展开预估,最终得出Survivin蛋白表达的上调同骨肉瘤组织发生发展密切相关,且Survivin可以作为骨肉瘤诊断和判断预后的一个标志物。Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。因为凋亡遏制蛋白Survivin于肿瘤组织中选择性的高表达,我们可以这样进行假设:抑制Survivin有可能导致骨肉瘤细胞的自发性凋亡,我们在既往的实验中证实了在骨肉瘤细胞系U20S、SAOS及MG63中,Survivin的表达明显增加,这在我们后续对比骨肉瘤组织和正常组织中Survivin表达的实验中也得到证实。我们还发现采用Survivin反义寡核苷酸技术可以降低Survivin在骨肉瘤细胞中的表达,显着抑制骨肉瘤细胞增殖并呈现出浓度依赖性,从而诱导骨肉瘤中的细胞凋亡。根据以往研究结果,我们进一步提出假设:是否存在着一种下游信号传导通路元件,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用;而在体内环境中,抑制Survivin又能否影响骨肉瘤瘤体的生长。肿瘤的转移囊括了肿瘤细胞于间质里移动并且接触脉管、肿瘤细胞突破血管内皮还有内皮下的基底膜展开血流,而且在血液里存活、肿瘤细胞穿出血管,于组织里生长、增殖,产生转移灶。因此我们能够看到,肿瘤的转移和细胞之间、细胞同细胞之外基质二者之间的的粘附作用存在一定关系。但是此类相互辨别以及作用是需要CAMs在其中发挥其介导作用的。整个CAMs家族里的一个关键元素即整合素,它是利用非共价键将α以及β两种亚单位链接所组成的的异二聚体分子。根据该家族中当前所发现的二十五个α亚单位以及十一个β亚单位,可以一起构成不下数十种不一样的整合素。这两种亚基构造有相似之处,都是通过较长的胞外段（氨基端）、跨膜段、较短的胞内段（羧基端）三部分一起组成的。α亚基凭借其胞外段能够对于ECM的RGD序列加以辨别,介导细胞与ECM二者的粘附,而β亚基的胞内段同细胞骨架构连接在一起。整合素与配体结合发挥其功能,故整合素按识别配体的不同又可分为三大类,本文所讨论的整合素α 5属于其中识别非RGD序列的整合素,其配体为基底膜蛋白,例如层黏连蛋白（LN）以及纤维连接蛋白（FN）等,而胶原蛋白正是骨组织的主要细胞外基质成分,近来人们发现骨组织中整合素的表达水平对成骨和吸收具有调控作用,提示整合素与很多骨代谢疾病甚至成骨、溶骨病变的病理机制有关。除了介导细胞与基底膜、细胞与细胞的粘附,整合素同时具有通过与其配体结合后向细胞内传递信号,进而影响基因的表达,最后影响细胞的增殖代谢、基因转导、凋亡等生物学行为的功能。有文献报道,在整合素α 5和Survivin促进骨肉瘤细胞的增殖作用过程中,Caspase-3均起到介导作用;整合素α5和Survivin有可能直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程。三者可能共同参与骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。可见,整合素很有可能对骨肉瘤的生长、发展、侵袭、转移过程产生非常重要的影响,而这种影响是在与Survivin相互协调、相互作用中完成的。当前针对Survivin的敲低或敲除实验为骨肉瘤靶向基因治疗提供了理论依据和方向。而相对于反义寡核苷酸技术来说,RNA干扰技术（RNAi）具有转染效率高、转染效果稳定、特异性强、浓度依赖性好、潜在毒性弱、作用时间充分、维持时间较长、实验准备及操作简便的优点。该项技术是由Fire于1998年首先在研究秀丽新小杆线虫（C.elegans）反义RNA的过程中发现并证实是一种由dsRNA介导的同源RNA降解过程,已逐渐成为公认的实验技术和治疗手段。其原理是在生物体细胞内,利用具备同源性的dsRNA诱使序列特异的特定基因的沉默,快速的防止目标基因活性。siRNA就是RNAi途径中间的产物,或者说也是RNAi发挥作用的必不可少的因素,现如今应用在现实治疗过程中的siRNA类型基本上有两种:体外形成的RNA干涉片段以及DNA干涉载体。由于前者转染效率还存在RNAi功效的瞬时性程度不够,现在大多数应用DNA载体于细胞里表达siRNA相关技术。杨彤涛等对于Survivin基因的RNA干涉特异性片段进行合成,利用骨肉瘤细胞体外生长还有体内移植成瘤试验,证明Survivin的特异性siRNA能够大大促进骨肉瘤细胞自行凋亡的过程。能够看出在有关骨肉瘤的实验性治疗过程里,RNAi能够对于癌基因的表达加以遏制、对于突变激活的癌基因进行清除、克制基因扩增的同时,还能够克制融合基因表达、克制其他肿瘤有关基因的表达。Zou等利用干扰RNA技术并且应用依泊托苷、阿霉素等有关的化疗药物,能够很明显的克制MG63细胞的产生,提升化疗的敏感程度,实验的结果显示出关于Survivin的干扰RNA技术能够提升化疗的效果,进而降低所使用化疗药物的数量,降低因药物所产生不良反应的发生,实现对骨肉瘤细胞生长的有效抑制,显示出抑制Survivin基因联合化疗治疗骨肉瘤的优越性。综上所述,我们拟进行对Survivin及整合素α 5与骨肉瘤恶性行为特性的关系的研究,评价针对Survivin的干扰RNA技术治疗后骨肉瘤细胞内整合素α 5表达的变化情况;分析Survivin与整合素α 5的上下游调控关系,观察上述治疗手段对骨肉瘤组织体内生长的影响,明确Survivin能否通过整合素α 5产生对骨肉瘤细胞的体外、体内作用,使Survivin-SiRNA及整合素α5特异性抗体成为骨肉瘤靶向治疗的新手段。第一章:针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株的制备及体外验证研究目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株,对比分析转染后Survivin在骨肉瘤细胞中的含量,以验证转染效果。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）和空白对照组（空脂质体转染）,再采用Western blot技术检测三组MG63细胞转染后Survivin蛋白的含量,并进行比较。结果:Western blot检测得出的结果显示出MG63细胞裂解液里具备特异性的Survivin蛋白条带。Survivin-SiRNA能降低MG63细胞内Survivin蛋白的表达,Survivin-SiRNA转染骨肉瘤细胞系MG63后Survivin蛋白的含量相比较于阴性对照组和空白对照组中细胞内Survivin蛋白的含量均是下降的。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着降低了骨肉瘤MG63细胞中Survivin蛋白的含量,进一步证实了 Survivin-SiRNA可以成功抑制Survivin的表达。该转染细胞株的制备为的后续体外细胞学及体内组织学实验积累了相关经验,奠定了理论基础。第二章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,再采用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。结果:Transwell实验结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,侵袭细胞数显着减少（P<0.01）。而细胞划痕实验结果也显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。进一步证实了抑制Survivin的表达可以影响骨肉瘤细胞的发生发展,提示Survivin不仅与骨肉瘤原位生长密切相关,而且可能参与了骨肉瘤远处转移的过程。第三章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5表达水平的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤中整合素α5表达水平的影响,验证整合素α 5是否为Survivin的下游信号传导通路元件。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,再采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平,并进行比较。结果:通过流式细胞术和荧光显微镜进行观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,整合素α 5的表达水平受到显着抑制（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5的表达水平。进一步证实了针对性抑制Survivin的表达可以下调骨肉瘤细胞中整合素α 5的表达,这说明Survivin可能是整合素α 5的一种上游调节剂,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用。第四章:靶向治疗整合素α 5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的整合素α5-SiRNA转染细胞株,在验证转染效果后探讨整合素α 5-SiRNA以及靶向抗整合素α 5抗体对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向整合素α5的整合素α5-SiRNA对MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scrαmble RNA转染）,采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平以验证转染效果,之后利用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。