一、人骨肉瘤细胞系OS-732CAM移植瘤中VEGF、bFGF的表达及意义（论文文献综述）
刘刚[1]（2020）在《CircFAT1吸附miR-375从而增加骨肉瘤细胞中YAP1蛋白表达机制研究》文中提出目的目前迫切需要寻找确定治疗骨肉瘤的新分子靶标。环状RNA是一类内源性RNA,广泛存在于哺乳动物细胞中,并在调节基因表达中发挥关键作用,但在骨肉瘤中,环状RNA的潜在分子机制仍知之甚少。在这里,我们评估了骨肉瘤中环状RNA circFAT1的在骨肉瘤发生发展中的功能及特性。方法首先体外实验明确circFAT1在骨肉瘤中环状RNA的特性,评估circFAT1/miR-375/YAP1对人骨肉瘤细胞生长,凋亡,迁移,侵袭和肿瘤发生的影响。通过蛋白质印迹,荧光定量链式扩增反应,荧光原位杂交,显色原位杂交,RNA结合蛋白免疫沉淀和免疫荧光分析相关信号通路以及circFAT1与miR-375结合模式、功能及具体结合位点。在携带143B骨肉瘤细胞异种移植物的肿瘤生长小鼠中评估了circFAT1及miR-375在骨肉瘤发生发展过程中的功能及作用,以及两者之间具体的结合模式。结果在这项研究中,我们观察到人骨肉瘤组织和细胞系中FAT1基因外显子2产生的circFAT1明显上调。降低骨肉瘤细胞中circFAT1有效地阻止了骨肉瘤细胞的迁移,侵袭和肿瘤发生,并在体内抑制了骨肉瘤的生长。我们观察到人骨肉瘤组织和细胞系miR-375明显下调。提高骨肉瘤细胞中miR-375可有效阻止骨肉瘤细胞的迁移,侵袭和肿瘤发生,并在体内抑制了骨肉瘤的生长。机理研究表明,circFAT1包含一个与micro RNA-375（miR-375）结合的位点,并且可以大量吸收miR-375以上调Yes相关蛋白1的表达。此外,对miR-375的抑制会逆转细胞增殖的减弱,circFAT1敲低诱导的细胞迁移和侵袭,从而促进了肿瘤的发生。结论本项研究发现发现了circFAT1能够特异性吸附miR-375并阻止miR-375结合YAP m RNA,证明了circFAT1以及miR-375在骨肉瘤发生发展中的新功能,揭示了并提出了治疗骨肉瘤的新治疗靶标。
刘峻滔[2]（2019）在《长链非编码RNA CCAT2以及miR-200b/VEGF在骨肉瘤中调控作用的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景骨肉瘤（Osteosarcoma,OSA）是一种由骨间质细胞发展而来,常发病于青少年的恶性肿瘤。其恶性程度高,易转移且预后差。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lncRNAs）是一类长度大于200个核苷酸的RNA转录物。由于其缺少开放阅读编码框（Opening reading frame,OFR）,故不能编码蛋白。近年来,许多文献报道lncRNAs能够在多种人类肿瘤中发挥调控作用。结肠癌相关转录因子2（Colon cancer-associated transcript 2,CCAT2）是一种新近发现的lncRNA,在多种肿瘤中表现促进肿瘤生长的作用。研究目的本研究旨在探究CCAT2是否参与骨肉瘤发生发展,以及可能涉及miR-200b的内在调控机制。实验首先检测CCAT2和miR-200b在骨肉瘤组织及相应的癌旁组织样本,以及骨肉瘤细胞及人正常成骨细胞中的表达。随后分析沉默CCAT2后,骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的改变。研究方法首先收集骨肉瘤组织样本及相应的癌旁组织样本,并培养人骨肉瘤MG63,U20S,US732,Saos-2细胞及人正常成骨hFOB1.19细胞,采用qRT-PCR技术检测CCAT2和miR-200b的表达水平。随后通过转染si-CCAT2构建CCAT2低表达的MG63和U20S细胞,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）实验,5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU）掺入实验,FITC-Annexin V/PI凋亡检测实验,划痕实验和侵袭小室实验分别检测CCAT2沉默对MG63和U20S细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并采用蛋白质免疫印迹实验（westen blot）评估CCAT2沉默对MG63和U20S 中周期蛋白 D1（Cyclin D1）、周期蛋白依赖性激酶 6（Cyclin-dependent kinase 6,CDK6）、Bcl-2、Bax和Caspase 3在蛋白水平表达的影响。