一、肝纤维化大鼠肝星状细胞和肝细胞胶原表达特征的实验研究(论文文献综述)
周怡驰[1](2021)在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中进行了进一步梳理中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值(LSM)、纤维化-4指数(FIB-4)、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数(APRI)、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒(HBV-DNA)定量;次要指标:谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST),总胆红素(TBiL),谷氨酰转酞酶(GGT),白蛋白(ALB),将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组(CTL)、肝纤维化模型组(Model)、柴芪益肝方低剂量组(CQYG-L)、柴芪益肝方高剂量组(CQYG-H)和水飞蓟素治疗组(Silymarin),共5组。四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄(41.34±0.90)岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄(43.13±0.78)岁,两组年龄无统计学差异(P>0.05),具有可比性。(1)无创肝纤维化指标(LSM、FIB-4、APRI)在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异(P>0.05),但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。(2)两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒(HBV-DNA)定量和乙肝病毒表面抗原(HBsAg)治疗前和后均无显着性差异(P>0.05);CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低(P<0.05),CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。(3)两组患者自身治疗前后血清肝功能指标(ALT、AST、GGT、TBiL、ALB)均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异(P>0.05)。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低(P<0.01);CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组(P<0.05),SOD和GSH-Px含量显着高于模型组(P<0.05);免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低(P<0.05);与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高(P<0.05)。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
蒋云霞[2](2021)在《荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究》文中指出目的:以大鼠肝星状细胞T6细胞株(HSC-T6)为受试对象,探讨并完善荔枝核总黄酮(total flavonoids from Litchi Seed,TFL)拮抗肝纤维化的作用靶点与作用机制。方法:常规培养HSC-T6,分别观察TFL在不同时间和不同浓度对HSC生长增殖率的影响,从中选择最佳的TFL药物浓度进行后续实验;将HSC-T6分为细胞对照组和TFL实验组,细胞对照组的HSC-T6常规培养,TFL实验组采用上述最佳的TFL药物浓度干预HSC-T6,分别使用透射电子显微镜和ELISA方法检测各组HSC-T6的超微结构和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)含量的变化。制备肝纤维化模型大鼠,在大鼠腹部皮下注射40%四氯化碳橄榄油混悬液0.3 ml/100 g,2次/周,共8周。造模完成后,行肝组织病理染色检测,证实造模成功。将肝纤维化造模完成的大鼠分为模型对照组和TFL实验组,模型对照组大鼠在肝纤维化造模完成后常规饲养,TFL实验组大鼠予灌胃TFL 100 mg/(kg·d),4周后收集模型对照组和TFL实验组的大鼠血清。检测各组血清对HSC-T6的最大无毒浓度,以最大无毒浓度为最佳诱导剂量孵育HSC-T6,诱导分化14天后提取全蛋白,通过DDA/DIA技术筛选出模型对照组和TFL实验组血清干预后的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO、KOG、PPI、PATHWAY和亚细胞定位等生物信息学分析。结果:1.透射电镜结果显示TFL干预后HSC-T6的超微结构发生变化,细胞间隙变大,胞膜四周纤毛脱落,多角伪足减少,膜表面不平整,细胞浆内线粒体明显变形,线粒体嵴断裂或消失,粗面内质网扁池扩张,核糖体脱落,核内染色质浓缩或边聚,核膜皱缩,可见凋亡小体形成。2.ELISA 结果显示,TFL 干预后 HSC-T6 的 MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量下降。3.生物信息学分析结果显示,模型对照组和TFL实验组的差异蛋白共177个,其中上调蛋白84个,下调蛋白93个。GO分析显示,差异蛋白参与分子功能共10个条目,主要为分子结合和催化活性;细胞组分共18个条目,主要为细胞质和细胞器;生物过程共24个条目,主要为细胞过程、代谢过程、生物调节等。4.KOG注释分析显示,差异蛋白比对到KOG数据库共有23个子类和192条蛋白注释信息,其中细胞过程和信号传递是获得注释信息最多的分类,其次为信息存储与处理、新陈代谢作用和缺乏注释的蛋白等。5.PPI分析结果显示,存在互作关系的上调蛋白28个:SELENOH、C1QC、C1QB、APOE、ANGPTL4、NF1、GPX3、CLU、DMAP1、VTN、MYH14、SELENOM、HRG、PF4、HMOX1、IGH1A、IGG2A、IGHG、PGK2、PLIN2、KDM4C、ITIH4、BAZ2A、C9、ADH7、MGST1、GSTA1、ATP9B等。存在互作关系的下调蛋白42个:RAD51、HELZ2、PBK/TOPK、HMGCS1、UBE2T、UBE2C、DLGAP5、LOC100911660、PTEN、BLM、CYP51A1、MDC1、LRRK1、MVD、NSDHL、IDI1、SPC24、CDCA8、KNSTRN、CCNB2、FAM83D、HMGXB4、STARD4、HLTF、LIPG、UHRF1、KAT8、PCSK9、UBE2S、AMMECR1L、WDR76、ZNRD2、DDX10、MAP3K3、PIMREG、SMAD1、MCL1、MPRIP、FIGNL1、RPAP1、STMN1、SPP1 等。6.PATHWAY富集分析结果显示,KEGG代谢通路分为6个分支,共注释38项条目,分支包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和有机系统等,其中差异蛋白占比前三的分支为人类疾病、新陈代谢和有机系统。代谢通路主要包括原发性免疫缺陷、金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联、系统性红斑狼疮、哮喘产生IgA的肠道免疫网络、免疫系统、萜类骨架的生物合成、自身免疫性甲状腺疾病、同种异体移植排斥、范可尼贫血途径、造血细胞谱系、非洲锥虫病、胆固醇代谢、类风湿关节炎、矿物质吸收、细胞色素P450对异生物的代谢、病毒性心肌炎、利什曼病、阿米巴病、癌症中的转录失调、扩张型心肌病、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、FcεRI信号通路、B细胞受体信号通路、磷脂酶D信号通路、NF-κB信号通路、酮体的合成与降解、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌、药物代谢-细胞色素P450等。7.亚细胞定位结果发现这些差异蛋白主要位于细胞核、细胞质或细胞外,其余则较平均散布于胞质内膜、线粒体、过氧化物酶体、内质网、胞质网丝以及细胞骨架上。结论:1.荔枝核总黄酮(TFL)可下调HSC-T6的MMP-2、ColⅠ和ColⅢ的表达水平,对HSC-T6的生长增殖具有抑制作用。2.本实验基于DDA/DIA模式并通过GO、KOG、PPI、PATHWAY以及亚细胞定位等生物信息学技术分析后发现C1QC、C1QB、C9、SELENOH、SELENOM、GPX3、APOE、CLU、ANGPTL4、NF1、HRG、PF4、ITIH4、ADH7、RAD51、BLM、FIGNL1、MDC1、SPC24、KNSTRN、CDCA8、HELZ2、HMGCS1、MVD、IDI1、CYP51A1、NSDHL、LIPG、PBK/TOPK、FAM83D、DLGAP5、UBE2T、UBE2C、UBE2S、UHRF1、MAP3K3、LRRK1、SMAD、、MCL、等差异蛋白与肝纤维化疾病具有密切相关性;PI3K/Akt通路、NF-κB信号通路、胆固醇代谢、补体和凝血级联、细胞色素P450可能是TFL抑制HSC-T6生长增殖并诱导HSC-T6死亡的主要信号转导途径。3.TFL可能通过调控多个蛋白和参与多种信号传导通路抑制ECM的形成和诱导HSC-T6死亡,发挥拮抗肝纤维化的生物学效应。
张嘉鑫[3](2021)在《基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究》文中研究表明背景:肝硬化(Hepatic cirrhosis,HC)为肝脏受各种损伤因素侵袭,出现以肝纤维化、假小叶为特点的疾病,由乙肝病毒、丙肝病毒、酒精等一种或多种病因引起。5年生存率为14-35%,已成为全球成人死亡率第14高的病因。目前的治疗主要集中在病因与并发症防治方面,肝硬化本身能否被逆转一直存在争议。国内外学者认为,肝硬化实现逆转必然涉及以下三方面环节:细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解,肝细胞再生及肝小叶结构重建。其中,ECM降解为重要前提。近年研究提示,弹性蛋白合成、降解及其交联阻碍了 ECM降解,进而影响逆转过程。弹性蛋白是由肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)分泌的,为ECM重要组分。其在正常肝脏中也存在,但含量极低,在肝硬化阶段,沉积迅速。目前,中药单体、复方研究多集中于抗纤维化领域,对早期肝硬化关注较少,需要更多基础研究及高质量的临床试验进一步证实中药疗效优势,并对其相关机制进行深入挖掘。中药复方具有多层次、多靶点的先天优势,但现有研究多聚焦于抑制HSCs活化、促进胶原降解或抗肝窦毛细血管化等方向,尚未对中医药潜在的调控弹性蛋白合成及降解的相关机制进行探索。目的:基于益肝消积方对弹性蛋白合成及降解的调控作用,探索在四氯化碳(CCl4)诱导的肝脏发生损伤形成早期肝硬化病变后,该复方干预早期肝硬化的效果及其可能的机制,以期为益肝消积方进一步成果转化提供理论支撑,同时亦为其它防治早期肝硬化药物的研发提供方向。方法:通过给予SPF级雄性Sprague Dawley大鼠(200±10g)1ml/kg腹腔内注射50%CCl4和橄榄油混合液,2次/周,共6周,构建早期肝硬化模型。7周始,予益肝消积方、阳性对照药(安络化纤丸),1ml/100g剂量灌胃。空白对照、模型对照组予等剂量蒸馏水灌胃,日1次,持续6周。