再使用靶向抗整合素α 5抗体（M200）作用于骨肉瘤MG63细胞,通过Transwell实验及细胞划痕实验继续观察、比较靶向治疗后MG63细胞的侵袭和迁移能力。结果:Transwell实验结果显示经转染整合素α 5-SiRNA后以及抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞分别与阴性对照组进行比较,发现侵袭细胞数均显着减少（P<0.01）。而细胞划痕实验结果也显示抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降（P<0.01）;而阴性对照组在48h内的划痕区域中细胞迁移率甚至超出转染整合素α5-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞的两倍之多（P<0.01）。结论:无论是靶向干扰RNA还是靶向抗体治疗均显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。一方面证明了整合素α 5的表达与骨肉瘤细胞侵袭和转移的相关性。另一方面也提示靶向抑制整合素α 5的表达可以直接达到治疗效果,从而为更新骨肉瘤临床治疗方案提供了理论依据。第五章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响目的:将针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株移植到裸鼠体内,建立了骨肉瘤动物模型,观察其体内生长成瘤情况。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,之后将两组细胞分别接种至裸鼠腹部的左、右两侧皮下。接种三个星期后,处死小鼠并称重肿瘤。观察肿瘤体积,计算肿瘤的平均重量,并进行比较。结果:通过肿瘤称重和肉眼观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞成瘤体积和重量均较阴性对照组明显缩小和下降（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的体内生长成瘤情况。进一步证实了抑制Survivin的表达可以减缓异种移植瘤的生长,提示Survivin在骨肉瘤增殖繁衍过程中的重要作用。
刘金禄[7]（2015）在《siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究》文中指出第一部分siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定目的:用前期实验筛选获得的CLIC1 siRNA3片段构建重组慢病毒载体,进一步构建稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株,实时荧光定量PCR筛选抑制率最好的单克隆胃癌细胞株。方法:（1）直接用前期研究已经筛选出的CLIC1 siRNA3为沉默CLIC1基因的最有效片段。制备双链DNA oligo,利用基因重组技术克隆到慢病毒表达载体GV115中,双酶切后行DNA测序鉴定重组慢病毒载体。将慢病毒包装辅助质粒和制作的含CLIC1 siRNA的重组慢病毒载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用孔稀释法测定病毒滴度。另外,利用上海吉凯公司的阴性序列病毒作为阴性对照。（2）将病毒分别感染胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803,各挑取6组GFP强表达的细胞克隆团转移种植建立两稳定单克隆细胞株,荧光定量PCR检测CLIC1抑制率,选取抑制率最好的克隆组。结果:经测序成功构建针对CLIC1的重组慢病毒RNA干扰表达载体;利用293T细胞包装重组慢病毒载体后成功收集到重组慢病毒颗粒,其病毒滴度为:1.2E+9 TU/mL;利用重组慢病毒颗粒感染两株胃癌细胞,感染效率均在80%以上;成功扩增并分别获得6组稳定低表达CLIC1的单克隆胃癌细胞株;荧光定量PCR鉴定获得抑制效率最好的单克隆胃癌细胞株;SGC-7901和MGC-803单克隆株的CLIC1抑制率分别为89.3%和93.8%。结论:成功构建CLIC1 siRNA干扰慢病毒载体,并成功获得抑制效率较好的低表达CLIC1稳转胃癌细胞株,为下一步探讨沉默CLIC1对胃癌生长的体内体外实验奠定良好的基础。第二部分siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响目的:探讨siRNA干扰CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:用MTT法检测抑制CLIC1表达前后细胞的增殖情况;用AnnexinV-APC单染进行流式细胞技术检测,观察抑制前后各组细胞凋亡变化情况;用PI单染的方法检测各组细胞周期变化情况;用Transwell小室及Matrigel胶检测细胞侵袭和迁移能力的变化。结果:转染后24h、48h、72h、96h、120h干扰组A值均低于空白对照组和阴性对照组（均P<0.05）;SGC-7901干扰组转染后24h、48h、72h、96h、120h 的细胞增殖率分别为 27.829%、52.663%、71.785%、28.778%和20.450%;MGC-803 干扰组分别为 16.910%、42.169%、127.244%、101.388%和34.118%。SGC-7901（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:0.743±0.031 vs 0.587±0.025 vs 0.597±0.032,F=26.628,P<0.01）和 MGC-803（干扰组vs空白对照组vs阴性对照组%:4.370±0.125 vs 1.453±0.166 vs 1.510±0.079,F=506.432,P<0.01）干扰组的细胞凋亡率均显着高于各自的空白对照组和阴性对照组。在SGC-7901细胞中,干扰组G0/G1期比例显着低于空白对照组及阴性对照组（F=172.299,均P<0.01）,G2/M期比例显着高于空白对照组及阴性对照组（F=2665.338,P<0.01）;在MGC-803细胞中,G2/M期细胞比例干扰组也显着高于空白对照组及阴性对照组（F=631.560,P<0.01）,G0/G1及G2/M期细胞比例均显着低于空白对照组及阴性对照组（F=889.621,P<0.01）。干扰组侵袭、迁移实验中的穿膜细胞数（SGC-7901 分别是:86.000±6.000、118.333±8.505,MGC-803:81.333±5.033、108.667土8.327）均显着低于空白对照组（SGC-7901分别是:156.667±14.843、181.667±11.719,MGC-803:168.333±17.388、185.000±11.000）和阴性对照组（SGC-7901 分别是 150.333±13.051、178.667土7.024,MGC-803:161.000土 15.716、179.333土10.408）（均 P<0.01）。结论:抑制CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803增殖增快、凋亡增加、细胞周期阻滞在G2/M期、侵袭迁移能力受到抑制。提示抑制CLIC1是胃癌基因治疗的一个潜在有效的靶点。第三部分基于iTRAQ蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白目的:应用iTRAQ结合质谱分析的蛋白组学技术分析对比抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC7901的差异表达蛋白。方法:提取两组细胞的总蛋白,经蛋白质酶解、iTRAQ标记、质谱分析和数据库搜索等步骤后,筛选出符合条件的蛋白质:114/115的比值≥2.0或≤0.5;最后对差异蛋白进行生物信息学分析。结果:抑制CLIC1表达后在Human数据库中共鉴定到1170个蛋白肽段,差异蛋白54个,36个上调表达,18个下调表达;Mouse数据库中鉴定到858个蛋白肽段,差异蛋白39个,上调表达24个,下调表达15个。差异蛋白主要定位于细胞内,以结合作用和生物调节作用为主。结论:筛选出了一组与CLIC1沉默相关的差异蛋白,为明确CLIC1在胃癌中的作用机制提供了线索和基础。第四部分siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞整合素和凋亡基因mRNA及蛋白的影响目的:探讨抑制CLIC1表达后胃癌细胞中部分凋亡和整合素相关基因及蛋白的表达情况。方法:应用实时荧光定量PCR和Western blot检测胃癌细胞中整合素（α1、α3、αv、β 1）和凋亡（Bcl-2、survivin、Fas）相关基因和蛋白的表达情况。