结果qRT-PCR实验结果表明,与癌旁组织相比,骨肉瘤组织具有高的CCAT2表达水平（P<0.001）,而miR-200b在骨肉瘤组织中表达量明显降低（P<0.01）;与人正常成骨Hfob1.19细胞相比,CCAT2在骨肉瘤MG63、U20S、US732和Saos-2细胞中高表达（P<0.05 或<0.01）,而 miR-200b 在骨肉瘤 MG63、U20S、US732 和 Saos-2 细胞中低表达（P<0.05或<0.01）。si-CCAT2转染显着沉默了 CCAT2在MG63和U20S细胞中的表达（P<0.01）。CCK-8实验结果表明CCAT2沉默明显降低了 MG63和U20S细胞活力（P<0.05）。BrdU掺入实验结果表明CCAT2沉默显着阻碍了 MG63和U20S细胞增殖（P<0.05或<0.01）,这伴随着Cyclin D1和CDK6蛋白表达水平的下降（P<0.05或<0.01）。FITC-Annexin V/PI凋亡检测实验结果表明CCAT2沉默明显诱导MG63和U20S细胞凋亡（P<0.01或<0.001）,这伴随着Bcl-2蛋白水平的下降（P<0.05或<0.01）和Bax、Cleaved-caspase 3蛋白水平的上升（P<0.01或<0.001）。划痕实验和侵袭小室实验结果说明CCAT2沉默明显减少了 MG63和U20S细胞迁移和侵袭（P<0.01）。结论1.在骨肉瘤细胞中,CCAT2为高水平表达,而miR-200b为低水平表达。2.CCAT2沉默降低MG63和U20S细胞活力,限制细胞增殖,迁移和侵袭,并且促进细胞凋亡。研究目的微小RNA（microRNAs,miRNAs）是细胞内的另一类RNA转录物,长度约为20-25个核苷酸,同样不编码蛋白。LncRNAs通常通过改变miRNAs在肿瘤细胞中的表达水平来发挥调控作用。先前的文献已证实过表达miRNA-200b（miR-200b）能够抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。然而,CCAT2是否参与骨肉瘤发生发展,以及CCAT2是否能够调节骨肉瘤中miR-200b表达尚不清楚。研究目的以CCAT2对miR-200b的调控关系为切入点,探讨miR-200b是否参与CCAT2对骨肉瘤细胞增殖,凋亡,迁移,侵袭的影响。最后研究miR-200b的可能分子靶标。研究方法首先采用qRT-PCR技术检测沉默CCAT2对MG63和U20S中miR-200b表达的影响。随后通过转染miR-200b inhibitor构建miR-200b沉默的MG63和U20S细胞,采用BrdU掺入实验,FITC-Annexin V/PI凋亡检测实验,划痕实验和侵袭小室实验分别检测miR-200b沉默对CCAT2沉默引起的MG63和U20S细胞增殖下降,凋亡增加,迁移和侵袭抑制的影响。利用westen blot实验评估Cyclin D1、CDK6、Bcl-2、Bax和Caspase 3在蛋白水平的表达。最后,采用westen blot实验和荧光素酶报告基因实验分析miR-200b与血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在 MG63 和 U20S 细胞中的关系。结果qRT-PCR实验结果表明CCAT2沉默显着提高了 MG63和U20S细胞中miR-200b的表达水平（P<0.05或<0.01）。BrdU掺入实验结果表明与单独CCAT2沉默组相比,miR-200b inhibitor转染显着促进了 MG63和U20S细胞增殖（P<0.05）,这伴随着Cyclin D1和CDK6蛋白表达水平的上升（P<0.05）。FITC-Annexin V/PI凋亡检测实验结果表明miR-200b inhibitor转染明显缓解了 CCAT2沉默引起的MG63和U20S细胞凋亡增加（P<0.05）。与单独CCAT2沉默组相比,miR-200b inhibitor转染提升了 MG63和U20S细胞中Bcl-2的蛋白水平（P<0.05）,同时降低了 Bax和Cleaved-caspase 3的蛋白水平（P<0.05）。划痕实验和侵袭小室实验说明miR-200b inhibitor转染同样减弱了CCAT2沉默引起的MG63和U20S细胞迁移和侵袭能力的下降（P<0.05）。