用生化法检测ALT、AST评估肝功能;行组织病理学染色(HE染色、天狼猩红染色及Masson染色)评估早期肝硬化病变进展、检测肝脏胶原沉积;用弹性纤维染色评估肝脏的弹性蛋白沉积;免疫组织化学染色、免疫荧光染色观察肝组织中TGF-β1、CD68、CD80、CD163和α-SMA表达情况;用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)分析以及实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-βR-Ⅱ、Smad2/3、P-Smad2/3、Smad4、Smad7、Sp1、TNF-α、Ras、MEK1/2、ERK1/2、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1的蛋白水平及bFGF、弹性蛋白(Elastin)的mRNA水平变化,进而对益肝消积方干预早期肝硬化的作用及其相关机制进行初步探索。结果:1.模型制备:予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周。造模6周后,组织病理染色发现,模型组大鼠肝脏出现大量纤维增生,汇管区增宽,形成假小叶,说明模型制备成功。2.一般情况:益肝消积方治疗组及阳性对照安络化纤丸组大鼠毛色、精神状态、进食量等方面均优于模型组。体重上,治疗组大鼠体重均明显高于模型组(P<0.01);体重增长趋势上,益肝消积方组优于安络化纤丸组。3.肝功能:与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT、AST含量升高显着(P<0.01)。益肝消积方和阳性对照组(安络化纤丸)较模型组显着下降(P<0.05或P<0.01)。与安络化纤丸相比,益肝消积方在改善ALT方面疗效较优。4.肝组织病理学表现:从肝脏外观看,模型组大鼠颜色变暗,体积缩小,表面粗糙,边缘较钝,质地较硬韧,部分肝脏在剥离时与胸膜腔其他组织相粘连,难以剥离。益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝体积缩小不明显,表面粗糙不明显,质地较柔韧,未发现与胸腔其他组织粘连,较易剥离。此外,通过组织学染色(HE染色、Masson染色、天狼猩红染色)发现,与模型组大鼠相比,益肝消积方和安络化纤丸治疗后的大鼠肝脏炎性细胞浸润程度减轻,病变范围减小,汇管区及周围纤维增生程度减轻,假小叶数量明显减少,且胶原纤维等细胞外基质成分沉积减少(P<0.01)。对比安络化纤丸,益肝消积方抑制胶原沉积的效果较好。说明益肝消积方能够有效抑制炎细胞浸润,减少胶原纤维过度沉积,从而发挥干预早期肝硬化的作用。5.弹性纤维染色结果:为观测弹性纤维变化,我们对其进行了特殊染色。实验发现,在早期肝硬化阶段,模型组弹性纤维含量增多迅速,显着高于空白对照组(P<0.01)。益肝消积方、安络化纤丸治疗组与模型组相比,弹性纤维含量显着减少(P<0.01),且益肝消积方效果较明显。6.免疫组化、免疫荧光染色结果:与空白对照组相比,模型组TGF-β1、α-SMA、CD68、CD80、CD163阳性表达区域明显增多。与模型组相比,益肝消积方、安络化纤丸组阳性区域明显减少。7.qRT-PCR结果:模型组与空白对照组相比,ElastinmRNA表达量显着升高(P<0.01)。与模型组相比,益肝消积方治疗组ElastinmRNA表达量显着下降(P<0.01)。对比安络化纤丸,益肝消积方减少ElastinmRNA表达更显着;模型组bFGF mRNA较正常组升高显着(P<0.01)。对比模型组,益肝消积方治疗组bFGF mRNA表达量显着下降(P<0.01)。对比安络化纤丸,益肝消积方下调bFGF mRNA表达更显着。8.Western blot 结果:与空白对照组相比,模型组 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显升高(P<0.05 或 P<0.01),Smad7、TNF-α、MEK1/2 蛋白表达含量明显下降(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,益肝消积方治疗组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、CCL2、CCR2、TGF-β1、TGF-β RⅡ、P-Smad2/3、Smad4、Ras、Sp1、MMP-2、MMP-9、MMP-12、TIMP-1 蛋白表达含量明显降低(P<0.05 或 P<0.01),Smad7、TNF-α、MEK1/2蛋白表达含量明显上升(P<0.05或P<0.01)。结论:1.予50%CCl4/橄榄油混合液,腹腔注射,1ml/kg,2次/周,共6周,可成功制备早期肝硬化大鼠模型。予益肝消积方干预后,可改善早期肝硬化大鼠体重、肝功能;有效抑制早期肝硬化大鼠肝脏炎性细胞浸润,肝细胞变性、坏死,胶原纤维(Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ)、弹性纤维等ECM沉积,改善病变程度。2.益肝消积方可抑制α-SMA表达,下调CD68、CD80、CD163表达量,抑制CCL2-CCR2通路,进而具有抑制HSCs激活,抑制单核/巨噬细胞浸润,及向M2型巨噬细胞极化,阻止单核/巨噬细胞向损伤肝组织部位迁移,减少Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和Elastin含量,发挥干预早期肝硬化的作用。3.益肝消积方能通过 TGF-β1/Smads、TGF-β1/Ras/ERK 和 bFGF、TNF-α/MEK/ERK信号转导通路抑制胶原纤维、弹性纤维等ECM合成,发挥干预早期肝硬化的作用。4.益肝消积方可通过调节MMPs/TIMPs酶系,促进胶原纤维、弹性纤维等ECM降解,达到干预早期肝硬化的作用。
高雪[4](2021)在《机械压力激活星状细胞诱导NAFL纤维化的实验研究》文中认为目的:建立压力微环境细胞学模型,探讨NAFL窦内压增高对肝星状细胞活化及肝纤维化的影响。方法:1.实验分组:(1)对照组:压力为0 mmHg(control、transwell组)(2)实验组:压力分别为4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg2.建立压力微环境细胞学模型:裁剪transwell小室并置于6孔板中;于小室顶端放置称量瓶;称量瓶内加入适当质量的陶瓷研磨珠。3.分组培养LX-2细胞,时间分别为12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h,压力条件分别为4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg,倒置相差显微镜观察LX-2细胞形态;分组培养LX-2细胞,时间分别为48 h、72 h、96 h,压力条件分别为4mmHg、6mmHg、8 mmHg、10mmHg,LX-2细胞用FITC标记鬼笔环肽染色,激光共聚焦显微镜观察LX-2细胞骨架改变;生物型原子力显微镜分别检测48 h和72 h LX-2细胞杨氏模量。4.分组培养LX-2细胞,时间分别为24 h、48 h、72 h、96 h,压力分别为4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg,流式细胞仪检测72 h LX-2细胞增殖;划痕实验检测24 h和48 h LX-2细胞迁移;qPCR检测48 h、72 h和96 h LX-2细胞 Integrin αvβ3、ITGB3 mRNA 的表达。5.分组培养LX-2细胞,时间分别为48 h、72 h、96 h,压力条件分别为4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg,western-blotting检测LX-2 细胞α-SMA蛋白表达;qPCR 检测 ACTA2、C,OL1A1、C,OL3A1、COL4A1、TGFB1和HGF mRNA的表达。6.分组培养大鼠原代肝星状细胞,时间为24 h,压力条件分别为4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg,qPCR检测Acta2、Col1al mRNA 的表达。结果:1.机械压力对LX-2细胞形态和细胞骨架的影响:(1)当压力条件分别为4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg时,培养时间分别为36 h、48 h、72 h和96 h,LX-2细胞出现突起,似“绒毛状”,形态由多角形向梭形改变,伸展出细长的丝状伪足;(2)当压力条件为4 mmHg、6 mmHg时,培养时间为48 h和72 h,LX-2细胞F-actin表达增强;当压力条件为8mmHg、10 mmHg时,48h LX-2细胞F-actin表达减弱,72 h LX-2细胞F-actin表达增强;(3)当压力条件为4 mmHg、8 mmHg时,48 h LX-2细胞杨氏模量增加,72 h LX-2细胞杨氏模量降低。2.机械压力对LX-2细胞生长行为的影响:(1)机械压力促进 LX-2 细胞增殖(4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg,72 h);(2)当压力条件分别为4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg时,培养时间分别为24h和48 h,与control组相比,实验组LX-2细胞迁移无明显变化;(3)当压力条件分别为4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg时,培养时间分别为48 h、72 h和96 h,与control组相比,实验组LX-2细胞Integrin αvβ3 mRNA表达降低、ITGB3 mRNA表达无变化。3.机械压力对LX-2细胞和大鼠原代肝星状细胞活化及纤维化的影响:(1)机械压力促进LX-2细胞α-SMA蛋白的表达(8 mmHg、10 mmHg,36 h);(2)机械压力促进LX-2细胞COLIA1 mRNA的表达(6 mmHg,72 h);(3)机械压力抑制LX-2细胞TGFB1 mRNA的表达(4 mmHg、6 mmHg、8 mmHg、10 mmHg,48h、72 h 和 96h);(4)机械压力促进大鼠原代肝星状细胞Col1α1 mRNA的表达(4 mmHg,24 h)。结论:1.机械压力可能通过激活肝星状细胞促进α-SMA和Ⅰ型胶原表达,参与了NAFL纤维化的过程;2.NAFL阶段,TGF-β可能不是压力诱导肝纤维化的主要因素,具体机制仍需进一步探讨。