结果:（1）SGC-7901和MGC-803干扰组细胞中整合素α3、αv和β1基因表达均显着下降（SGC-7901:52.547%、33.766%、34.132%和 MGC-803:56.500%、51.900%、76.347%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901 中表达升高（干扰组vs空白对照组vs阴性对照:1.705±0.096 vs 1.000±0.014 vs 0.931±0.016）,在 MGC-803 中表达下降（0.503±0.059 vs 1.000土0.038 vs 1.011 土0.059）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（2）两组细胞中整合素 α3、αv和β1 蛋白表达均显着下降（SGC-7901:70.924%、35.491%、55.209%和 MGC-803:46.729%、53.765%、70.935%）（均P<0.05）,α1 在 SGC-7901中表达干扰组高于空白对照组和阴性对照组（1.577±0.021 vs 0.610±0.046 vs 0.650±0.044）,在 MGC-803 中表达下降（0.607±0.031 vs 1.123±0.040 vs 1.110±0.046）,差异均有统计学意义（均P<0.05）。（3）两干扰组中Bcl-2基因和蛋白的表达均下降（mRNA:65.200%和74.725%,蛋白:60.023%和54.023%）（均P<0.05）,Fas基因和蛋白的表达均上升（mRNA:97.702%和 173.826%,蛋白:83.091%和 76.935%）（均P<0.05）,survivin 表达不变（P>0.05）。结论:（1）从基因和蛋白水平检测发现沉默CLIC1表达后两株胃癌细胞中的整合素α3、αv、β1均下调表达;胃癌细胞SGC-7901中的整合素α1上调表达,MGC-803中则下调表达。结合整合素在肿瘤中的作用,初步认为CLIC1基因沉默通过调节整合素的表达影响胃癌的进展。（2）抑制胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中的CLIC1表达后凋亡蛋白Fas表达上调、Bcl-2表达下调、Survivin表达无变化。结合第二部分生物学功能实验结果,Fas和Bcl-2表达的变化能促进沉默CLIC1表达后胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的凋亡。
李奇为[8]（2014）在《髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰对胆囊癌细胞化疗敏感性的影响和机制研究》文中进行了进一步梳理胆囊癌细胞耐药,具有干细胞特性的胆囊癌侧群（side population,SP）细胞耐药性更强,是影响化疗疗效的主要原因之一。我们前期研究发现升高胆囊癌细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平能下调耐药相关蛋白、提高细胞对顺铂（CDDP）的敏感性,但ROS水平的升高如何促进耐药相关蛋白下调尚不清楚。研究提示,髓细胞白血病-1（myeloid cell leukemia 1,Mcl-1）是抗凋亡蛋白,可导致细胞化疗耐药,其稳定性受到氧化还原修饰—谷胱甘肽化修饰的调控。这提示我们升高ROS可能通过谷胱甘肽化修饰途径下调Mcl-1蛋白,逆转胆囊癌细胞耐药。但在胆囊癌细胞、尤其是SP细胞中,Mcl-1和CDDP耐药的关系,以及谷胱甘肽化修饰对Mcl-1的影响仍不清楚。本研究拟阐明Mcl-1在胆囊癌细胞、SP细胞CDDP耐药中的作用和谷胱甘肽化修饰调控Mcl-1蛋白稳定性的机制,并证明通过异硫氰酸苯乙酯（PEITC）增加Mcl-1的谷胱甘肽化修饰可加强胆囊癌细胞CDDP敏感性。此外,Mcl-1的转录因子信号传导与转录激活因子 3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3）活性被报道也受到谷胱甘肽化修饰的调控,我们拟证明通过调控STAT3的谷胱甘肽化修饰可抑制Mcl-1蛋白生成、改善胆囊癌细胞CDDP耐药特性。第一部分:髓细胞白血病-1在胆囊癌细胞对顺铂耐药中的作用研究目的:研究胆囊癌细胞、胆囊癌SP细胞对CDDP耐药中Mcl-1蛋白的作用。方法:检测CDDP诱导下胆囊癌GBC-SD细胞Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1蛋白表达量变化。检测Mcl-1蛋白在SP细胞和非SP细胞中的表达差异。检测Mcl-1蛋白在人胆囊癌和慢性炎症胆囊组织中的表达差异。用siRNA下调Mcl-1蛋白表达,检测沉默Mcl-1蛋白对CDDP诱导细胞凋亡的影响。结果:1.CDDP特异性诱导胆囊癌细胞Mcl-1蛋白表达增加,并不增加Bcl-2、Bcl-x1蛋白表达。2.胆囊癌SP细胞中Mcl-1蛋白表达量明显高于非SP细胞。3.人胆囊癌组织Mcl-1蛋白表达率（71.4%）明显高于慢性炎症胆囊组织（26.7%）。4.沉默Mcl-1蛋白能显着增加CDDP诱导的细胞凋亡。结论:抗凋亡蛋白Mcl-1是胆囊癌细胞对CDDP耐药、胆囊癌SP细胞更耐药的原因之一。第二部分 异硫氰酸苯乙酯增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:在普通肿瘤细胞系、SP细胞、裸鼠移植瘤三个层面观察Mcl-1靶向药物PEITC和CDDP治疗胆囊癌细胞的协同效应,并探讨机制。方法:分对照、PEITC、CDDP、PEITC/CDDP联合处理4组,处理胆囊癌GBC-SD细胞、胆管癌RBE细胞、胆囊癌SP细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术定量细胞凋亡率,试剂盒检测细胞caspase 3活性,western-blot检测细胞Mcl-1蛋白表达量。用胆囊癌GBC-SD细胞接种裸鼠28只建立荷瘤动物模型,成瘤达50mm3后随机分为对照、PEITC、CDDP、PEITC/CDDP联合处理4组,每组7只。腹腔给药10天后,观察裸鼠的体重以及移植瘤的重量和体积变化,western-blot检测移植瘤Mcl-1蛋白表达量。结果:1.PEITC能增加CDDP对胆囊癌细胞、胆管癌细胞、胆囊癌SP细胞的杀伤作用。2.PEITC能够促进CDDP抑制胆囊癌细胞移植瘤的生长,无明显毒副作用。3.PEITC能下调胆囊癌细胞、胆囊癌SP细胞、移植瘤中Mcl-1蛋白,PEITC/CDDP联合治疗组Mcl-1蛋白表达明显低于CDDP单用组。结论:在普通肿瘤细胞系、SP细胞、裸鼠移植瘤三个层面,PEITC均能通过下调Mcl-1蛋白从而增强CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。第三部分髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:阐明胆囊癌细胞中PEITC对Mcl-1谷胱甘肽化修饰的影响和谷胱甘肽化修饰对Mcl-1稳定性的调控。方法:使用PEITC处理胆囊癌GBC-SD细胞,观察其对细胞内Mcl-1 mRNA、还原型谷胱甘肽（GSH）/氧化性谷胱甘肽（GSSG）比例、GSH水平、Mcl-1蛋白表达量、Mcl-1谷胱甘肽化修饰等的影响。并确定Mcl-1蛋白的谷胱甘肽化修饰位点,突变修饰位点致Mcl-1无谷胱甘肽化修饰后,观察突变是否影响PEITC下调Mcl-1蛋白。结果:1.PEITC通过蛋白酶体途径降解胆囊癌细胞Mcl-1蛋白。2.PEITC通过降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例从而降解Mcl-1蛋白。3.PEITC增加胆囊癌细胞内Mcl-1的谷胱甘肽化修饰。4.半胱氨酸16、286是Mcl-1谷胱甘肽化修饰位点。5.突变谷胱甘肽化修饰位点能减慢PEITC降解Mcl-1蛋白。结论:1.PEITC能降低胆囊癌细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例,进而增加Mcl-1的谷胱甘肽化修饰,减弱蛋白稳定性,促进其被蛋白酶体降解,从而增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。2.此作用受半胱氨酸16、286两个Mcl-1谷胱甘肽化修饰位点的调控。第四部分信号传导与转录激活因子3的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究目的:阐明胆囊癌细胞中STAT3的谷胱甘肽化修饰对Mcl-1蛋白生成的调控及对化疗敏感性的影响。方法:使用丁硫氨酸-亚砜亚胺（L-Buthionine-sulfoximine,BSO）处理胆囊癌GBC-SD细胞,观察其对细胞内GSH/GSSG 比例、GSH水平、Mcl-1、STAT3蛋白表达量、STAT3谷胱甘肽化修饰等的影响。分对照、BSO、CDDP、BSO/CDDP联合处理4组,处理胆囊癌GBC-SD细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术定量细胞凋亡率,试剂盒检测细胞caspase 3活性。结果:1.BSO抑制胆囊癌细胞STAT3激活并下调Mcl-1蛋白表达。2.BSO明显降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG 比例。3.BSO增加STAT3的谷胱甘肽化修饰。4.BSO增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。结论:BSO增加STAT3的谷胱甘肽化修饰,抑制其激活从而抑制下游Mcl-1蛋白生成,增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。总之,本实验揭示了抗凋亡蛋白Mcl-1是胆囊癌细胞对CDDP耐药、胆囊癌SP细胞更耐药的新原因;发现了谷胱甘肽化修饰调控Mcl-1蛋白稳定性的新机制:Mcl-1谷胱甘肽化修饰的增加会减弱蛋白稳定性,促其被蛋白酶体降解;首次证实了半胱氨酸16、286是Mcl-1的谷胱甘肽化修饰位点;PEITC通过调控Mcl-1谷胱甘肽化修饰促其降解,增加CDDP杀伤作用经过了肿瘤细胞系、SP细胞和裸鼠移植瘤模型的验证,安全有效,有较好的临床应用价值。此外,通过增加STAT3谷胱甘肽化修饰从而抑制下游Mcl-1蛋白生成,也能增加CDDP对胆囊癌细胞的杀伤作用。