此外,western blot结果表明CCAT2沉默明显降低了 MG63和U20S细胞中VEGF的蛋白水平（P<0.01）,而miR-200b inhibitor转染缓解了 CCAT2沉默引起的VEGF蛋白水平下降（P<0.05）。荧光素酶报告基因实验结果表明同时转染miR-200b mimic和野生型的VEGF报告基因质粒显着抑制了荧光素酶强度（P<0.01）。结论1 CCAT2沉默能够提高miR-200b在MG63和U20S细胞中的表达水平。2沉默miR-200b在MG63和U20S细胞中的表达能够缓解CCAT2沉默对MG63和U20S细胞增殖,凋亡,迁移和侵袭的影响。研究背景探究CCAT2对骨肉瘤发生发展中的影响,并分析可能涉及miR-200b的内在分子机制,能够为骨肉瘤的诊断和治疗提供潜在的分子靶标。研究目的CCAT2沉默及miR-200b沉默敲低对骨肉瘤细胞中磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（Protein kinase B,AKT）信号通路及腺苷酸激活蛋白激酶（Adenine monophosphate activated protein kinase,AMPK）信号通路的影响研究方法采用 westen blot 实验检测 CCAT2 沉默和 miR-200b inhibitor 转染后,MG63 和 U20S细胞中总的PI3K、磷酸化的PI3K、总的AKT、磷酸化的AKT、总的AMPK和磷酸化的AMPK蛋白表达水平,以分析CCAT2沉默和miR-200b inhibitor转染对MG63和U20S细胞中PI3K/AKT信号通路和AMPK信号通路的影响。结果Western blot实验结果表明CCAT2沉默通过降低磷酸化的PI3K与总的PI3K的表达比例（p/t-PI3K,P<0.05）,磷酸化的AKT与总的AKT的表达比例（p/t-AKT,P<0.05或<0.01）,以及磷酸化的AMPK与总的AMPK的表达比例（p/t-AMPK,P<0.01）显着抑制MG63和U20S细胞中PI3K/AKT和AMPK信号通路的激活。miR-200b inhibitor转染通过提高 p/t-PI3K（P<0.05 或<0.01）、p/t-AKT（P<0.05）以及 p/t-AMPK（P<0.05）的表达水平显着减弱了 CCAT2沉默对MG63和U20S细胞中PI3K/AKT和AMPK信号通路的抑制。结论CCAT2沉默能够通过上调miR-200b表达失活MG63和U20S细胞中PI3K/AKT和AMPK信号通路。
牛敬才[3]（2019）在《EP1受体调控前列腺素E2诱导的骨肉瘤生长机制研究》文中进行了进一步梳理骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是在儿童、青少年等群体骨骼系统中较为常见的原发性、恶性肿瘤。随着化疗、靶向治疗、手术治疗、免疫治疗、中药治疗、肢体重建等技术手段的发展,OS患者保持肢体功能治疗的生存率明显提高,然而OS患者肿瘤细胞增殖、迁移、形成新生肿瘤血管的机制较为复杂,肿瘤发生进展过程仍牵涉繁琐复杂的网状信号转导通路,因此对于OS的发病机制仍需要深层次的研究。近年来,炎症介质及相关细胞因子在OS肿瘤发展形成过程中的研究日益受到关注,环氧化酶（Cyclooxygenase,COX）为重要的炎症介质,在花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）向前列腺素H2（Prostaglandins H2,PGH2）这一转化过程中,COX为限速酶。PGE2是花生四烯酸通过COX-2催化后其主要代谢产物,PGE2作为一种炎症介质在体内广泛分布,在肿瘤发展进程中,白细胞三烯及PGE2以自分泌和旁分泌方式,在多个信号转导通路中发挥两者对肿瘤细胞增殖、分化以及凋亡过程的调控作用。通过与EP受体的特异性结合,PGE2发挥其生理效应,EP受体可分为EP1、EP2、EP3、EP4四种亚型,EP1受体属于G蛋白偶联受体家族,EP1受体能够介导Ca2+调控信号转导。EP1受体与肝癌、皮肤癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌症密切相关。在人Hep G2、Hep3B肝癌细胞中,EP1受体表达水平在EP四种受体中最丰富,EP1受体的特异性拮抗剂ONO-8713呈剂量依赖性抑制人Hep G2、Hep3B肝癌细胞增殖活性,具有诱导人Hep G2、Hep3B肝癌细胞凋亡的作用。在乳腺癌患者组织中,EP1受体参与了血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）调控过程,此外EP1受体与肿瘤组织新生血管形成、肿瘤细胞分化增殖密切相关。