谢海深[5](2021)在《七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化》文中认为目的 肝炎-肝硬化-肝癌的连续发展过程为肝癌发展的一般规律,被称为肝癌发展的三部曲。我国作为最大的发展中国家是肝炎感染大国,也是肝癌患者高发国家,当前全世界对于肝癌的治疗方法包括手术切除肿瘤病灶、经B超引导的射频或微波消融术、放射治疗、化学药物治疗和肝脏活体器官移植等,但是治疗效果有限。肝硬化为肝癌发展的重要中间过程,早期干预阻断此过程可大大降低患者发展为肝癌的可能性。肝硬化的发展是一个漫长的连续过程,肝纤维化是肝硬化发展的早期可逆阶段。肝纤维化的主要特征为肝星状细胞激活转分化为肌成纤维细胞,分泌大量的包括胶原蛋白I、胶原蛋白III、α-SMA和纤维连接蛋白等在内的细胞外基质组分,不断沉积在肝小叶间的汇管区。七叶皂苷钠是从传统中药娑罗子中提取的主要成分,已知的功效包括抗炎、消肿、扩张血管和改善微循环等,前期实验证明七叶皂苷钠对原发性肝癌具有明显抑制作用,本研究主要探究七叶皂苷钠对肝纤维化发展的影响作用及机制。方法 本研究主要通过体外和体内实验验证七叶皂苷钠对于肝纤维化发展的影响作用。体内实验将雄性大鼠分为空白对照组、CCl4诱导的模型组和在CCl4诱导的基础上给予七叶皂苷钠处理的治疗组三组。对照组大鼠予以橄榄油腹腔注射处理,模型组和治疗组均通过腹腔注射四氯化碳液诱导实验大鼠肝脏进展为肝纤维化,此处理贯穿于整个8周实验过程。从实验的第3周开始,对治疗组给予适量七叶皂苷钠进行腹腔注射,对照组以及模型组给予腹腔注射等量的医用生理盐水。第8周末时开腹取大鼠肝脏组织,通过免疫组化、HE以及Masson染色检测对照组、模型组和治疗组三组大鼠肝脏纤维化发展程度以及组织中胶原蛋白的表达情况。在体外细胞试验中,通过MTT、克隆形成实验检测七叶皂苷钠处理的HSC-T6细胞的生长增殖活性,通过流式细胞学检测七叶皂苷钠处理的HSC-T6细胞凋亡程度,通过免疫蛋白印迹检测七叶皂苷钠对HSC-T6细胞内eIF4F复合物以及PI3K/AKT/mTOR通路中各蛋白表达影响情况。结果 CCl4诱导大鼠肝纤维化形成明显,HE、Masson及免疫组化染色结果显示,七叶皂苷钠处理使大鼠肝脏细胞外基质中的α-SMA,COL-I和COL-III含量较四氯化碳诱导肝纤维化的模型组明显下降。MTT检测结果显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞增殖活性显着降低;克隆形成实验显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞的细胞集落形成数明显减少;流式细胞学检测结果显示,七叶皂苷钠使HSC-T6细胞凋亡数量增加,以早期凋亡数量增加最为明显;免疫蛋白印迹表明,七叶皂苷钠可下调HSC-T6细胞中α-SMA、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ等胶原蛋白的表达。七叶皂苷钠处理的大鼠肝组织免疫组化染色和HSC-T6细胞免疫蛋白印迹结果均显示e IF4G,e IF4E蛋白的表达量降低。七叶皂苷钠可下调HSC-T6细胞中PI3K/AKT/mTOR/4EBP1信号通路中各蛋白质的表达水平,降低4EBP1磷酸化水平。结论 七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物的合成进而缓解大鼠肝纤维化的进展。
施梅姐[6](2020)在《疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床回顾性研究及其作用机制的网络药理学探索》文中指出目前,慢性乙型肝炎仍然是一个全球性的公共卫生问题,严重危害人民健康。肝纤维化是慢性乙型肝炎发展到肝硬化的必经中间环节,若不及时阻断,可进一步进展至肝硬化、门静脉高压及肝癌,甚至进展至终末期肝病危及生命。因此,阻断逆转肝纤维化、防止疾病进一步进展是慢性乙型肝炎的重要防治目标之一。但肝纤维化的治疗当前仍然是慢性乙型肝炎防治的难点问题。目前,现代医学研究的各类特异性的抗纤维化药物制剂绝大多数尚处于实验研究阶段。现代医学治疗慢性乙型肝炎肝纤维化主要是针对病因的治疗,即抗病毒治疗。恩替卡韦是国内外指南推荐的一线抗病毒治疗药物,具有强力抗病毒作用和低耐药的特点,但其存在HBe Ag转换率低的缺点,并且即使抗病毒治疗后仍有相当部分的病人存在肝纤维化进展。因此,如何阻止肝纤维化进展、提高HBe Ag转换率是当前乙肝肝纤维化治疗的难点问题。而大量的研究证实,中医药治疗肝纤维化具有良好的疗效而且无副作用,其疗效及优势已得到国内外学者的广泛认可。在过去的几十年中,诸多研究者针对中医药抗乙肝肝纤维化展开了大量的临床及实验研究。尽管临床上乙肝肝纤维化的辨证分型不统一,但是纵观近十年中医药防治肝纤维化的文献资料,疏肝健脾活血法越来越得到众医家、学者的认可。本人所在科室在既往的临床实践中亦发现疏肝健脾活血法联合抗病毒药治疗可明显改善乙肝肝纤维化患者的抗肝纤维化疗效、提高HBe Ag转换率,但缺乏客观的临床疗效评价及作用机制探讨。目的:本课题第一部分采用文献研究的方法,基于频数分析、复杂网络分析法及关联规则等数据挖掘的方法分析总结疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的用药配伍规律,以期为临床运用疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化提供用药参考。第二部分采用回顾性研究的方法观察疏肝健脾活血法对慢性乙型肝炎肝纤维化患者的病理肝纤维化分期、血清肝纤维化指标及肝脏硬度值等指标变化的影响,客观评价其临床疗效,为临床运用用提供客观依据。第三部分运用网络药理学的方法对前面研究总结的疏肝健脾活血法的五味核心药物进行研究,探讨疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的作用靶点、信号通路,以期为后续研究疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的实验研究提供客观的参考依据。方法:第一部分:基于数据挖掘的方法总结疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的用药规律以“中国知网”、“中国生物医学期刊引文数据库”、“重庆维普中文期刊数据库”、“万方医学网”为检索库,检索自建库至2020年9月的疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的现代文献,建立疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的现代文献研究数据库,进一步采用频数分析、复杂网络分析技术、关联规则分析等数据挖掘的方法分析总结疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的用药规律。第二部分:疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床研究采用回顾性研究的方法,纳入2010年1月至2020年9月在广东省中医院肝病科门诊及住院就诊的符合纳入排除标准的乙肝肝纤维化病例,分为治疗组与对照组进行回顾性观察,其中对照组服用恩替卡韦治疗,治疗组采用疏肝健脾活血法联合恩替卡韦治疗,收集疗程至少144周的患者的临床资料,比较疏肝健脾活血法联合恩替卡韦治疗与单用恩替卡韦治疗对乙肝肝纤维化患者的病理肝纤维化分期、肝脏硬度值、血清肝纤维化指标及HBe Ag转换率等指标的不同影响,客观评价疏肝健脾活血法联合恩替卡韦治疗乙肝肝纤维化的抗纤维化疗效与抗病毒疗效。第三部分:基于网络药理学探讨疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的作用机制通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)收集筛选疏肝健脾活血法核心药物的主要有效成分及靶点,通过检索Gene Cards、OMIM、Pharm Gkb三个数据库,收集整理乙肝肝纤维化相关的疾病靶点基因,然后运用Venn2.1在线工具绘制药物-疾病靶点的Venn图,获得中药-疾病交互靶点。然后利用STRING数据库及Cytoscape3.8.1软件绘制中药-疾病交互靶点的蛋白质相互作用(PPI)图以及筛选核心基因。最后利用DAVID数据库进行GO与KEGG通路富集分析,进一步分析探讨疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的作用关键靶点与信号通路。结果:第一部分:文献数据挖掘研究初步检索到疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的相关文献257篇,根据标题初筛合格的文献97篇,再根据纳入及排除标准对每一篇文献的内容进行人工筛选,剔除不合格文献后得到最终纳入合格文献48篇,涉及在乙肝肝纤维化治疗涉及处方48首、中药96味,总用药频次为537次,涉及中药种类17种。居前四位的药物种类分别是:补虚药>活血化瘀药>理气药>利水渗湿药,累计频率达88.3%。疏肝健脾活血法中使用频率最高的是补虚药,其次是活血化瘀药与理气药。其中补虚药有黄芪、白术、白芍、鳖甲、当归、党参等;活血化瘀药有丹参、赤芍、郁金、川芎、桃仁等;理气药有柴胡、枳壳、陈皮、香附等。进一步通过复杂网络分析后得到疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的核心药物包括柴胡、丹参、白芍、白术、黄芪、鳖甲、茯苓、赤芍、当归、枳壳、郁金等,居前五位的核心中药分别是:柴胡、丹参、白芍、白术、黄芪。其中理气药与补虚药、活血化瘀药最常见的配伍组合包括柴胡与白芍、丹参相伍,柴胡与白术、白芍相伍,柴胡与黄芪、丹参相伍等,柴胡与白芍是疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化最常见的药对。第二部分:临床研究初筛接受恩替卡韦抗病毒初始治疗的乙肝肝纤维化患者898例,二次筛选后共纳入385例接受恩替卡韦治疗144周的乙肝肝纤维化患者。其中完成治疗前后二次肝脏病理学评价患者共81例,完成治疗前后Fibro Scan检测的共83例,完成治疗前后血清肝纤维化指标检测的共114例。运用倾向性评分匹配两组患者的基线资料使两组具有可比性,结果纳入病理疗效分析44例,纳入血清肝纤维指标疗效分析102例,纳入肝脏硬度值疗效分析66例。在病理肝纤维化分期疗效评估方面,疏肝健脾活血法联合恩替卡韦治疗组的肝纤维化逆转率明显高于单用恩替卡韦组(95.5%vs 18.2%,P<0.001)。在肝纤维化进展方面,治疗组无一例发生肝纤维化进展,而对照组仍有50%的患者发生肝纤维化进展。在血清肝纤维化指标疗效评估方面,对照组的透明质酸(HA)水平较治疗前后无明显变化(40.9 vs 46.6,P=0.744),而治疗组较治疗前下降(55.2 vs 41.4,P=0.003),且治疗组治疗前后的差值明显高于对照组(P=0.02)。在Fibro Scan肝脏硬度值疗效评估方面,两组患者的肝脏硬度值均较治疗前下降(P均<0.05),但与对照组相比,治疗组LSM值较治疗前下降的差值更大,但两组患者治疗前后的变化差值无统计学差异(P=0.142)。为进一步观察疏肝健脾活血法对乙肝肝纤维化患者抗病毒疗效的影响,选取70例ALT<2ULN的HBe Ag阳性乙肝肝纤维化患者为研究对象,结果发现两组患者的HBe Ag血清学转换率均逐年上升,但治疗组的HBe Ag转换率增加趋势高于对照组,治疗组48周、96周、144周的HBe Ag转换率分别为17.1%、26.5%、28.6%,高于对照组的2.9%、12.9%、10.3%;其中两组在48周时的HBe Ag转换率存在统计学差异(P=0.046)。第三部分:网络药理学研究基于以上文献与临床研究共同发现的疏肝健脾活血法的五味核心药物为柴胡、丹参、白芍、白术、黄芪,收集这五味核心药物的有效化学成分及靶点,并进一步获取乙肝肝纤维化的疾病靶点。结果共发现疏肝健脾活血法核心药物与乙肝肝纤维化疾病的交互靶点基因共有205个。PPI蛋白质互作网络分析发现疏肝健脾活血法核心药物治疗乙肝肝纤维化的关键靶点在于AKT1、TP53、CDK1、CCNA2、CCNB1、TOP2A、BIRC5、VEGFA、EGFR、CASP3等核心基因。GO分析发现6个最相关的生物过程,包括DNA转录、促进RNA聚合酶II启动子转录、促进DNA转录、炎症反应、抑制凋亡过程与促进细胞增殖;7个最相关的细胞成分,涉及细胞浆、细胞外间隙、细胞核、细胞膜的组成部分、胞外体、细胞质、细胞核仁等;9个最相关的分子功能,包括同源二聚体蛋白质活化、序列特异性DNA结合之转录因子活化、序列特异性DNA结合、血红素结合、序列特异性DNA结合之RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区、DNA结合、染色质结合、锌离子结合、ATP结合。KEGG分析发现最相关的前10条通路分别是HIF-1、PI3K-Akt、Toll样受体、NF-kappa B、细胞凋亡、p53、NOD样受体、MAPK、VEGF、Fox O信号通路。结论:文献研究发现疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化存在一定的配伍规律,其中使用频率最高的是补虚药,其次是活血化瘀药与理气药。补虚药有黄芪、白术、白芍、鳖甲、当归、党参等;活血化瘀药有丹参、赤芍、郁金、川芎、桃仁等;理气药有柴胡、枳壳、陈皮、香附等。疏肝健脾活血法居前五位的核心中药分别是:柴胡、丹参、白芍、白术、黄芪。临床回顾性研究发现疏肝健脾活血法的中药治疗可协同提高恩替卡韦治疗乙肝肝纤维化的抗纤维化疗效与HBe Ag血清学转换率,但仍需下一步开展前瞻性、多中心、大样本的临床研究进一步。网络药理学研究发现疏肝健脾活血法的核心药物能通过多种细胞分子、多种生物过程、多条信号通路参与抗纤维化的过程,其主要作用于细胞浆、细胞外间隙、细胞核等多组分,通过调控HIF-1、PI3K-Akt、Toll样受体、NF-kappa B、细胞凋亡、p53、NOD样受体、MAPK、VEGF、Fox O等多条信号通路,参与同源二聚体蛋白质活化、序列特异性DNA结合、染色质结合、ATP结合等分子功能,调控DNA转录、促进RNA聚合酶II启动子转录、参与炎症反应、抑制凋亡过程与促进细胞增殖等生物过程发挥抗纤维化的治疗作用。但其具体的作用机制仍需下一步开展深入的实验研究进行验证。