宋建林[9]（2013）在《RNAi下调Survivin及VEGF表达抑制胰腺癌细胞增殖、凋亡及血管形成的实验研究》文中认为目的：探讨小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）对人胰腺癌细胞株PANC-1Survivin和／或血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达的抑制作用,对胰腺癌细胞生长、凋亡的影响；并制备相应的条件培养基作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,测定抑制人胰腺癌细胞株PANC-1survivin表达后条件培养基对内皮细胞生长、凋亡的影响；方法：分别设计并合成针对Survivin及VEGF的siRNA表达载体,经脂质体转染PANC-1细胞。实时荧光定量PCR和Western-blot半定量检测胰腺癌细胞内Survivin和VEGF的表达情况；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测转染后PANC-1细胞的增殖,流式细胞仪检测转染后PANC-1细胞的凋亡率；将各组转染后Panc-1细胞培养液收集,作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测HUVEC的增殖,流式细胞仪检测HUVEC的凋亡率。结果：1.成功构建4个针对Survivin的载体（S1、S2、S3、S4）, Survivin mRNA及蛋白表达明显下降,其中载体S4抑制效率最高；抑制Survivin表达后胰腺癌细胞Panc-1增殖减慢,细胞凋亡率增加；同时HUVEC（人脐静脉内皮细胞）增殖减慢,细胞凋亡率增加。2.成功构建4个针对VEGF的载体（V1、V2、V3、V4）, VEGF mRNA及蛋白表达明显下降,其中载体V3抑制效率最高；抑制VEGF表达后胰腺癌细胞Panc-1增殖减慢,细胞凋亡率增加；同时HUVEC（人脐静脉内皮细胞）增殖减慢,细胞凋亡率增加。3.同时抑制Survivin和VEGF表达后,较对照组及单独抑制Survivin或VEGF组,胰腺癌细胞Panc-1增殖显着减慢,细胞凋亡率显着增加；同时HUVEC（人脐静脉内皮细胞）增殖显着减慢,细胞凋亡率显着增加。结论：1.靶向Survivin或VEGF的RNAi能够有效抑制胰腺癌细胞Survivin的表达,抑制胰腺癌细胞的增殖,增加胰腺癌细胞的凋亡,并通过抑制血管内皮细胞的增殖,增加血管内皮细胞的凋亡,抑制肿瘤血管的形成。2.同时靶向Survivin及VEGF的RNAi能够同时有效抑制胰腺癌细胞Survivin及VEGF的表达,较单独抑制Survivin或VEGF,显着抑制胰腺癌细胞的增殖,增加胰腺癌细胞的凋亡,并通过抑制血管内皮细胞的增殖,显着增加血管内皮细胞的凋亡,抑制肿瘤血管的形成。
颜洁[10]（2013）在《联合转染反义寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549细胞生长的研究》文中提出目的：本实验针对Survivin和VEGF mRNA序列设计反义寡核苷酸（ASODN），以脂质体（Lip）为载体，应用Survivin和VEGFASODN联合转染非小细胞肺癌A549细胞株，探讨同时抑制Survivin和VEGF两个基因对肺癌细胞增殖、凋亡以及基因表达的影响，为非小细胞肺癌双靶点基因治疗提供实验依据。方法：①将实验分为7组，Blank组：A549细胞；Lip组：Lipofectamine2000转染A549细胞；Survivin SODN组；VEGF SODN组；SurvivinASODN；VEGFASODN；Survivin+VEGF组：Survivin ASODN和VEGF ASODN联合转染A549细胞。②利用反义寡核苷酸技术，以脂质体（Lip）为载体，分别介导200、400、600nmol/L SurvivinASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN单独转染A549细胞，镜下观察转染后的细胞形态变化，转染24h、48h、72h、96h后，MTT法检测细胞生长抑制率，RT-PCR测定细胞中Survivin和VEGF基因mRNA表达。③用脂质体介导400nmol/L SurvivinASODN和10μmol/L VEGF ASODN联合转染A549细胞，48h后观察联合转染组细胞形态变化，MTT检测细胞增殖情况，RT-PCR检测Survivin和VEGF mRNA表达，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡和Survivin蛋白表达。结果：①显微镜下Blank组、Lip组、SODN组细胞形态完整、贴壁良好，ASODN组细胞形态不规则、生长减慢，Survivin+VEGF组细胞皱缩、成簇状漂浮；②MTT结果显示A549细胞分别经200、400、600nmol/L SurvivinASODN和5、10、20μmol/LVEGF ASODN转染，孵育24h，48h，72h，96h后细胞生长出现不同程度的抑制，与Blank组、Lip组、SODN组相比，细胞增殖抑制率显着升高（P<0.05）；且SurvivinASODN和VEGF ASODN抑制作用均在48h达到高峰，随孵育时间增加，抑制作用逐渐减弱；③ASODN组抑制作用呈剂量依赖性，其中SurvivinASODN在400nmol/L浓度处出现明显的抑制效果，细胞增殖抑制率为（49.24±1.15）%，与200nmol/L（39.54±1.93）%相比显着增高（P<0.05），mRNA相对含量明显降低（P<0.05）；VEGFASODN在10μmol/L浓度处出现明显的抑制效应，抑制率为（39.54±1.44）%，抑制作用比浓度为5μmol/L（27.47±1.30）%时明显增强，mRNA表达也显着降低，两者差异均具有统计学意义（P<0.05）；④400nmol/L SurvivinASODN和10μmol/LVEGFASODN转染A549细胞48h后， Survivin+VEGF组的细胞生长抑制率为（61.37±1.94）%，较单独转染Survivin ASODN（50.44±1.13）%和VEGF ASODN（39.33±1.99）%的抑制效果明显增加（P＜0.05）；⑤Annexin V-FITC/PI双标记细胞后流式细胞仪检测Survivin+VEGF组A549细胞凋亡率为（57.03±1.61）%，显着高于SurvivinASODN （22.33±2.41）%和VEGFASODN（18.28±1.13）%单独转染组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；⑥RT-PCR结果显示Survivin+VEGF组SurvivinmRNA和VEGF mRNA相对含量分别为（15.26±1.31）%和（13.12±1.45）%，较Blank组、Lip组、SODN组、ASODN组显着降低（P<0.01），ASODN组中单个基因被抑制，另一基因mRNA表达也出现下调；⑦流式检测Survivin蛋白表达率，Survivin+VEGF组为（30.40±1.33）%、Survivin ASODN组为（41.41±1.19）%、VEGFASODN组为（46.84±1.72）%，双基因ASODN联合转染对Survivin蛋白表达的抑制强度明显高于单独转染组（P<0.05），此外，Survivin蛋白的表达在VEGFASODN组也明显减少（P<0.05）。结论：Survivin和VEGF ASODN联合转染能够抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡，同时显着降低Survivin和VEGF mRNA以及Survivin蛋白的表达，两基因反义寡核苷酸联合转染的效果明显优于SurvivinASODN和VEGFASODN单独转染。
二、单独及联合转染survivin和bcl-2反义寡核苷酸诱导胆囊癌细胞凋亡的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单独及联合转染survivin和bcl-2反义寡核苷酸诱导胆囊癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
（1）空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 1.2.2 可变剪接与肿瘤治疗 |
| 1.2.3 凋亡因子Mcl-1可变剪接与肿瘤 |
| 1.2.4 空间阻滞寡核苷酸应用现状 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 主要研究内容与研究方案 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 Mcl-1可变剪接与胃癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验对象 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Mcl-1表达与胃癌的相关性 |