然而在骨肉瘤中,PGE2是否在骨肉瘤的进展过程中,参与肿瘤细胞的恶性增生,尚不明确,以EP1受体为靶点是否能够为临床开发高效、高选择性、低毒的抗骨肉瘤治疗手段尚缺乏一定的实验依据。本课题建立骨肉瘤荷瘤裸鼠模型,以人骨肉瘤细胞为研究细胞,运用流式细胞术、酶联免疫反应、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）、免疫组化、免疫印迹、激光共聚焦等技术,观察EP1受体参与骨肉瘤细胞生长机制研究。以期为临床开发高效、高选择性、低毒的抗肿瘤治疗手段提供一定的实验依据。目的:以人骨肉瘤细胞为研究细胞,运用流式细胞术、酶联免疫反应、TUNEL、免疫组化、免疫印迹、激光共聚焦等技术,观察EP1受体参与骨肉瘤细胞生长机制研究。方法:（1）设计EP1 m RNA的特异性引物,采用RT-PCR检测人骨肉瘤细胞MG63、OS732、143B、U-2OS,人胎儿成骨细胞h Fob1.19中EP1m RNA的表达水平。（2）Western Blot方法检测人骨肉瘤细胞MG63、OS732、143B、U-2OS,人胎儿成骨细胞h Fob1.19中EP1的表达水平。（3）将MG63细胞接种于24孔培养板中,每孔接种2×104个细胞,处理组采用PGE2（5μM）,17-PT-PGE2（5μM）,对照组细胞采用0.5%DMSO处理。采用PKC活性检测盒检测EP1受体激动剂对MG63细胞蛋白激酶C的影响。（4）取96孔培养板,每孔接种10000个MG63细胞,处理组采用PGE2（5μM）,17-PT-PGE2（5μM）,对照组细胞采用0.5%DMSO处理。48h后MTT法检测EP1受体激动剂对MG63细胞增殖的影响。（5）将MG63细胞接种于24孔培养板中,每孔接种2×104个细胞,处理组采用17-PT-PGE2（5μM）,和17-PT-PGE2（5μM）+SC51809（2μM）。处理48小时后,采用PKC活性检测盒检测MG63细胞中EP1下游分子PKC活性。（6）取96孔培养板,每孔接种10000个MG63细胞,处理组采用17-PT-PGE2（5μM）,和17-PT-PGE2（5μM）+SC51809（2μM）。随后将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中培养,48h后MTT法检测MG63细胞增殖。（7）取24孔培养板,每孔接种20000个MG63细胞,采用PGE2（5μM）,17-PT-PGE2（5μM）处理,对照组细胞采用0.5%DMSO处理,48h后TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡情况。（8）取24孔培养板,每孔接种20000个MG63细胞,处理组采用17-PT-PGE2（5μM）和17-PT-PGE2（5μM）+SC51809（2μM）。48h后TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡情况。（9）Western Blot方法检测人骨肉瘤细胞MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）、EP1-si RNA+PGE2（5μM）中EP1的表达水平。（10）取96孔培养板,每孔接种10000个MG63细胞,处理组采用MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）、EP1-si RNA+PGE2（5μM）,48h后MTT法检测对MG63细胞增殖的影响。（11）取24孔培养板,每孔接种20000个MG63细胞,处理组采用MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）、EP1-si RNA+PGE2（5μM）。48h后TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡情况。（12）采用Western Blot法检测人骨肉瘤细胞MG63、si RNA对照、EP1-si RNA中凋亡相关蛋白的表达水平。（13）在雄性BALB/c裸鼠,裸鼠腋窝处接种5 x107个MG63细胞,接种完成后接种部位形成皮丘,待裸鼠肿瘤直径达到3-5mm左右时,随机将裸鼠分为对照组及用药组（SC51809）,用药组每日给药2 mg/kg,给药21天,给药期间每隔三天使用游标卡尺测量肿瘤,并按下列方法计算肿瘤体积,肿瘤体积=0.44×长径×短径2。