蔡碧莲[7](2020)在《基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究》文中研究指明目的:观察荔枝核总黄酮(total flavone of Litchi chinensis Sonn,TFL)对体外HSC-T6细胞抗肝纤维化的作用机制的研究,为其进一步开发利用提供参考。方法:利用荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清干预HSC-T6 14d后,提取细胞的蛋白,利用蛋白DDA建库和定量DIA技术筛选出表达的差异蛋白,并且利用GO数据库对差异蛋白进行富集分析和注释、Pathway数据库进行信号转导通路分析、蛋白互作分析、亚细胞定位;利用TCMSP数据库筛选TFL的有效成分,在STRING10.5数据库构建TFL化学成分靶点蛋白互作网络,通过Gene Cards数据库获得TFL与肝纤维化相关靶点并对其进行生物信息学分析。结果:质谱数据检索鉴定出荔枝核总黄酮组与模型对照组共有6011个差异蛋白,上调蛋白有168个,下调蛋白有203个。通过GO分析差异蛋白主要参与了结合、催化活性、分子功能调节剂、转录调节活性等10种分子功能,细胞组件主要存在于细胞内、细胞器、细胞外、细胞膜上主要参与细胞过程、代谢过程、生物调节、调节生物过程等27种生物过程;通过KEGG分析,发现其主要涉及代谢途径、补体和凝血级联、肿瘤中的转录失调、NF-κB(核转录因子-κB)信号通路、PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)信号通路、HIF-1(缺氧诱导因子1)信号通路等30条信号通路;通过对差异蛋白亚细胞定位发现上调蛋白主要分布在细胞外、线粒体、过氧化物酶、内质网、细胞质溶胶-过氧化物酶中,下调蛋白主要分布在细胞核、细胞质溶胶、细胞质膜、细胞质溶胶-核中。从TFL中筛选得到2个活性成分:分别为表儿茶素和槲皮素,共有72个潜在作用靶点,经与肝纤维化相关发病机制靶点进行核查对比,得出TFL与肝纤维化相关发病机制的15个作用靶点基因,其中包括MMP2(基质金属蛋白酶)、CCL2(趋化因子CC亚家族)、TP53(肿瘤抑制蛋白)、HMOX1(血红素加氧酶1)、IFNG(干扰素γ基因)等。上述靶点主要分布在细胞间质、分泌颗粒、蛋白质细胞外基质中,且主要通过免疫反应、趋化因子生物合成过程的正调控、T细胞增殖的正调控、RNA聚合酶II启动子转录的正调控等分子功能来发挥对肝纤维化的治疗作用;上述靶点共涉及32条信号通路,其中基于目前研究显示与肝纤维化相关的信号通路有9条,分别为肿瘤信号通路、HIF-1信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、TNF(肿瘤坏死因子)信号通路、癌症中的Micro RNA、PI3K-Akt信号通路、NOD(核苷酸结合寡聚化结构域)样受体信号通路、NF-κB信号通路、MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路。TFL治疗肝纤维化的“成分-靶点-通路”网络中IL1B(重组人白介素1beta)、IL6(白细胞介素6)、IFNG等基因是TFL有效成分治疗肝纤维化网络中的核心靶点(节点度值≥15,介数中心性>0.8);肿瘤信号通路、TNF信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用信号通路是TFL有效成分治疗肝纤维化核心作用通路(节点度值≥5,介数中心性>0.001)。结论:蛋白DDA建库和定量DIA能快速筛选出差异蛋白,结合GO分析、KEGG分析能够以整体观阐释TFL体外抗肝纤维化的作用机制;HMOX1、NQO1,ACACA、CDK1蛋白发生异常表达时,能起到抗肝纤维化的作用。由此可推测TFL抗肝纤维化的作用机制可能与这4个差异蛋白的表达有关,这4个蛋白有可能是TFL抗肝纤维化的靶点蛋白。
邓舟[8](2020)在《益气解毒活血法治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究》文中研究指明研究目的本研究旨在通过临床观察益气解毒活血法基本方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化患者治疗前后HBV DNA、肝功能、肝纤维化血清学指标及多参数模型(APRI、FIB-4)、肝脾超声、肝脏硬度值及中医症候积分等各项指标的变化,客观评价益气解毒活血法基本方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床疗效和安全性,以期为临床研究防治该病提供新的治疗方法和安全有效的药物。研究方法将2018年2月至2019年9月就诊于湖北省中医院(花园山院区)肝病科,符合纳入标准的80例慢性乙型肝炎肝纤维化患者,采用随机数分组方法,随机分为治疗组和对照组,每组40例。其中对照组患者给与恩替卡韦分散片0.5mg/次,1次/d,口服,治疗组患者在对照组基础上加服益气解毒活血法基本方(太子参20g、白术15g、叶下珠15g、苦参10g、丹参15g、桃仁10g、茯苓15g、黄精15g、虎杖15g、白花蛇舌草20g、郁金15g、鳖甲15g、甘草6g)200ml/次,早晚各1次,疗程均为24周。观察并记录两组患者治疗前与治疗后血清HBV DNA、肝功能、肝纤维化血清学指标及多参数模型(APRI、FIB-4)、肝脾彩超、肝脏硬度值及中医症候积分的变化。将检查结果采用excel软件建立数据库,应用SPSS21.0软件进行数据的统计分析,以p<0.05表示差异有统计学意义,比较两组患者的临床疗效。结果1、患者入组一般情况:治疗组40例,对照组40例,两组患者人口学特征(性别、年龄)、生命体征、既往病史、治疗史、HBV DNA、肝功能、肝纤维化血清学指标及多参数模型(APRI、FIB-4)、肝脾超声、肝脏硬度值及中医症候积分等各项指标比较,无明显差异,具有可比性。2、两组患者治疗前与治疗后肝功能以及HBV DNA的变化:治疗24周后,治疗组患者肝功能炎性指标ALT(35.23±10.03 u/L)、AST(28.51±10.09 u/L)较治疗前 ALT(103.40±17.49 u/L)、AST(76.31±13.38 u/L)明显改善,GGT(40.03±6.98 u/L)、TBil(16.38±8.10 umol/L)、HBV DNA(2.39±1.33 log10IU/ml)较治疗前 GGT(52.94±12.06 u/L)、TBil(22.81±8.17 umol/L)、HBV DNA(5.23±3.63 log10IU/ml)明显下降,肝脏合成指标ALB(42.65±3.24 g/L)较治疗前ALB(39.64±3.31g/L)有所上升;对照组患者肝脏炎性指标ALT(51.11±20.74 u/L)、AST(35.09±10.89 u/L)较治疗前ALT(106.14±18.56 u/L)、AST(72.49±13.44 u/L)明显改善,GGT(47.51±5.43 u/L)、TBil(18.67±5.96 umol/L)、HBV DNA(3.29±0.61 log10IU/ml)较治疗前 GGT(51.77±10.41 u/L)、TBil(21.67±5.93 umol/L)、HBV DNA(5.36±3.34 1og10IU/ml)明显下降,肝脏合成指标ALB(42.29±2.30 g/L)较治疗前ALB(39.34±2.21 g/L)有所好转,差异有统计学意义(p<0.05);治疗后两组间比较,治疗组患者治疗后血清ALT(35.23±10.03 u/L)、AST(28.51±10.09 u/L)、GGT(40.03±6.98 u/L)、ALB(42.65±3.24 g/L)、TBil(16.38±8.10 umol/L)、HBV DNA(2.39±1.33 log10IU/ml)较对照组ALT(51.11±20.74 u/L)、AST(35.09±10.89 u/L)、GGT(47.51±5.43 u/L)、ALB(42.29±2.30 g/L)、TBil(18.67±5.96 umol/L)、HBV DNA(3.29±0.61 log10IU/ml)明显好转,差异有统计学意义(p<05);两组患者均无HBsAg转阴(p>0.05)。3、两组患者治疗前与治疗后肝纤维化血清学指标的变化:治疗24周后,治疗组患者肝纤四项 HA(75.63±33.01 ng/ml)、PⅢNP(37.11±19.8 ng/ml)、Ⅳ-C(37.29±17.31 ng/ml)、LN(31.50±24.5 ng/ml)较治疗前 HA(132.70±78.11 ng/ml)、PⅢNP(59.67±41.72 ng/ml)、Ⅳ-C(65.60±35.03 ng/ml)、LN(45.07±41.50 ng/ml)明显的下降;对照组患者肝纤四项 HA(78.11±34.74ng/ml)、PⅢNP(40.09±20.89 ng/ml)、Ⅳ-C(39.51±19.43 ng/ml)、LN(34.29±26.30 ng/ml)较治疗前 HA(133.14±79.56 ng/ml)、PⅢNP(59.49±42.44 ng/ml)、Ⅳ-C(66.77±36.41 ng/ml)、LN(45.34±42.21 ng/ml)明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05);治疗后两组间比较,治疗组患者治疗后的肝纤四项 HA(75.63±33.01 ng/ml)、PⅢNP(37.11±19.8 ng/ml)、Ⅳ-C(37.29±17.31 ng/ml)、LN(31.50±24.5 ng/ml)相对于对照组患者肝纤四项 HA(78.11±34.74 ng/ml)、PⅢNP(40.09±20.89 ng/ml)、Ⅳ-C(39.51±19.43 ng/ml)、LN(34.29±26.30 ng/ml)下降明显,差异有统计学意义(p<0.05)。4、两组患者治疗前与治疗后APRI、FIB-4的变化:治疗24周后,治疗组患者 APRI(0.6±0.38)、FIB-4(1.7±1.39)较治疗前 APRI(1.3±0.81)、FIB-4(2.2±1.48)明显下降;对照组患者 APRI(0.8±0.45)、FIB-4(2.0±1.44)较治疗前 APRI(1.3±0.93)、FIB-4(2.3±1.23)明显下降,差异有统计学意义(p<0.05);治疗后两组间比较,治疗组患者治疗后 APRI(0.6±0.38)、FIB-4(1.7±1.39)较对照组患者 APRI(0.8±0.45)、FIB-4(2.0±1.44)下降明显,差异有统计学意义(p<0.05)。