| 2.3.2 Mcl-1 可变剪接异构体mRNA在胃癌组织中的表达 |
| 2.3.3 Mcl-1S和 Mcl-1L mRNA表达与胃癌临床进展的相关性 |
| 2.3.4 胃癌组织Mcl-1L与 Mcl-1S表达的蛋白水平验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验对象 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌细胞株 Mcl-1L 及 Mcl-1S 基础表达 |
| 3.3.2 空间阻滞寡合苷酸(SBOs)转染效率评价 |
| 3.3.3 SBOs 对 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 3.3.4 SBOs对胃癌细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.3.5 SBOs对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导凋亡的体内实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 研究对象 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 SBOs对裸鼠的毒性反应 |
| 4.3.2 SBOs 治疗对移植瘤体 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 4.3.3 SBOs 治疗对移植瘤体细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.3.4 SBOs 对移植瘤增殖生长的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）功能小分子-硫代核酸偶联物的合成及其抗肿瘤应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 重要缩略语中英文对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳米药物递送体系分类 |
| 1.2.1 脂质体 |
| 1.2.2 聚合物囊泡 |
| 1.2.3 聚合物胶束 |
| 1.2.4 纳米凝胶体系 |
| 1.2.5 无机纳米粒子 |
| 1.2.6 蛋白载体 |
| 1.2.7 多肽载体 |
| 1.2.8 核酸载体 |
| 1.2.8.1 核酸载体进行小分子药物递送 |
| 1.2.8.2 核酸载体进行大分子药物递送 |
| 1.2.9 其他药物载体 |
| 1.3 核酸化学修饰在药物递送体系中的应用 |
| 1.3.1 核酸药物的化学修饰 |
| 1.3.2 药物分子与核酸的接枝偶联 |
| 1.4 本文究目的、主要内容和意义 |
| 第二章 马来酰亚胺-硫代核酸偶联物促进反义寡核苷酸入胞研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验仪器和药品 |
| 2.2.1.1 实验试剂和药品 |
| 2.2.1.2 实验仪器 |
| 2.2.1.3 核酸序列 |
| 2.2.2 合成部分 |
| 2.2.2.1 苄溴修饰的马来酰亚胺分子(Mal-Bz-Br)的合成 |
| 2.2.2.2 马来酰亚胺-硫代反义寡核苷酸偶联物(Mal-g-ASO)合成 |
| 2.2.3 表征实验 |
| 2.2.3.1 Mal-g-ASO分子识别功能表征 |
| 2.2.3.2 Mal-g-ASO体外RNase H酶依赖m RNA降解功能 |
| 2.2.3.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE) |
| 2.2.3.4 非变性PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 细胞毒性实验 |
| 2.2.6 流式细胞实验 |
| 2.2.6.1 Mal-g-ASO在不同细胞系中的摄取 |
| 2.2.6.2 不同马来酰亚胺偶联个数对细胞摄取的影响 |
| 2.2.6.3 Mal-g-ASO细胞摄取的时间和浓度依赖性 |
| 2.2.6.4 细胞内吞抑制实验 |
| 2.2.6.5 膜表面巯基抑制实验 |
| 2.2.7 激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM) |
| 2.2.8 Mal-g-ASO的基因沉默作用 |
| 2.2.8.1 qRT-PCR |
| 2.2.8.2 Western blot |
| 2.2.9 细胞凋亡实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Mal-Bz-Br的合成和表征 |
| 2.3.2 Mal-g-ASO的合成和表征 |
| 2.3.3 Mal-g-ASO的细胞摄取行为 |
| 2.3.3.1 Mal-g-ASO在不同细胞中的摄取行为研究 |
| 2.3.3.2 接枝数量、孵育时间和浓度对Mal-g-ASO细胞摄取的影响 |
| 2.3.3.3 Mal-g-ASO细胞摄取机制研究 |
| 2.3.4 CLSM成像结果 |
| 2.3.5 Mal-g-ASO的细胞水平基因沉默和凋亡效应 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 光敏剂-硫代核酸偶联物自组装纳米水凝胶的构建及其光动力、免疫联合治疗研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验仪器和药品 |
| 3.2.1.1 实验试剂和药品 |
| 3.2.1.2 实验仪器 |
| 3.2.1.3 核酸序列 |
| 3.2.2 合成部分 |
| 3.2.2.1 苄溴修饰焦脱镁叶绿酸a合成(PPA-Bz-Br) |
| 3.2.2.2 水溶性硫代核酸-光敏剂偶联物合成(PPA-DNA) |
| 3.2.3 载药DNA四面体纳米凝胶组装 |
| 3.2.3.1 载药DNA四面体的制备(tailed-PPA-TET) |
| 3.2.3.2 药物共递送DNA纳米凝胶制备(siRNA/PPA-NG) |
| 3.2.4 表征实验 |
| 3.2.4.1 PPA接枝含量测定 |
| 3.2.4.2 siRNA/PPA-NG释放siRNA实验 |
| 3.2.4.3 变性PAGE电泳 |
| 3.2.4.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.4.5 siRNA/PPA-NG水合粒径和形貌 |
| 3.2.4.6 siRNA/PPA-NG细胞外活性氧(ROS)产生实验 |
| 3.2.5 细胞实验 |
| 3.2.5.1 细胞培养 |
| 3.2.5.2 细胞摄取实验 |
| 3.2.5.3 细胞内ROS产生 |
| 3.2.5.4 MTT实验 |
| 3.2.5.5 蛋白印迹实验(Western Blot) |
| 3.2.6 动物实验 |
| 3.2.6.1 动物 |
| 3.2.6.2 小鼠肿瘤部位药物聚集 |
| 3.2.6.3 PD-L1/PPA-NG免疫学评价 |
| 3.2.6.4 体内抗肿瘤研究 |
| 3.2.6.5 组织病理切片 |
| 3.2.6.6 免疫组化分析 |
| 3.2.6.7 免疫荧光分析 |
| 3.2.6.8 体内肿瘤western blot实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PPA-Bz-Br的合成和表征 |
| 3.3.2 亲水性PPA-DNA偶联物的表征 |
| 3.3.3 载药四面体组装(tailed-PPA-TET) |
| 3.3.4 共递送纳米凝胶的组装和表征 |
| 3.3.5 共递送纳米凝胶细胞水平性能评价 |
| 3.3.5.1 细胞摄取实验 |
| 3.3.5.2 细胞内ROS、细胞毒性研究 |
| 3.3.6 共递送纳米水凝胶体内抗肿瘤评价 |
| 3.3.6.1 体内肿瘤组织药物聚集 |
| 3.3.6.2 体内抗肿瘤免疫评价 |
| 3.3.6.3 体内抗肿瘤效应评价 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 紫杉醇-硫代核酸偶联物多功能靶向球形核酸构建及性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验仪器和药品 |
| 4.2.1.1 实验试剂和药品 |
| 4.2.1.2 实验仪器 |
| 4.2.1.3 核酸序列 |
| 4.2.2 合成部分 |
| 4.2.2.1 DNA合成 |
| 4.2.2.2 苄溴修饰的二硫代二丙酸合成(DTPA-Bz-Br) |
| 4.2.2.3 苄溴修饰的紫杉醇分子合成(PTX-Bz-Br) |
| 4.2.2.4 嵌段型两亲性紫杉醇-核酸偶联物的合成 |
| 4.2.3 表征实验 |
| 4.2.3.1 PTX接枝含量测定 |
| 4.2.3.2 载药球形核酸制备 |
| 4.2.3.3 20%变性PAGE电泳 |