（14）采用PKC活性检测盒检测SC51809对MG63荷瘤裸鼠中PKC活性的影响。（15）TUNEL荧光染色法检测SC51809对MG63荷瘤裸鼠中肿瘤组织凋亡情况。（16）Western Blot检测SC51809体内对MG63荷瘤裸鼠中肿瘤组织凋亡相关蛋白的影响。结果:（1）与人胎儿成骨细胞h Fob1.19相比,人骨肉瘤细胞MG63、OS732、143B、U-2OS中EP1 m RNA的表达水平显着增加,差异具有统计学意义（P<0.01）。（2）人骨肉瘤细胞MG63中EP1的表达水平较人骨肉瘤细胞OS732、143B、U-2OS高,差异具有统计学意义（P<0.01）。（3）17-PT-PGE2组、PGE2组PKC活性水平较对照组高,17-PT-PGE2、PGE2增强了MG63细胞中PKC的活性,差异具有统计学意义（P<0.01）。（4）17-PT-PGE2组、PGE2组增殖水平较对照组高,17-PT-PGE2、PGE2增强了MG63细胞的增殖活性,差异具有统计学意义（P<0.01）。（5）17-PT-PGE2组PKC活性水平较17-PT-PGE2+SC51809组高,差异具有统计学意义（P<0.01）,SC51809组降低了17-PT-PGE2诱导的MG63细胞PKC活性。（6）17-PT-PGE2组增殖水平较17-PT-PGE2+SC51809组高,差异具有统计学意义（P<0.01）,SC51809组降低了17-PT-PGE2诱导的MG63细胞增殖。（7）17-PT-PGE2组、PGE2组观察到的凋亡细胞数量较对照组低,计算细胞凋亡率,17-PT-PGE2组、PGE2组观察到的凋亡率较对照组低,17-PT-PGE2、PGE2增强了MG63细胞的抗凋亡活性,差异具有统计学意义（P<0.01）。（8）17-PT-PGE2组凋亡水平较17-PT-PGE2+SC51809组低,差异具有统计学意义（P<0.01）,SC51809组降低了17-PT-PGE2诱导的MG63细胞抗凋亡活性。（9）MG63 EP1-si RNA+PGE2中EP1的表达水平较MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）中低,差异具有统计学意义（P<0.01）。（10）MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）组增殖水平较EP1-si RNA+PGE2（5μM）组高,其差异具有统计学意义（P<0.01）,提示沉默EP1受体能够降低MG63细胞增殖。（11）EP1-si RNA+PGE2组凋亡水平较MG63+PGE2（5μM）、si RNA对照+PGE2（5μM）组高,其差异具有统计学意义（P<0.01）,提示沉默EP1受体能够诱导MG63细胞凋亡。（12）MG63 EP1-si RNA较MG63、si RNA对照中Bax、cytoplasmic cyt c、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的表达水平显着升高,MG63 EP1-si RNA较MG63、si RNA对照中Bcl-2、mitochondrial cyt c表达水平显着降低,其差异具有统计学意义（P<0.01）。（13）SC51809对MG63荷瘤裸鼠中的的肿瘤体积和平均肿瘤重量具有抑制作用,与对照组相比SC51809组裸鼠的肿瘤体积、肿瘤重量较小,差异具有统计学意义（P<0.01）,SC51809对MG63荷瘤裸鼠中的肿瘤生长具有抑制作用。（14）SC51809组PKC活性水平较对照组低,其差异具有统计学意义（P<0.01）。SC51809组降低了MG63荷瘤裸鼠PKC活性。（15）SC51809组观察到的凋亡率较对照组高,SC51809在体内具有诱导MG63细胞凋亡作用,其差异具有统计学意义（P<0.01）。（16）MG63荷瘤裸鼠肿瘤组织中SC51809组较对照组中Bax、cytoplasmic cyt c、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9的表达水平显着升高,MG63荷瘤裸鼠肿瘤组织中SC51809组较对照组中Bcl-2、mitochondrial cyt c表达水平显着降低,其差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:（1）EP1受体激动剂、PGE2能够抑制MG63细胞凋亡,EP1受体抑制剂对17-PT-PGE2诱导的MG63细胞凋亡活性增强,阻断EP1受体能够抑制17-PT-PGE2诱导的MG63细胞增殖,促进17-PT-PGE2诱导的MG63细胞凋亡,沉默EP1能够抑制PGE2诱导的MG63细胞增殖,促进PGE2诱导的MG63细胞凋亡,提示EP1参与了PGE2、17-PT-PGE2诱导的MG63肿瘤细胞的增殖与凋亡。