5、两组患者治疗前与治疗后肝脏脾脏超声的变化:治疗24周后,治疗组患者门静脉主干内径(10.79±0.50mm)、脾静脉内径(5.8±0.9 mm)、脾脏厚度(38.21±4.32 mm)较治疗前门静脉主干内径(13.35±1.41 mm)、脾静脉内径(8.3±1.5 mm)、脾脏厚度(46.76±6.45 mm)明显缩小;对照组患者门静脉主干内径(11.04±0.85 mm)、脾静脉内径(7.2±1.1 mm)、脾脏厚度(39.47±4.72 mm)较治疗前门静脉主干内径(13.23±1.34 mm)、脾静脉内径(8.4±1.4 mm)、脾脏厚度(47.21±6.32 mm)明显缩小,差异具有统计学意义(p<0.05);治疗后两组间比较,治疗组患者治疗后门静脉主干内径(10.79±0.50 mm)、脾静脉内径(5.8±0.9 mm)、脾脏厚度(38.21±4.32 mm)较对照组患者门静脉主干内径(11.04±0.85 mm)、脾静脉内径(7.2±1.1 mm)、脾脏厚度(39.47±4.72 mm)改善更明显,差异具有统计学意义(p<0.05)。6、两组患者治疗前与治疗后肝脏硬度值(LSM)的变化:治疗24周后,治疗组患者肝脏硬度值(8.20±1.1OkPa)较治疗前(10.46±1.41 kPa)明显下降;对照组患者肝脏硬度值(9.1±1.31 kPa)较治疗前(10.42±1.34 kPa)明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05);治疗后两组间比较,治疗组患者肝脏硬度值(8.20±1.10 kPa)相对于对照组患者(9.1±1.31 kPa)下降明显,差异具有统计学意义(p<0.05)。7、中医症候量化积分比较:治疗24周后,两组患者在胁痛、脘腹胀痛、食欲不振、倦怠乏力、口干口苦、大便稀溏、面色晦暗、肝脾大症候量化积分较治疗前均明显下降,差异有统计学意义(p<0.05);治疗组患者治疗后中医症候量化积分较对照组患者治疗后明显下降,差异有显着性统计学意义(p<0.05);在肝掌、蜘蛛痣等其他中医症候方面,两组患者治疗前后无统计学显着意义(p>0.05)。8、中医证候总积分比较:治疗24周后,治疗组患者中医证候总积分(4.12±3.63)较治疗前(9.24±6.56)明显下降;对照组患者中医证候总积分(6.04±3.95)较治疗前(9.29±7.12)明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05);治疗后两组间比较,治疗组患者的中医证候总积分(4.12±3.63)明显低于对照组的中医症候总积分(6.04±3.95),差异具有统计学意义(p<0.05)。9、两组患者的临床综合疗效比较:治疗24周后,对照组患者的临床综合疗效为72.5%,治疗组患者临床综合疗效为87.5%;两组患者的临床综合疗效比较,治疗组患者的临床综合疗效优于对照组(p<0.05)。10、安全性指标:患者耐受性良好,未出现不良反应,治疗前后血、尿、粪三大常规、肾功能及心电图等均未出现有临床意义的变化。结论益气解毒活血法能明显改善慢性乙型肝炎肝纤维化患者的临床症状,降低患者的中医症候积分,改善患者的肝功能、肝纤维化血清学指标、APRI、FIB-4及肝脏硬度值,缩小门静脉主干内径、脾静脉内径及脾脏厚度,防治肝纤维化的进一步发生发展。益气解毒活血法是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化安全、有效的治法,益气解毒活血法基本方是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的有效方药。
许杰[9](2020)在《基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制》文中认为目的:1.从中医学“痰瘀”的角度,评估抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效及相关数据,为抗纤软肝颗粒抗肝纤维化提供最新的循证医学证据。2.基于网络药理学运用网络数据挖掘技术筛选抗纤软肝颗粒治疗肝纤维化活性成分,并对成分作用潜在靶点与机制进行整合与分析,探究抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的药理学机制,为抗纤软肝颗粒抗肝纤维化提供科学依据,以及为后续实验研究提供一定基础。3.通过细胞实验与动物实验,基于肝窦毛细血管化,探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的作用机制。方法:1.采用临床回顾性对照研究的方法,从“痰瘀”的角度,研究抗纤软肝颗粒对痰瘀互结型肝纤维化患者临床疗效。将60例慢性乙型肝炎(CHB)肝纤维化患者,分为2组:治疗组患者利用抗纤软肝颗粒联合恩替卡韦(entecavir,ETV)治疗,对照组仅予ETV抗病毒治疗。治疗6个月,比较治疗前后中医证候积分、血清部分肝功能指标、血清肝纤维化及肝脏弹性等指标变化情况。2.采用网络药理学的研究方法,借助Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine(BATMAN-TCM)结合DisGeNET,Genecard,HPO,OMIM疾病靶点数据库,通过构建抗纤软肝颗粒活性成分作用靶点网络与肝纤维化疾病相关靶点网络相互映射来挖掘抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用靶点,利用STRING进行生物过程和通路富集分析,探究抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的通路研究。3.分别采用细胞实验与动物实验的方法:(1)细胞实验中,采取二次重复给药的方式,通过Wistar雄性大鼠制备和提取抗纤软肝颗粒和对照组含药血清,分别处理原代肝窦内皮细胞模型。采用Western-blotting方法检测肝窦内皮标志物分化抗原簇31(CD31)和血管性血友病因子(vWF)的蛋白表达水平,分析抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞分子水平的影响;采用免疫组织化学的方法检测细胞中CD31、vWF细胞因子表达水平;通过扫描电镜检测肝窦内皮细胞窗孔的变化。(2)动物实验中,通过CCl4--橄榄油混合溶液皮下注射与低蛋白高脂饲料喂养Wistar雄性大鼠诱导肝纤维化动物模型,运用拆方研究的方法,以索拉非尼作为对照药物,研究抗纤软肝颗粒(母方,MF)、母方去鳖甲方(QJ)和鳖甲(BJ)对肝纤维化大鼠一般情况、血清肝功能、肝组织和血清MMP13和TIMP-1分子、肝组织病理学、肝组织肝窦毛细血管化、肝组织肝窦毛细血管化分子水平的影响。另外,对肝组织中NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP分子进行测量,观察抗纤软肝颗粒组及其拆方各组对肝组织细胞膜脂质过氧化和酶促防御系统的影响的影响,进而观察其对肝窦毛细血管化的影响。采用生化检测大鼠血清部分肝脏功能ALT、AST、ALB、IgG水平;采用qRT-PCR方法检测大鼠肝组织中MMP-13、TIMP-1和VEGF的mRNA表达水平;采用Western-blotting方法检测肝组织中CD31、vWF、CollagenⅠ和CollagenⅣ的蛋白表达水平;分别采用H&E染色和天狼星红染色检测肝大鼠肝组织病理变化;通过扫描电镜检测大鼠肝组织肝窦内皮细胞窗孔及基底膜的变化;用ELISA法检测大鼠血清中MMP-13、TIMP-1的表达水平;采用生化检测方法检测大鼠肝组织NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP指标。结果:1.临床研究结果:抗纤软肝颗粒对慢性乙型肝炎(CHB)肝纤维化痰瘀互结型患者临床研究共收集病例60例,其中男29例,女31例,年龄18-65岁,平均52.5岁,治疗组32例,对照组28例。(1)两组病例在性别、年龄、肝纤维化程度、治疗前主要症状和舌脉积分分布等方面行x2检验,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者临床症状总疗效的影响,结果显示:与对照组相比,治疗组总有效率(84.375%vs60.7 1%)、显效率(53.125%vs28.57%),差异具有显着统计学意义(P<0.05)。(3)抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者症候积分的影响及单项症状总有效率比较,结果显示:治疗前两组比较,治疗组与对照组的中医证候积分(23.40±4.14vs22.80±3.85,t=0.5786,P>0.05);治疗后两组比较,治疗组与对照组的中医证候积分(8.75±3.28vs15.84±4.24,t=7.2916,P<0.01)。两组治疗前后组内比较,治疗后治疗组与对照组中医证候积分均较治疗前下降,差异有显着统计学意义(t=15.6901,P<0.01)。两组对肝纤维化单项症状积分总有效率影响,与对照组比较,治疗组各项单项症状总有效率均显着增高,差异有显着统计学意义(t=11.406,P<0.01)。与对照组相比,抗纤软肝颗粒联合ETV治疗组能显着减轻患者临床症候:右胁隐痛、腹胀、乏力、纳差、便溏、舌暗红/淡暗、苔白腻、脉滑涩等。(4)抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者部分肝功能指标的影响,结果显示:对照组与治疗组在治疗前后进行组内比较,两组ALT、AST、TBIL、GGT各项指标治疗后均较治疗前下降明显,差异有显着统计学意义(P<0.01)。另外,治疗后两组间比较,治疗组较对照组指标下降幅度更为明显,差异有显着统计学意义(P<0.05)。(5)抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者肝纤维化指标的影响,结果显示:两组治疗前后进行组内比较,两组HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN指标治疗后均较治疗前下降,差异有显着统计学意义(P<0.01)。治疗后两组组间比较,治疗组较对照组指标下降幅度更为明显,差异有显着统计学意义(P<0.01)。(6)抗纤软肝颗粒对CHB肝纤维化痰瘀互结型患者肝脏弹性的影响,结果显示:两组治疗前后进行组内比较,可见对照组治疗前后指标比较差异无统计学意义(P>0.05),而治疗组在治疗前后比较,肝脏硬度指标明显下降,差异有显着统计学意义(P<0.01)。另外,两组治疗后组间比较,治疗组较对照组明显降低肝脏硬度指标,差异有显着统计学意义(P<0.01)。2.网络药理学分析结果:在Batman-TCM中输入抗纤软肝颗粒的7种药物,分别搜索到鳖甲1个,丹参39个,地骷髅2个,莪术6个,海藻1个,牡蛎5个,生山楂30个化合物信息,共计84个。通过DisGeNET,Genecard,OMIM,HPO检索并筛选821个肝纤维化疾病相关的靶点,整合筛选出抗纤软肝颗粒成分和肝纤维化交集关键靶点。利用Cytoscape3.7.1软件构建成分-靶点-疾病网络,以大于平均自由度为筛选条件筛选出核心网络,获得95个抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的相关靶点。通过STRING的GO功能和途径/通路富集分析得到2203条生物过程,181个分子功能和包括MAPK、JAK-STAT、PI3K-AKT、Toll受体等在内的162条KEGG通路,这些通路为抗纤软肝颗粒在临床中的使用提供更为有力的、可靠的药理学证据。3.实验研究结果:实验一:基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的细胞实验研究,结果显示:(1)抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞中形态的影响:肝窦内皮细胞经经免疫荧光单标、荧光显微镜观察鉴定。倒置相差显微镜下观察,与对照血清组(Control组)比较,抗纤软肝颗粒含药血清组(MF组)肝窦内皮细胞形态学无明显变化。