| 4.2.3.4 1.0%琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.2.3.5 PTX-SNA水合粒径和形貌 |
| 4.2.3.6 临界胶束浓度(Critical micellar concentration,CMC)测定 |
| 4.2.3.7 PTX-SNA的稳定性 |
| 4.2.3.8 PTX-SNA体外响应性药物释放 |
| 4.2.4 细胞实验 |
| 4.2.4.1 细胞培养 |
| 4.2.4.2 PTX-SNA体外细胞摄取行为 |
| 4.2.4.3 体外细胞毒性和抗耐药研究 |
| 4.2.4.4 细胞凋亡实验 |
| 4.2.4.5 qRT-PCR |
| 4.2.4.6 Western blot |
| 4.2.5 动物实验 |
| 4.2.5.1 动物模型建立 |
| 4.2.5.2 体内肿瘤靶向和分布 |
| 4.2.5.3 肝肾毒性实验 |
| 4.2.5.4 体内抗肿瘤研究 |
| 4.2.5.5 体内抗肿瘤耐药研究 |
| 4.2.5.6 组织病理切片 |
| 4.2.5.7 免疫组化分析 |
| 4.2.5.8 免疫荧光分析 |
| 4.2.5.9 体内基因敲除实验 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 DTPA-Bz-Br和 PTX-Bz-Br的合成和结构表征 |
| 4.3.2 嵌段型两亲性紫杉醇-核酸偶联物(~(PO)DNA-b-(~(PS)DNA-g-PTX))的结构表征 |
| 4.3.3 PTX-SNA制备和表征 |
| 4.3.3.1 CMC测定 |
| 4.3.3.2 PTX-SNA尺寸、形貌和稳定性研究 |
| 4.3.3.3 PTX-SNA响应性药物释放 |
| 4.3.4 靶向PTX-SNA制备和表征 |
| 4.3.5 靶向PTX-SNAs细胞层面靶向性和抗肿瘤研究 |
| 4.3.5.1 细胞层面肿瘤靶向性研究 |
| 4.3.5.2 细胞层面抗肿瘤研究 |
| 4.3.6 靶向PTX-SNA动物层面靶向性、安全性和抗肿瘤研究 |
| 4.3.6.1 靶向PTX-SNA动物层面靶向性研究 |
| 4.3.6.2 靶向PTX-SNA体内安全性评价 |
| 4.3.6.3 靶向PTX-SNA抗肿瘤研究 |
| 4.3.7 多功能抗耐药PTX-SNA的制备和表征 |
| 4.3.8 多功能抗耐药PTX-SNA细胞水平抗耐药研究 |
| 4.3.8.1 多功能抗耐药PTX-SNA细胞摄取 |
| 4.3.8.2 多功能抗耐药PTX-SNA对耐药细胞抑制作用 |
| 4.3.9 多功能抗耐药PTX-SNA在动物水平对耐药肿瘤抑制作用研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间论文发表情况 |
（3）基于纳米抗体靶向性泛素化降解技术的Survivin亚细胞功能探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 Survivin的结构与功能及其定位 |
| 1.1.1 Survivin的结构 |
| 1.1.2 Survivin的多重角色与功能 |
| 1.1.3 Survivin的亚细胞定位 |
| 1.2 降低细胞内源性Survivin表达量的不同策略 |
| 1.2.1 基因水平抑制Survivin的表达 |
| 1.2.2 蛋白水平的Survivin抑制剂 |
| 1.3 泛素-蛋白酶体途径 |
| 1.3.1 泛素蛋白酶体系统 |
| 1.3.2 三联基序蛋白TRIM21 |
| 1.4 基于抗体靶向Survivin的泛素化降解 |
| 1.5 本课题的研究目的与意义 |
| 第2章 靶向降解细胞内源性Survivin方法的建立与重组质粒的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒及菌株 |
| 2.2.2 主要实验仪器与设备 |
| 2.2.3 酶类与试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 靶向癌细胞内Survivin泛素化降解的设计 |
| 2.3.2 基因序列的获取及蛋白质3D结构的预测 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 蛋白3D模型预测的结果 |
| 2.4.2 重组质粒的构建 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 TRIM21介导癌细胞中Survivin的泛素化降解及其促凋亡评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 质粒 |
| 3.2.2 细胞株 |
| 3.2.3 主要仪器及设备 |
| 3.2.4 实验所需试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞转染 |
| 3.3.3 细胞株的优选 |
| 3.3.4 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21的抗肿瘤活性研究 |
| 3.3.5 Western blot检测细胞中Survivin以及凋亡相关蛋白的表达水平 |
| 3.3.6 蛋白酶体抑制剂MG132验证Survivin由泛素-蛋白酶体途径介导的降解 |
| 3.3.7 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 细胞株的优选 |
| 3.4.2 核染观察Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对癌细胞的促凋亡作用 |
| 3.4.3 流式细胞仪分析细胞凋亡率 |
| 3.4.4 Western blot分析Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对Survivin的降解能力以及对细胞中凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 3.4.5 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21通过泛素-蛋白酶体途径介导Survivin的降解 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 探索Survivin在不同亚细胞定位中的功能 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 质粒 |
| 4.2.2 细胞株 |
| 4.2.3 主要仪器与设备 |
| 4.2.4 实验所需试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞核定位信号 |
| 4.3.2 免疫荧光分析Survivin的靶向降解 |
| 4.3.3 不同重组质粒对细胞活性的研究 |
| 4.3.4 靶向降解细胞核Survivin对细胞凋亡的影响 |
| 4.3.5 靶向降解细胞核Survivin对细胞周期的影响 |
| 4.3.6 统计学分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 核定位信号NLS的验证 |
| 4.4.2 靶向降解细胞质Survivin和细胞核Survivin的免疫荧光分析 |
| 4.4.3 细胞生长抑制的分析 |
| 4.4.4 细胞核中的Survivin降解后对细胞凋亡的分析 |
| 4.4.5 Survivin对细胞周期的调控 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间科研成果 |
（4）基于介孔硅/MOF和DNA折纸的智能响应纳米平台用于癌症治疗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.2 介孔硅纳米材料与癌症治疗 |
| 1.2.1 介孔硅纳米载体 |
| 1.2.2 基于介孔硅纳米载体的响应型癌症治疗 |
| 1.3 DNA纳米材料与癌症治疗 |
| 1.3.1 DNA纳米材料 |
| 1.3.2 基于DNA origami的癌症治疗 |
| 1.4 本研究论文的工作内容 |
| 第2章 pH响应型ZIF-8包覆介孔硅复合纳米药物载体的制备与性能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器与表征 |
| 2.2.3 不同官能团修饰介孔硅的制备 |
| 2.2.4 ZIF-8包覆介孔硅复合纳米颗粒的制备与条件优化 |
| 2.2.5 ZIF-8@MSN中 ZIF-8 层酸降解实验 |
| 2.2.6 Dox-ZIF-8@MSN的制备 |
| 2.2.7 Dox-ZIF-8@MSN载药量计算 |
| 2.2.8 Dox-ZIF-8@MSN在不同p H条件下药物释放 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 实验原理 |
| 2.3.2 不同官能团修饰的介孔硅纳米颗粒TEM表征 |
| 2.3.3 介孔硅纳米颗粒的FTIR表征 |
| 2.3.4 不同官能团修饰的介孔硅纳米颗粒包ZIF-8的初步验证 |
| 2.3.5 MSN-COOH包 ZIF前后TEM图 |
| 2.3.6 MSN-COOH@ZIF-8 复合纳米颗粒的表征 |