（2）人骨肉瘤细胞MG63中EP1表达水平较高。（3）EP1受体激动剂、PGE2能够增强MG63细胞蛋白激酶C表达水平以及增殖活性,EP1受体抑制剂能够抑制蛋白激酶C表达水平以及增殖活性。（4）SC51809体内能够抑制MG63荷瘤裸鼠中的的肿瘤生长,降低肿瘤组织PKC活性水平,诱导肿瘤肿瘤凋亡,介导凋亡相关蛋白的调控。
张旭东[4]（2017）在《阿魏酸影响骨肉瘤细胞系的实验研究》文中指出第一部分:阿魏酸促进骨肉瘤细胞的凋亡目的:探索阿魏酸在SaOS-2和MG63骨肉瘤细胞系中促进凋亡和抗肿瘤活性及其潜在的机制。方法:选取SaOS-2和MG63骨肉瘤细胞系进行实验,分别将其置于不同浓度（0 μM,10μM,20μM,40μM）的阿魏酸溶液中,在37℃下培养72小时。应用MTT方法检测培养的骨肉瘤细胞存活率;用annexinV和碘化丙啶处理培养后的细胞,通过流式细胞仪检测骨肉瘤细胞的凋亡情况;运用western blot技术检测培养的骨肉瘤细胞中凋亡蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax含量;运用qPCR技术检测培养的骨肉瘤细胞中Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达量。结果:阿魏酸培养的骨肉瘤细胞的存活率以浓度依赖性关系显着性降低（P<0.01）。培养后凋亡的骨肉瘤细胞数随阿魏酸的浓度的增高而相应增多。procaspase-3蛋白含量、Bcl-2mRNA和蛋白含量显着性降低（P<0.05）,与此同时,caspase-3蛋白含量、Bax mRNA和蛋白含量显着性升高（P<0.05）,且这些变化的趋势呈现明显的剂量依赖性关系（P<0.05）。阿魏酸对SaOS-2骨肉瘤细胞的作用与对MG63骨肉瘤细胞的作用非常相似（P>0.05）。结论:阿魏酸可能通过激活caspase-3和Bax的基因表达并下调Bcl-2基因表达来促进凋亡,从而显着性降低骨肉瘤细胞的存活率。第二部分:阿魏酸抑制骨肉瘤细胞的血管化目的:探索阿魏酸对骨肉瘤细胞系的血管化的影响,从而抑制骨肉瘤细胞的活力。方法:将SaOS骨肉瘤细胞分别置于40 μM或0 μM的阿魏酸溶液中培养72小时,检测血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的免疫组织化学特征,运用qPCR技术定量VEGF mRNA的相对表达量,应用Western blot技术检测VEGF蛋白含量。另将阿魏酸培养的SaOS骨肉瘤细胞接种到Balb/C裸鼠皮下,生成的移植瘤组织切片进行HE染色、VEGF免疫组织化学和CD34免疫组织化学检查以及肿瘤微血管计数。结果:在体外实验中,阿魏酸组中VEGF免疫组织化学斑点、VEGF mRNA的相对表达量和VEGF蛋白含量均较对照组显着性减少。在体内实验中,肿瘤组织大体形态学观察见阿魏酸组细胞的异型性不明显且新生的血管系统稀少,免疫组织化学检测结果显示阿魏酸组VEGF的免疫组织化学斑点和CD34的免疫组织化学斑点均明显稀少于对照组,且阿魏酸组的微血管计数（7.70±1.55）也较对照组（18.22±3.31）显着性减少（P<0.05）。结论:阿魏酸能显着性抑制骨肉瘤的血管化,从而对骨肉瘤产生抑制作用,它有可能成为一种新颖且有良好应用前景的治疗骨肉瘤的天然药物。
流小舟[5]（2016）在《Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究》文中研究说明研究背景作为一种恶性的成骨性肿瘤,骨肉瘤的主要来源是骨组织,通常其多见于骨生长活跃的年轻人当中,由于其恶性程度高,侵犯范围较大,而且容易发生早期肺部的转移,因此往往治愈难度大,过去单一治疗效果不够理想,五年内存活率不足两成,尽管有关新辅助化疗以及保肢手术的探究日益深化,愈来愈多的骨肉瘤病患能够保留自身的肢体,延续自己的生命年限。但是在诊断方面,到目前仍然没有可识别性标志物,在骨肉瘤分化比较差的时候仅仅通过观察形态来作出诊断,因此病理判断的精确性不够。同时肿瘤的复发和转移等恶性生物学行为仍然是很大程度上影响着患者的预后、导致骨肉瘤患者生存率不理想,进而导致骨肉瘤患者治疗失败的主要因素。