(2)抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞窗孔结构的影响:对照组肝窦内皮细胞窗孔狭小,窗孔结构将近闭塞,数量较少,而抗纤软肝方组可见肝窦内皮细胞窗孔结构清晰,窗孔增多增大,明显可见。(3)抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞CD31和vWF细胞因子的影响:抗纤软肝颗粒组原代肝窦内皮细胞CD31、vWF细胞因子的表达水平较对照组明显降低,差异有显着统计学意义(CD31:0.0688±0.0150vs0.1151±0.0114,t=4.2565,P<0.05;vWF:0.0920±0.0089vs0.1319±0.0135,t=4.2740,P<0.05)。(4)抗纤软肝颗粒对肝窦内皮细胞CD31、vWF蛋白表达的影响:与对照组相比,抗纤软肝颗粒组原代肝窦内皮细胞CD31、vWF的蛋白表达水平明显降低,差异有显着统计学意义(CD31:0.3337±0.0290vs0.4480±0.0128,t=6.2454,P<0.01;vWF:0.5603±0.0472vs0.7093±0.0448,t=3.9658,P<0.05)。实验二:基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的动物实验研究,结果显示:(1)抗纤软肝颗粒对大鼠一般情况的影响:造模组体重增长受到抑制,其它治疗组大鼠体重均有增加。与模型组比较,抗纤软肝颗粒母方组大鼠体重明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。母方组肝纤维化死亡率和腹水发生率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。肝脏指数和脾脏指数各组比较无明显统计学差异(P>0.05)。(2)抗纤软肝颗粒对大鼠肝功能的影响:经抗纤软肝颗粒组及其拆方各组治疗后血清ALT、AST、IgG水平显着下降,而血清ALB的水平显着上升,差异有显着统计学意义(P<0.05)。(3)抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织及血清MMP13、TIMP-1分子的影响:分别用qRT-PCR和ELISA法测定后显示,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可降低肝组织TIMP-1的mRNA表达水平和血清TIMP-1分子水平,而升高肝组织MMP13的mRNA表达水平和血清MMP13的分子水平,差异有显着统计学意义(P<0.01)。与Sor组比较,母方组可明显调节肝组织和血清MMP13、TIMP-1的表达水平,差异有显着统计学意义(P<0.05)。(4)抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织病理学的影响:H&E染色中,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可明显改善大鼠肝组织病理变化、肝细胞变性坏死程度、抑制肝组织内结缔组织增生,尤其是母方组。与Sor组相比,母方组(MF组)肝纤维化改善程度更为明显。在天狼星红染色中,与模型组比较,抗纤软肝颗粒组及其拆方各组纤维组织成分含量明显减少,母方组纤维组织含量降低最为明显。(5)抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织肝窦毛细血管化的影响:与模型组相比,抗纤软肝颗粒及其拆方各组肝组织,尤其是抗纤软肝颗粒组可见肝细胞索和肝窦结构较清晰,肝窦沟可显现,肝窦扭曲、狭窄程度明显减轻,甚至消失,基底膜较薄或不连续,有的肝窦结构接近正常,肝窦壁内皮细胞窗孔明显可见,与Sor组相比,母方组大鼠肝组织可见肝窦扭曲、狭窄程度改善最为显着。(6)抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织肝窦毛细血管化分子水平的影响:抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低VEGF的mRNA表达水平,与Sor组比较,抗纤软肝颗粒组差异有统计学意义。抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低CD31、vWF、CollagenI、CollagenIV的蛋白水平,尤其是抗纤软肝颗粒组。与Sor组比较,抗纤软肝颗粒对于降低CD31、vWF、CollagenI、CollagenIV的蛋白水平效果更为显着,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)抗纤软肝颗粒对大鼠肝组织中NO、NOS、MDA、T-SOD和HYP分子的影响:抗纤软肝颗粒组及其拆方各组可显着降低MDA、NO、NOS和HYP表达水平,而升高T-SOD表达水平,差异具有统计学意义。与Sor组比较,母方组可明显调节MDA、T-SOD、NO、NOS和HYP的表达水平,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.对于治疗CHB肝纤维化痰瘀互结证,抗纤软肝颗粒联合ETV与单用ETV治疗比较,两组均显示一定疗效,均可改善患者临床证候、肝功能和肝纤维化指标。对单用ETV对照组比较,抗纤软肝颗粒联合ETV治疗组对于改善肝纤维化患者临床证候,部分肝功能和肝纤维化指标有明显优势,尤其在改善肝脏硬度方面。抗纤软肝颗粒在肝纤维化“痰瘀互结”证的治疗中起到明显软坚消痰、活血化瘀的抗肝纤维化作用。2.通过网络药理学预测分析发现抗纤软肝颗粒作用肝纤维化的相关机制可能跟MAPK、PI3K-AKT、JAK-STAT、Toll样受体等信号通路密切相关,抗纤软肝颗粒具有抗肝纤维化的药理学依据。3.细胞实验与动物实验研究结果表明,抗纤软肝颗粒对体外原代肝窦内皮细胞和体内大鼠肝纤维化组织肝窦毛细血管化有积极的治疗作用。同时,动物实验中发现,中药复方抗纤软肝颗粒、去鳖甲方与鳖甲均具有明显的抗肝纤维化作用,尤其是母方(抗纤软肝颗粒)疗效最佳。抗纤软肝颗粒对肝纤维化的作用机制,可能是通过抑制肝窦毛细血管化而防治肝纤维化。
余蕾[10](2020)在《肝苏颗粒抑制肝星状细胞的活化作用及机制研究》文中认为目的:采用TGF-β1活化肝星状细胞,探讨肝苏颗粒主要有效物质对其抑制作用和作用机制,从而初步揭示肝苏颗粒抗肝纤维化的可能机理,为其进一步开发和应用提供依据。方法:1.文献研究查阅近年来肝苏颗粒及赶黄草有关文献报道,包括肝苏颗粒来源、临床应用、实验研究报道等进行文献数据分析。2.实验研究建立TGF-β1诱导的人肝星状细胞LX-2活化模型,MTT法筛选肝苏颗粒主要有效物质赶黄草总黄酮的作用剂量,设定高、中、低三个剂量,采用酶联免疫吸附法检测不同剂量下细胞培养液中I型胶原(Col I)和纤连蛋白(FN)的含量,划痕实验检测细胞迁移率,胶原收缩实验检测胶原收缩情况,流式细胞技术检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白m RNA的表达,western Blot法检测凋亡相关蛋白及TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的表达情况;并观察在给予TGF-β1/Smads信号通路抑制剂LY2109761后,赶黄草总黄酮对活化LX-2细胞胶原收缩和TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达的影响。结果:1.肝苏颗粒的文献研究结果通过对关于肝苏颗粒的文献进行梳理、研究后发现,肝苏颗粒为现在常用的治疗肝病的中药制剂之一,主要功效为降酶、保肝、退黄,其化学成分主要为黄酮类和酚酸类化合物。实验研究和临床应用文献均表明,肝苏颗粒对肝纤维化具有治疗作用;药学和药理研究可证明,赶黄草总黄酮是当前公认的赶黄草保肝、抗脂肪肝的主要药效物质,也是其治疗肝纤维化的重要有效物质。2.LX-2活化模型的建立和赶黄草总黄酮药效浓度确定TGF-β1浓度为2、4、6、8、10、12、14、16μg/L均可促进LX-2细胞增殖(P<0.01),6μg/L时的增殖活性和细胞培养液中α-SMA含量最高,当低于或超过该剂量时作用均减弱,提示6μg/L的TGF-β1是活化LX-2的最佳浓度,故以之为LX-2细胞活化浓度。赶黄草总黄酮药物浓度的筛选结果显示,赶黄草总黄酮浓,度为13mg/L时,细胞存活率大于80%,而浓度大于17mg/L时,药物呈现出明显的细胞毒性,因此选用5、9、13mg/L三个剂量进行后续实验。3.赶黄草总黄酮对活化的LX-2一般状态和细胞凋亡的影响MTT法结果显示,赶黄草总黄酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2细胞的增殖,且药物浓度越高抑制作用越明显,在13mg/时有显着抑制作用(P<0.01)。划痕实验显示赶黄草总黄酮可抑制TGF-β1活化后的LX-2细胞的迁移,在9mg/L时抑制作用显着(P<0.01);胶原收缩实验显示,TGF-β1组胶原收缩明显增加,而赶黄草总黄酮作用后的各组与单纯TGF-β1组相比较,胶原的收缩程度降低,作用效果呈剂量依赖。细胞液基质检测显示,赶黄草总黄酮可明显抑制活化后LX-2细胞液中FN和ColⅠ的升高(P<0.01);流式细胞仪检测显示TGF-β1对细胞凋亡无明显影响,而赶黄草总黄酮可促进活化后的LX-2细胞凋亡,作用效果呈剂量依赖,在赶黄草总黄酮作用浓度达到9mg/L时有统计学意义(P<0.01);western blot结果显示,TGF-β1活化的LX-2细胞中Bcl-2表达增加而Bax表达降低,但与未活化组比较无显着性差异;赶黄草总黄酮各组作用的LX-2细胞Bcl-2的表达显着降低而Bax的表达则明显增加(P<0.05)。4.赶黄草总黄酮对活化肝星状细胞TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白的影响RT-PCR实验显示,赶黄草总黄酮可显着抑制LX-2细胞中α-SMA m RNA的表达(P<0.01)。另外,赶黄草总黄酮作用后,TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白Smad2、Smad3 m RNA表达均显着减少(P<0.01);而Smad7的表达稍有增加,在药物浓度达到13mg/L时,差别具有统计学意义(P<0.05)。同样,western blot结果显示,赶黄草总黄酮作用后,Smad3、p-Smad2和p-Smad3的表达均不同程度减少,而Smad7的表达稍增加,且在9mg/L时具有统计学意义(P<0.01)。5.赶黄草总黄酮对活化肝星状细胞TGF-β1/Smads信号通路抑制后的影响采用特异性TGF-β1/Smads信号通路抑制剂LY2109761作用于LX-2后,胶原收缩结果显示,单纯用赶黄草总黄酮和单纯用LY2109761均可抑制胶原收缩(P<0.05),而在使用LY2109761预处理后再给予赶黄草总黄酮,抑制效果大于单纯给药(P<0.01);western blot实验结果显示,单纯使用赶黄草总黄酮和LY2109761均可抑制α-SMA、p-Smad2和p-Smad3的表达(P<0.05),而LY2109761预处理后再给予赶黄草总黄酮,抑制效果大于单纯给药(P<0.01)。结论:1.肝苏颗粒具有抗肝纤维化作用,赶黄草总黄酮是其重要的有效物质。2.赶黄草总黄酮对TGF-β1活化的肝星状细胞LX-2具有抑制作用,可抑制增殖和降低基质分泌,机制与诱导凋亡和抑制TGF-β1/Smads信号通路有关。
二、肝纤维化大鼠肝星状细胞和肝细胞胶原表达特征的实验研究(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝纤维化大鼠肝星状细胞和肝细胞胶原表达特征的实验研究(论文提纲范文)
(1)柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
前言 |