| 2.3.7 MSN-COOH和 MSN-COOH@ZIF-8的Zeta电位 |
| 2.3.8 MSN-COOH和 MSN-COOH@ZIF-8 的元素分布能谱曲线 |
| 2.3.9 反应时间对合成MSN-COOH@ZIF-8 复合纳米颗粒的影响 |
| 2.3.10 Zn和2-甲基咪唑摩尔比对合成MSN-COOH@ZIF-8 复合纳米颗粒的影响 |
| 2.3.11 反应温度对合成 MSN-COOH@ZIF-8 复合纳米颗粒的影响 |
| 2.3.12 Dox-MSN-COOH@ZIF-8 复合纳米颗粒的载药量计算 |
| 2.3.13 Dox-MSN-COOH@ZIF-8 复合纳米颗粒的p H响应药物控释性能研究 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 pH响应型介孔硅@ZIF-8 纳米颗粒共输送化疗药物和siRNA用于增强耐药癌细胞的治疗研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 Dox-MSN-COOH@ZIF-8/Bcl-2 siRNA复合纳米颗粒的制备 |
| 3.2.4 MSN-COOH@ZIF-8/Bcl-2 siRNA复合纳米颗粒中siRNA的 p H响应释放 |
| 3.2.5 MSN-COOH@ZIF-8 保护的Bcl-2 siRNA在血清中的稳定性考察 |
| 3.2.6 MSN-COOH@ZIF-8 纳米颗粒的细胞毒性考察 |
| 3.2.7 MSN-COOH@ZIF-8 纳米颗粒同时递送Dox药物和siRNA的细胞内吞实验 |
| 3.2.8 Dox-MSN-COOH@ZIF-8 的内涵体-溶酶体逃逸实验 |
| 3.2.9 Dox-MSN-COOH@ZIF-8 的细胞内吞途径实验 |
| 3.2.10 MSN-COOH@ZIF-8 纳米颗粒递送siRNA沉默Bcl2 蛋白测试 |
| 3.2.11 Dox-MSN-COOH@ZIF-8/Bcl2 siRNA引起的细胞凋亡实验 |
| 3.2.12 Dox-MSN-COOH@ZIF-8/Bcl2 siRNA对耐药癌细胞的体外抗肿瘤实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 实验原理 |
| 3.3.2 MSN-COOH@ZIF-8 负载siRNA后的Zeta电位变化 |
| 3.3.3 MSN-COOH@ZIF-8对siRNA的负载效率及p H释放曲线 |
| 3.3.4 MSN-COOH@ZIF-8 保护的Bcl-2 siRNA在血清中的稳定性 |
| 3.3.5 MSN-COOH@ZIF-8与ZIF-8 纳米颗粒的细胞毒性 |
| 3.3.6 MSN-COOH@ZIF-8 纳米颗粒共递送Dox和 siRNA进入细胞的效果 |
| 3.3.7 Dox-MSN-COOH@ZIF-8 纳米颗粒的溶酶体逃逸证明 |
| 3.3.8 MSN-COOH@ZIF-8 纳米颗粒增强siRNA进细胞的效果分析 |
| 3.3.9 MSN-COOH@ZIF-8 纳米颗粒递送siRNA沉默Bcl2 蛋白的效果 |
| 3.3.10 Dox-MSN-COOH@ZIF-8/Bcl2 siRNA引起的细胞凋亡 |
| 3.3.11 MSN-COOH@ZIF-8 同时递送Dox和 Bcl2 siRNA对耐药癌细胞的体外抗肿瘤效果 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 基于DNA折纸的纳米机器人用于同时实现对micro RNA的体外检测和反义DNA的释放 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 DNA origami的制备 |
| 4.2.4 琼脂糖电泳表征DNA origami |
| 4.2.5 DNA折纸机器人(DONR)的组装 |
| 4.2.6 AFM表征DNA origami和 DONR组装体 |
| 4.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)表征 |
| 4.2.8 均相溶液中的荧光实验 |
| 4.2.9 实时荧光监测DONR机器人的运行 |
| 4.2.10 改变Track的间距和数量对DONR机器人运行的影响 |
| 4.2.11 DONR对 miR-21 响应的灵敏度和选择性 |
| 4.2.12 AFM表征DONR机器人的运行 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 实验原理 |
| 4.3.2 DONR机器人的DNA链序列反应原理 |
| 4.3.3 PAGE检测DNA链之间反应的可行性 |
| 4.3.4 实验条件优化 |
| 4.3.5 均相溶液中验证miR-21 激活Mg Z robot的可行性 |
| 4.3.6 矩形DNA origami的设计 |
| 4.3.7 矩形DNA origami的表征 |
| 4.3.8 带锚定链的DNA origami的设计(12nm间距) |
| 4.3.9 矩形DNA origami上 Mg Z robot跨越距离 |
| 4.3.10 AFM表征Mg Z robot,底物链,Bcl2 反义DNA链分别组装在start,track,goal位点 |
| 4.3.11 机器人DONR运行的实时荧光与AFM表征 |
| 4.3.12 机器人DONR运行的AFM表征图 |
| 4.3.13 机器人DONR运行的控制实验-track位点SA标记的底物链的AFM表征图 |
| 4.3.14 机器人DONR运行的控制实验-goal位点SA标记的cargo链的AFM表征图 |
| 4.3.15 机器人DONR运行前-goal位点SA标记的cargo链的统计 |
| 4.3.16 机器人DONR运行后-goal位点SA标记的cargo链的统计 |
| 4.3.17 机器人DONR运行前后goal位点SA标记的cargo链的统计对比 |
| 4.3.18 Mg~(2+)离子浓度对机器人DONR运行效率的影响 |
| 4.3.19 带锚定链的DNA origami的设计(6nm间距) |
| 4.3.20 锚定点间距对机器人DONR运行效率的影响 |
| 4.3.21 抽掉部分track位点对机器人DONR运行效率的影响 |
| 4.3.22 缩短起点到终点的距离对机器人DONR运行效率的影响 |
| 4.3.23 机器人DONR信号放大检测miR-21 的灵敏度与特异性 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 肿瘤标志物响应的智能DNA origami纳米机器人用于精准的癌症诊断与治疗 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.2.3 FAM标记DNA origami的制备 |
| 5.2.4 DNA折纸在培基及细胞裂解液中的稳定性考察 |
| 5.2.5 激光共聚焦显微镜(CLSM)观察DONR在细胞内运行以及对应的流式分析 |
| 5.2.6 三种细胞内miR-21的表达水平测试 |
| 5.2.7 蛋白质印记法(Western blotting)检测Bcl2 蛋白的表达 |
| 5.2.8 q RT-PCR检测Bcl2 m RNA的表达 |
| 5.2.9 免疫荧光检测Bcl2蛋白表达 |
| 5.2.10 细胞存活率检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 实验原理 |
| 5.3.2 DNA origami在培基和细胞裂解液中的稳定性 |
| 5.3.3 FAM标记的DNA origami的溶酶体逃逸表征 |
| 5.3.4 FAM标记的DNA origami进入三种细胞的表征 |
| 5.3.5 q RT-PCR分析三种细胞中miR-21 的表达水平 |
| 5.3.6 DONR纳米机器人在细胞的运行表征 |
| 5.3.7 DONR-Mt和 DONR-Ms与三种细胞孵育的激光共聚焦成像 |
| 5.3.8 Bcl2的mRNA表达水平测试和蛋白表达WB测试 |
| 5.3.9 Bcl2蛋白表达水平的免疫荧光成像 |
| 5.3.10 细胞凋亡成像实验 |
| 5.3.11 细胞凋亡流式测试 |
| 5.3.12 DONR对于癌细胞的精准治疗效果测试 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 Aptamer修饰的DNA折纸共输送Dox和多种反义DNA用于多药耐药性癌细胞治疗 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 试剂与仪器 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.2.3 MUC1 aptamer修饰DNA origami的制备 |
| 6.2.4 Apt-DNA origami-ASO的制备 |
| 6.2.5 Dox-origami,DOA,Apt-DOA的制备 |
| 6.2.6 AFM表征 |
| 6.2.7 Zeta电位测定 |
| 6.2.8 Dox释放曲线 |
| 6.2.9 ASO释放测试 |
| 6.2.10 ASO的抗血清测试 |
| 6.2.11 细胞培养 |
| 6.2.12 DNA origami的稳定性考察 |
| 6.2.13 DNA origami细胞毒性考察 |
| 6.2.14 共聚焦成像与细胞流式检测 |
| 6.2.15 内涵体-溶酶体逃逸观测 |