目前相关的基础研究对骨肉瘤病因及转移发展机制仍未有重要的突破,在临床上也没有新的药物和新的治疗模式产生,因此寻找新的研究突破点、探讨人骨肉瘤的侵袭和转移机制显得至关重要。既往针对肿瘤细胞的杀伤主要包括化疗和放疗介导的细胞凋亡,而这正是由肿瘤细胞可以抑制自身凋亡、促进自身存活力增强的共同特征所决定的。正常细胞的凋亡机制受到抑制导致肿瘤的发生,而肿瘤细胞的凋亡机制紊乱导致肿瘤的不断增殖是困扰和限制临床治疗及肿瘤基础学研究进一步发展的核心问题。究其根本,包括IAPs家族在内的多种凋亡抑制基因参与其中、相互协调作用是该问题的关键。IAPs家族负责编码一组结构相似、功能相关的蛋白,这一家族的大多数成员可以借助直观层面的联合与阻止特定的Caspase来抑制细胞凋亡,是调控启动Caspase和效应Caspase的唯一内源性蛋白。迄今为止,在人体新发现的IAPs家族有8个成员,即NAIP、XIAP（ILP-1/MIHA）、cIAP-1（HIAP-2/MIHB）、Survivin（TIAP）、Apollon（Bruce）、cIAP-2（HIAP-1/MI-HC）、ILP-2（Ts-IAP）与Livin（ML-IAP/KIAP）。其中Survivin是近几年发现的一个IAPs家族中的成员,因其在正常人体的组织内均无明显表达,而在恶性肿瘤组织中呈特异性高表达,因此将Survivin作为连接细胞凋亡和细胞周期的纽带,同时作为促进骨肉瘤细胞凋亡、治疗骨肉瘤组织生长的针对性靶点是我们未来研究骨肉瘤靶向疗法的潜在性突破口和该领域研究的热点。Survivin基因由Ambrosini等借助ECPR1内的cDNA自人类基因库内选取,该基因全长15kb,其位置在17q25染色体上,存在的外显子数量是4个,内含子的数量是3个,在进行一定的编码程序以后,就会产生内含142个氨基酸的Survivin蛋白,有别于IAP家族的其他成员,截止到目前,Survivin不仅是家族中最新发现,也是分子量最低的凋亡抑制蛋白。因此其在功能上也一定程度的有别于IAP家族的其他成员,即:干预细胞凋亡的同时也参与细胞有丝分裂及其他细胞阶段性的周期变化,还在肿瘤滋养血管出现和转移性生长进入其它器官的过程中发挥作用:（1）遏制细胞凋亡的功效:①Survivin借助BIR功能区的妨碍凋亡相关的氨基酸残基Trp67、Pro33和Cys84直接作用于Caspase-3、Caspase-7,在干扰他们活力的同时可以进一步起到干扰凋亡的作用。②Survivin借助和细胞附件控制因子CDK4产生Survivin-CDK4,这种混合产物可以使P21自CDK4内能够被释放出来,而P21可以和Caspase-3发生关联,进而能够对Caspase产生一定的约束性,防止细胞出现凋敝的情况。③近几年研究指出,Survivin是周期蛋白激酶p34cdc-cyclinBl在有丝分裂阶段中形成的底物,磷酸化Survivin Thr34之后可以再和Caspase-9发生关联,防止依赖于Caspase-9发挥作用的相关细胞凋亡因子的转导传输。（2）调节细胞周期的功效:Survivin与CDK4结合后,竞争性地抑制CDK4/p16（INK4a）复合物的形成,活化CDK2/cyclin E,磷酸化Rb,从而加快G1期向S期的转换。在G2/M期特异性表达,Survivin因其羧基末端无RING锌指结构,代之以一个长度为6.5nm、由40个氨基酸组成的α螺旋结构,在有丝分裂的初期,Survivin借助这一架构和有丝分裂纺锤体内存在的microtubule结构发生特定可饱和作用,加速有丝分裂、促进恶性肿瘤细胞繁殖的同时避免因先天遗传或后天突变引起的细胞自然或非自然死亡。（3）参与血管形成的功效:VEGF在肿瘤组织中可以导致肿瘤滋养血管的生成,而Survivin在该过程中具有保障血管内皮组织与新生血管出现的关键价值。0’ Connor等指出血管内皮细胞中的Survivin可以在VEGF与bFGF的介导下较呈现高表达状态。Tran等分析认为,在稳定细小血管网架构、保障血管内皮细胞性能、使肿瘤血管内皮细胞产生化疗药物耐药性等方面,Survivin均发挥了一定的作用。Coma等制备了针对Survivin的反义寡核苷酸,在沉默Survivin的表达后发现由TNF介导的VEGF的抗凋亡活性降低,而Survivin的表达与VEGF的表达又呈正相关,提示二者在骨肉瘤的血管生成过程中发挥协同作用。由此可见,肿瘤尤其是骨肉瘤的发生、发展及转移的确是一个十分复杂的过程,目前骨肉瘤发生及转移原因尚未得到阐明。细胞凋亡作为一种高度保守的细胞死亡机制,又被称为程序性细胞死亡,其具有组织、生化和形态学方面特性。