第一节 临床资料 |
第二节 分组与治疗 |
第三节 结果分析 |
第四节 讨论与小结 |
第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
前言 |
第一节 资料与方法 |
第二节 结果 |
第三节 讨论与小结 |
第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
前言 |
第一节 材料与研究方法 |
第二节 指标检测 |
第三节 结果 |
第四节 讨论与小结 |
结语 |
创新点 |
不足与展望 |
参考文献 |
致谢 |
在学期间主要研究成果 |
(2)荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
引言 |
1 材料 |
1.1 细胞系 |
1.2 实验动物 |
1.3 主要试剂与耗材 |
1.4 主要仪器 |
2 方法 |
2.1 细胞培养及传代 |
2.2 检测TFL药物对HSC-T6增殖的影响 |
2.3 透射电子显微镜观察HSC-T6的超微结构 |
2.4 ELISA检测MMP-2、ColⅠ、ColⅢ的含量变化 |
2.5 肝纤维化动物造模分组及含药血清的制备 |
2.6 检测含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
2.7 含药血清干预后蛋白质的收集与提取 |
2.8 DDA检测 |
2.9 DIA检测 |
2.10 主要数据库和数据指标 |
2.10.1 NR数据库和UniProt蛋白数据库 |
2.10.2 STRING蛋白互作数据库 |
2.10.3 GO数据库 |
2.10.4 KOG数据库 |
2.10.5 KEGG数据库 |
2.11 统计学分析 |
3 结果 |
3.1 TFL药物对HSC-T6生长抑制率的影响 |
3.2 TFL药物对HSC-T6超微结构的影响 |
3.3 TFL药物对HSC-T6的MMP-2、ColⅠ、ColⅢ含量的影响 |
3.4 肝纤维化动物造模结果 |
3.5 不同浓度的含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
3.6 肽段与蛋白的定量质控分析 |
3.7 DDA/DIA检测结果 |
3.8 GO富集分析 |
3.9 KOG注释分析 |
3.10 PPI分析 |
3.11 PATHWAY富集分析 |
3.12 亚细胞定位分析 |
4 讨论 |
4.1 理论基础 |
4.1.1 肝纤维化与肝星状细胞的理论基础 |
4.1.2 差异蛋白质组学的理论基础 |
4.1.3 中医药对肝纤维化认识的理论基础 |
4.1.4 荔枝核总黄酮(TFL)治疗肝纤维化的理论基础 |
4.2 TFL对HSC-T6生长增殖的影响 |
4.3 TFL对HSC-T6的ECM形成相关因子的影响 |
4.3.1 基质金属蛋白酶2(MMP-2) |
4.3.2 Ⅰ型胶原(ColⅠ) |
4.3.3 Ⅲ型胶原(ColⅢ) |
4.4 TFL对HSC-T6部分差异蛋白功能的讨论 |
4.4.1 上调蛋白 |
4.4.2 下调蛋白 |
4.5 TFL对HSC-T6差异蛋白部分信号通路的分析 |
4.5.1 PI3K/Akt通路 |
4.5.2 NF-κB信号通路 |
4.5.3 胆固醇代谢与合成 |
4.5.4 补体和凝血级联 |
4.5.5 细胞色素P450 |
结论 |
参考文献 |
缩略词表 |
综述 荔枝核总黄酮防治肝纤维化相关细胞因子及信号通路的进展 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
(3)基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一部分 文献综述 |
综述一 中医药防治肝硬化的研究现状 |
1 肝硬化病名渊源 |
2 中医对肝硬化病因病机的认识 |
3 中医治疗肝硬化思路 |
4 导师论治肝硬化的经验 |
5 中医药防治肝硬化的机制探讨 |
6 小结 |
参考文献 |
综述二 弹性蛋白及其调控因子在早期肝硬化中的作用 |
1 流行病学 |
2 肝硬化现代研究进展 |
3 弹性蛋白在肝硬化发生中的作用 |
4 调控弹性蛋白合成的细胞因子 |
5 调控弹性蛋白降解的细胞因子 |
6 小结 |
参考文献 |
前言 |
第二部分 实验研究 |
研究一 益肝消积方对早期肝硬化的干预作用 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
小结 |
研究二 益肝消积方调控弹性蛋白合成干预早期肝硬化的机制研究 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
小结 |
研究三 益肝消积方调控弹性蛋白降解干预早期肝硬化的机制研究 |
材料与方法 |
实验结果 |
讨论 |
小结 |
结语 |
参考文献 |
致谢 |
在学期间主要研究成果 |
个人简历 |
(4)机械压力激活星状细胞诱导NAFL纤维化的实验研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstrat |
前言 |
第一章 压力微环境细胞学模型的建立 |
第一节 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
第二节 结果 |
2.1 机械压力对肿瘤细胞形态的影响 |
2.2 机械压力对LX-2细胞形态的影响 |
2.3 机械压力对LX-2细胞骨架的影响 |
2.4 机械压力对LX-2杨氏模量的影响 |
第三节 讨论与小结 |
3.1 讨论 |
3.2 小结 |
第二章 机械压力对肝星状细胞生长行为的影响 |
第一节 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2. 方法 |
第二节 结果 |
2.1 机械压力对 LX-2 细胞增殖的影响 |
2.2 机械压力对LX-2细胞迁移的影响 |
2.3 机械压力对LX-2细胞粘附的影响 |
第三节 讨论与小结 |
3.1 讨论 |
3.2 小结 |
第三章 机械压力对肝星状细胞活化及纤维化的影响 |
第一节 材料与方法 |
1.1. 材料 |
1.2. 方法 |
第二节 实验结果 |
2.1 原代大鼠肝星状细胞的鉴定 |
2.2 机械压力对肝星状细胞α-SMA 表达的影响 |
2.3 机械压力对肝星状细胞产生胶原的影响 |
2.4 机械压力对 LX-2 细胞 TGFB1 和 HGF 基因表达的影响 |
第三节 讨论与小结 |
3.1 讨论 |
3.2 小结 |
全文总结 |
1. 讨论 |
2. 结论 |
3. 存在的问题分析 |
4. 展望 |
参考文献 |
英文缩略词表 |
在学期间研究成果 |
致谢 |
(5)七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化(论文提纲范文)
缩略词表(Abbreviation) |
中文摘要 |
英文摘要 |
1.引言 |
2.材料与方法 |
3.结果 |
4.讨论 |
5.结论 |
6.参考文献 |
附录 |
致谢 |
综述 肝纤维化的影响因素及肝星状细胞的激活 |
参考文献 |
(6)疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床回顾性研究及其作用机制的网络药理学探索(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 文献研究 |
第一节 慢性乙型肝炎肝纤维化的西医研究进展 |
一、现代医学对乙肝肝纤维化发病机制的认识 |
二、乙肝肝纤维化相关的信号通路研究现状 |
三、乙肝肝纤维化的现代诊断技术 |
四、乙肝肝纤维化的西医治疗现状 |
五、展望与体会 |
第二节 慢性乙型肝炎肝纤维化的中医研究进展 |
一、慢性乙型肝炎肝纤维化的病因病机研究 |
二、慢性乙型肝炎肝纤维化的中医辨证分型 |
三、慢性乙型肝炎肝纤维化的中医药治疗 |
四、展望 |
第三节 疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的理论依据与临床应用概况 |
一、疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的理论依据 |
二、疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床应用概况 |
第四节 数据挖掘技术在中医药研究领域的运用现状 |
一、频数分析技术 |
二、关联规则挖掘技术 |
三、聚类分析技术 |
四、复杂网络分析技术 |
五、贝叶斯网络 |
六、因子分析技术 |
第五节 网络药理学在中医药研究领域运用的研究进展 |
一、网络药理学的研究方法 |
二、网络药理学在中医药领域的运用 |
三、不足与展望 |
第二章 疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的用药规律探讨 |
一、资料与方法 |
(一)资料来源 |
(二)文献纳入标准 |
(三)文献排除标准 |
(四)文献检索策略 |
(五)资料提取 |
(六)数据预处理 |
(七)统计方法 |
二、结果 |
(一)一般情况 |
(二)单味中药选用频数及频数分布 |
(二)药物种类频数及频数分布 |
(三)基于复杂网络技术分析疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的核心药物 |
(四)基于关联规则技术分析疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的常用药物配伍规律 |
三、讨论 |
第三章 疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床研究 |
一、研究目的 |
二、研究内容 |
三、研究方法 |
四、研究方案 |
五、研究结果 |
(一)一般情况 |
(二)疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化患者的抗纤维化疗效分析 |
(三)疏肝健脾活血法对乙肝肝纤维化患者抗病毒疗效的影响 |
(四) 安全性分析 |
六、讨论 |
第四章 基于网络药理学探讨疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的作用机制 |
一、研究概要 |
二、材料与方法 |
三、结果 |
(一)疏肝健脾活血法核心药物的潜在有效成分及相关靶点 |
(二) “中药-疾病”交互靶点的筛选 |
(三) “中药-疾病”交互靶点PPI网络的构建及核心基因的筛选 |
(四) “中药-疾病”交互靶点的GO和KEGG富集分析 |
四、讨论 |
结语 |
一、主要结论 |
二、创新点 |
三、不足之处 |
四、展望 |
参考文献 |
附录 |
在校期间发表论文情况 |
致谢 |
统计学审核证明 |
(7)基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
引言 |
1 实验材料 |
1.1 实验对象 |
1.2 主要试剂 |
1.3 主要仪器 |
1.4 主要试剂配制 |
2 实验方法 |
2.1 大鼠肝纤维化模型的建立与鉴定 |
2.1.1 大鼠肝纤维化模型的建立 |
2.1.2 大鼠肝纤维化模型的鉴定 |
2.2 实验分组及用药 |
2.3 HSC-T6细胞的培养 |
2.3.1 准备工作 |
2.3.2 HSC-T6细胞的传代 |
2.3.3 HSC-T6细胞的换液 |
2.3.4 HSC-T6细胞的冻存 |
2.3.5 HSC-T6细胞的复苏 |
2.4 细胞计数方法 |
2.5 MTT法测定荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清对HSC最大无毒浓度(TC0) |
2.6 各组药物和含药血清对肝星形细胞的干预 |
2.7 肝星形细胞蛋白的提取 |
2.8 肝星形细胞蛋白提取质控 |