| 6.2.16 细胞内吞途径测试 |
| 6.2.17 qRT-PCR检测mRNA的表达 |
| 6.2.18 Western Blot检测蛋白的表达 |
| 6.2.19 细胞凋亡测试 |
| 6.2.20 抗癌效果检测 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 实验设计原理 |
| 6.3.2 Apt-origami-ASO的设计图 |
| 6.3.3 Apt-orgami和 Apt-origami-ASO的表征 |
| 6.3.4 AFM表征Apt-origami-ASO与 GSH的反应 |
| 6.3.5 体外实验验证Apt-DOA释放Dox和 ASOs |
| 6.3.6 origami的细胞毒性测试 |
| 6.3.7 Apt-DOA的细胞内吞共聚焦成像 |
| 6.3.8 Dox-origami的溶酶体逃逸实验 |
| 6.3.9 Bcl2和P-gp基因沉默测试 |
| 6.3.10 细胞凋亡测试 |
| 6.3.11 对耐药癌细胞的抗癌效果测试 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（5）SM-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 SM-1 联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞的体外增殖抑制作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SM-1 联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞抑制作用的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SM-1 联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞抑制作用的体内研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 针对骨肉瘤MG63细胞系的SURVIVIN-SIRNA转染细胞株的制备及体外验证研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料及步骤 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及步骤 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素A5表达水平的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及步骤 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 靶向治疗整合素A5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及步骤 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料及步骤 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录 |
| 附件 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（7）siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 siRNA CLIC1重组慢病毒载体及低表达CLIC1稳转胃癌细胞株的构建及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要材料 |
| 2. 主要试剂及仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 5. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 siRNA沉默CLIC1基因表达后对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 5. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 基于iTRAQ的蛋白组学技术筛选抑制CLIC1表达前后胃癌细胞SGC-7901中的差异表达蛋白 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第四部分 siRNA抑制CLIC1基因表达后对胃癌细胞凋亡和整合素基因及蛋白的影响 |
| 材料与方法 |
| 1. 主要试剂 |
| 2. 主要仪器设备 |
| 3. 实验用主要液体的配制 |
| 4. 实验方法 |
| 6. 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
（8）髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰对胆囊癌细胞化疗敏感性的影响和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 全文缩略语中英文对照 |
| 前言 |
| 第一部分 髓细胞白血病-1在胆囊癌细胞对顺铂耐药中的作用研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 异硫氰酸苯乙酯增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 信号传导与转录激活因子3的谷胱甘肽化修饰增加胆囊癌细胞顺铂敏感性的机制研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 学术论文和科研成果目录 |
（9）RNAi下调Survivin及VEGF表达抑制胰腺癌细胞增殖、凋亡及血管形成的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 各载体组转染率 |
| 3.2 RNAi对Panc-1细胞Survivin及VEGF的抑制作用及靶点筛选 |
| 3.3 RNAi对Panc-1细胞Survivin及VEGF的单独及同时抑制作用 |
| 3.4 Panc-1细胞及HUVEC的增殖能力检测 |
| 3.5 Panc-1细胞及HUVEC的细胞凋亡检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）联合转染反义寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549细胞生长的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验流程 |
| 第一部分 SurvivinASODN 和 VEGFASODN 转染肺癌 A549 细胞最佳作用浓度和作用时间的筛选 |
| 1. 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 联合转染 Survivin ASODN 和 VEGF ASODN 抑制肺癌 A549 细胞的生长 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：反义寡核苷酸技术在基因治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
四、单独及联合转染survivin和bcl-2反义寡核苷酸诱导胆囊癌细胞凋亡的研究（论文参考文献）
- [1]空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究[D]. 李永红. 兰州大学, 2020(04)
- [2]功能小分子-硫代核酸偶联物的合成及其抗肿瘤应用[D]. 郭园园. 上海交通大学, 2020(01)
- [3]基于纳米抗体靶向性泛素化降解技术的Survivin亚细胞功能探究[D]. 刘畅. 华东理工大学, 2020(06)
- [4]基于介孔硅/MOF和DNA折纸的智能响应纳米平台用于癌症治疗的研究[D]. 潘青山. 湖南大学, 2020(12)
- [5]SM-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞的抑制作用及机制研究[D]. 王莹. 河北医科大学, 2017(08)
- [6]Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究[D]. 流小舟. 南方医科大学, 2016(04)
- [7]siRNA沉默CLIC1基因对人胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制的体外研究[D]. 刘金禄. 广西医科大学, 2015(08)
- [8]髓细胞白血病-1的谷胱甘肽化修饰对胆囊癌细胞化疗敏感性的影响和机制研究[D]. 李奇为. 上海交通大学, 2014(05)
- [9]RNAi下调Survivin及VEGF表达抑制胰腺癌细胞增殖、凋亡及血管形成的实验研究[D]. 宋建林. 中南大学, 2013(04)
- [10]联合转染反义寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549细胞生长的研究[D]. 颜洁. 苏州大学, 2013(S2)