2.9 肝星形细胞蛋白酶解 |
2.10 DDA建库和DIA定量检测(Nano-LC-MS/MS) |
2.11 信息分析流程 |
2.12 TFL有效成分及有效成分潜在靶点的筛选 |
2.13 TFL化学成分靶点蛋白质相互作用(PPI)网络的构建 |
2.14 TFL与肝纤维化相关靶点的筛选 |
2.15 TFL对肝纤维化作用靶点的生物信息学分析 |
2.16 TFL“成分-靶点-通路”网络构建及核心靶点筛选 |
2.17 统计学分析 |
3 实验结果 |
3.1 肉眼及镜下对大鼠肝纤维化病变观察 |
3.2 荔枝核总黄酮、荔枝核总黄酮含药血清对HSC-T6细胞的增殖抑制作用 |
3.3 荔枝核总黄酮组和模型对照组蛋白质组学 |
3.4 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因功能GO分析 |
3.4.1 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因生物过程(BP)分析 |
3.4.2 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因细胞组件(CC)分析 |
3.4.3 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白基因分子功能(MF)分析 |
3.5 荔枝核总黄酮组和模型对照组差异蛋白Pathway富集分析 |
3.6 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异蛋白互作分析(PPI) |
3.7 荔枝核总黄酮组和模型对照组的差异表达蛋白亚细胞定位 |
3.8 TFL有效成分及有效成分潜在靶点的筛选 |
3.9 肝纤维化靶点筛选及与TFL靶点的对比分析 |
3.10 TFL对肝纤维化作用靶点的生物信息学分析 |
3.11 TFL“成分-靶点-通路”网络分析及核心靶点 |
4 讨论 |
4.1 肝星状细胞与肝纤维化 |
4.2 荔枝核总黄酮抗肝纤维化的理论依据 |
4.3 中医药对肝纤维化的防治 |
4.4 网络药理学与中医药 |
4.5 蛋白质组学与肝纤维化 |
结论 |
参考文献 |
缩略词表 |
综述 蛋白质组学在中医药抗肝纤维化中的应用 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
(8)益气解毒活血法治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
前言 |
1 资料与方法 |
1.1 研究对象 |
1.2 诊断标准 |
1.2.1 西医诊断标准 |
1.2.2 中医辨证标准 |
1.3 病例选择标准 |
1.3.1 纳入标准 |
1.3.2 排除标准 |
1.3.3 病例剔除标准 |
1.4 治疗方法 |
1.5 观察指标及方法 |
1.5.1 疗效性观察指标 |
1.5.2 安全性及其他相关指标 |
1.6 临床疗效判定标准 |
1.6.1 中医证候积分评价 |
1.6.2 临床综合疗效评定标准 |
1.7 统计学分析方法 |
2 研究结果 |
2.1 一般资料比较 |
2.2 两组患者治疗前与治疗后肝功能、HBV DNA的变化 |
2.3 两组患者治疗前与治疗后肝纤维化血清学四项指标的变化 |
2.4 两组患者治疗前与治疗后APRI、FIB-4 参数值的变化 |
2.5 两组患者治疗前与治疗后肝脏门静脉内径、脾静脉内径、脾脏厚度的变化 |
2.6 两组患者治疗前与治疗后肝脏硬度值的变化 |
2.7 两组患者治疗前与治疗后中医症候积分的变化 |
2.8 两组患者治疗前与治疗后中医症候总积分比较 |
2.9 两组患者临床综合疗效比较 |
3 讨论 |
3.1 现代医学关于慢性乙型肝炎肝纤维化的研究和认识 |
3.1.1 肝纤维化病因研究 |
3.1.2 慢性乙型肝炎相关肝纤维化的发病机制研究 |
3.2 中医关于慢性乙型肝炎肝纤维化的研究和认识 |
3.2.1 中医命名 |
3.2.2 中医对肝纤维化病因病机的研究和认识 |
3.2.3 益气解毒活血法基本遣方之要 |
3.3 安全性评价 |
4 结论 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
附录1:文献综述 慢性乙型肝炎肝纤维化的中西医治疗进展 |
1.西医治疗进展 |
2 中医治疗进展 |
3 总结 |
参考文献 |
附录2 |
致谢 |
(9)基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
中英文缩略词表(Abbreviations) |
前言 |
第一部分 :抗纤软肝颗粒治疗慢性乙型肝炎(CHB)肝纤维化痰瘀互结型临床回顾性对照研究 |
1 临床资料 |
2 研究方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
5 结论 |
第二部分 :基于网络药理学探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化药理作用机制 |
1 实验方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
第三部分 基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制实验研究 |
实验一 :基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的细胞实验研究 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
实验二 :基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化作用机制的动物实验研究 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
结语 |
参考文献 |
附件一:攻读学位期间的研究成果 |
附件二:综述 肝纤维化中西医诊断与防治最新研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
(10)肝苏颗粒抑制肝星状细胞的活化作用及机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
引言 |
第一部分 文献研究 |
1 资料与方法 |
1.1 资料来源 |
1.2 检索方法 |
2 结果 |
2.1 肝苏颗粒文献检索结果 |
2.2 赶黄草文献检索结果 |
2.3 肝苏颗粒研究病种分类 |
2.4 赶黄草研究病种分类 |
2.5 肝苏颗粒治疗肝纤维化的情况 |
2.6 肝苏颗粒药效物质的研究情况 |
第二部分 实验研究 |
第一节 赶黄草总黄酮指纹图谱及含量鉴定研究 |
1.实验材料 |
1.1 实验药物 |
1.2 实验试剂 |
1.3 主要仪器 |
2.实验方法 |
2.1 指纹图谱实验 |
2.1.1 指纹图谱色谱条件 |
2.1.2 溶液的制备 |
2.2 赶黄草总黄酮含量测定方法 |
2.2.1 芦丁对照品溶液配制 |
2.2.2 供试品溶液制备 |
2.2.3 显色剂溶液的制备 |
2.2.4 测定法 |
3.实验结果 |
3.1 赶黄草总黄酮指纹图谱 |
3.2 赶黄草总黄酮含量测定结果 |
第二节 赶黄草总黄酮对肝星状细胞的抑制作用研究 |
1.实验材料 |
1.1 实验细胞 |
1.2 实验药物 |
1.3 主要试剂 |
1.4 主要仪器 |
2.实验方法 |
2.1 .细胞复苏与传代 |
2.1.1 细胞复苏 |
2.1.2 细胞传代 |
2.2 肝星状细胞活化模型的建立 |
2.2.1 MTT实验 |
2.2.2 ELISA实验 |
2.3 赶黄草总黄酮作用浓度的筛选 |
2.4 赶黄草总黄酮对活化后的LX-2细胞活力、细胞迁移、胶原收缩、分泌功能和凋亡的测定 |
2.4.1 活化后LX-2细胞活力测定 |
2.4.2 活化后LX-2细胞迁移试验 |
2.4.3 活化后LX-2细胞胶原收缩试验 |
2.4.4 活化后LX-2 细胞分泌ColⅠ、FN含量测定 |
2.4.5 活化后LX-2细胞凋亡测试 |
2.5 赶黄草总黄酮对活化后的LX-2 相关蛋白m RNA表达的作用 |
2.5.1 RNAiso Plus提取总RNA |
2.5.2 cDNA反转录 |
2.5.3 PCR扩增 |
2.6 赶黄草总黄酮对活化后的LX-2相关蛋白表达的作用 |
2.6.1 样品提取 |
2.6.2 BCA蛋白浓度测定法测蛋白浓度 |
2.6.3 western blot步骤 |
2.7 赶黄草总黄酮对TGF-β1/Smads通路抑制后的LX-2 的作用 |
2.7.1 对胶原收缩的作用 |
2.7.2 对相关蛋白表达的作用 |
2.8 统计学方法 |
3.实验结果 |
3.1 TGF-β1 诱导LX-2 细胞活化模型的浓度筛选结果 |
3.2 赶黄草总黄酮作用浓度的筛选结果 |
3.3 对TGF-β1 活化后的LX-2 细胞的活力、迁移能力、胶原收缩、分泌功能和凋亡的影响 |
3.3.2 对活化后LX-2细胞迁移的影响 |
3.3.3 对活化后LX-2细胞胶原收缩的影响 |
3.3.4 对活化后LX-2 细胞分泌Col I和 FN含量的影响 |
3.3.5 对活化LX-2细胞凋亡的影响 |
3.4 对TGF-β1 活化的LX-2 细胞相关蛋白表达的影响 |
3.4.1 对活化后LX-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
3.4.2 对活化后LX-2 细胞TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达的影响 |
3.5 对TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白m RNA水平的影响 |
3.6 对TGF-β1/Smads通路抑制后的LX-2 细胞的影响 |
3.6.1 对胶原收缩的作用 |
3.6.2 对相关蛋白表达的影响 |
讨论 |
结论 |
创新点 |
问题与展望 |
致谢 |
参考文献 |
附录1 :综述 肝纤维化中西医研究进展 |
参考文献 |
附录2 :在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
四、肝纤维化大鼠肝星状细胞和肝细胞胶原表达特征的实验研究(论文参考文献)
- [1]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究[D]. 蒋云霞. 广西中医药大学, 2021(01)
- [3]基于弹性蛋白合成及降解探讨益肝消积方干预早期肝硬化的机制研究[D]. 张嘉鑫. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]机械压力激活星状细胞诱导NAFL纤维化的实验研究[D]. 高雪. 兰州大学, 2021(11)
- [5]七叶皂苷钠通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制eIF4F复合物进而缓解大鼠肝纤维化[D]. 谢海深. 安徽医科大学, 2021(01)
- [6]疏肝健脾活血法治疗乙肝肝纤维化的临床回顾性研究及其作用机制的网络药理学探索[D]. 施梅姐. 广州中医药大学, 2020(09)
- [7]基于蛋白质组学的荔枝核总黄酮抗大鼠肝纤维化的机制研究[D]. 蔡碧莲. 广西中医药大学, 2020(02)
- [8]益气解毒活血法治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床研究[D]. 邓舟. 湖北中医药大学, 2020(11)
- [9]基于肝窦毛细血管化探讨抗纤软肝颗粒抗肝纤维化的临床疗效与作用机制[D]. 许杰. 湖北中医药大学, 2020(08)
- [10]肝苏颗粒抑制肝星状细胞的活化作用及机制研究[D]. 余蕾. 成都中医药大学, 2020(02)