由于肿瘤的生长和发展取决于肿瘤细胞的增殖率与凋亡率之间的平衡,这种平衡一旦打破,一方面,那些在生理状态下需要及依赖于凋亡程序发挥作用的组织内环境稳定性及胚胎细胞发育过程会发生紊乱。而另一方面,干扰细胞的凋亡又能够导致细胞存活时间很大程度延长,基因突变体的聚积从而诱发肿瘤的形成、促进肿瘤转移、增强肿瘤化疗耐药性。因此伴随着肿瘤分子遗传学、分子生物学,特别是靶向肿瘤分子学的进步,找到细胞凋亡机制中作用于骨肉瘤的发生、发展、侵袭、转移全过程的有效靶点是现今从事骨肉瘤研究的学者们迫切希望解决的重中之重。从当前的研究我们能够看出,骨肉瘤组织里的Survivin基因的异常表达有可能促使肿瘤细胞脱离生长监控的范围,克制肿瘤细胞的凋亡。有学者提出,Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。还有的研究利用Cox多变量回归模型展开剖析,对骨肉瘤病患的Survivin表达程度配合化疗前化疗敏感性的预期展开预估,最终得出Survivin蛋白表达的上调同骨肉瘤组织发生发展密切相关,且Survivin可以作为骨肉瘤诊断和判断预后的一个标志物。Survivin在骨肉瘤组织中的表达水平不仅明显高于骨良性肿瘤,而且骨肉瘤的恶性程度越高、分化等级越差,Survivin在其中的表达就越高。随着骨肉瘤的形成和转移,Survivin在肿瘤组织中的表达水平会出现明显的提升,说明Survivin与骨肉瘤的肿瘤表观形态和恶性生物学行为有关。因为凋亡遏制蛋白Survivin于肿瘤组织中选择性的高表达,我们可以这样进行假设:抑制Survivin有可能导致骨肉瘤细胞的自发性凋亡,我们在既往的实验中证实了在骨肉瘤细胞系U20S、SAOS及MG63中,Survivin的表达明显增加,这在我们后续对比骨肉瘤组织和正常组织中Survivin表达的实验中也得到证实。我们还发现采用Survivin反义寡核苷酸技术可以降低Survivin在骨肉瘤细胞中的表达,显着抑制骨肉瘤细胞增殖并呈现出浓度依赖性,从而诱导骨肉瘤中的细胞凋亡。根据以往研究结果,我们进一步提出假设:是否存在着一种下游信号传导通路元件,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用;而在体内环境中,抑制Survivin又能否影响骨肉瘤瘤体的生长。肿瘤的转移囊括了肿瘤细胞于间质里移动并且接触脉管、肿瘤细胞突破血管内皮还有内皮下的基底膜展开血流,而且在血液里存活、肿瘤细胞穿出血管,于组织里生长、增殖,产生转移灶。因此我们能够看到,肿瘤的转移和细胞之间、细胞同细胞之外基质二者之间的的粘附作用存在一定关系。但是此类相互辨别以及作用是需要CAMs在其中发挥其介导作用的。整个CAMs家族里的一个关键元素即整合素,它是利用非共价键将α以及β两种亚单位链接所组成的的异二聚体分子。根据该家族中当前所发现的二十五个α亚单位以及十一个β亚单位,可以一起构成不下数十种不一样的整合素。这两种亚基构造有相似之处,都是通过较长的胞外段（氨基端）、跨膜段、较短的胞内段（羧基端）三部分一起组成的。α亚基凭借其胞外段能够对于ECM的RGD序列加以辨别,介导细胞与ECM二者的粘附,而β亚基的胞内段同细胞骨架构连接在一起。整合素与配体结合发挥其功能,故整合素按识别配体的不同又可分为三大类,本文所讨论的整合素α 5属于其中识别非RGD序列的整合素,其配体为基底膜蛋白,例如层黏连蛋白（LN）以及纤维连接蛋白（FN）等,而胶原蛋白正是骨组织的主要细胞外基质成分,近来人们发现骨组织中整合素的表达水平对成骨和吸收具有调控作用,提示整合素与很多骨代谢疾病甚至成骨、溶骨病变的病理机制有关。除了介导细胞与基底膜、细胞与细胞的粘附,整合素同时具有通过与其配体结合后向细胞内传递信号,进而影响基因的表达,最后影响细胞的增殖代谢、基因转导、凋亡等生物学行为的功能。有文献报道,在整合素α 5和Survivin促进骨肉瘤细胞的增殖作用过程中,Caspase-3均起到介导作用;整合素α5和Survivin有可能直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程。三者可能共同参与骨肉瘤细胞的恶性生物学行为。可见,整合素很有可能对骨肉瘤的生长、发展、侵袭、转移过程产生非常重要的影响,而这种影响是在与Survivin相互协调、相互作用中完成的。当前针对Survivin的敲低或敲除实验为骨肉瘤靶向基因治疗提供了理论依据和方向。而相对于反义寡核苷酸技术来说,RNA干扰技术（RNAi）具有转染效率高、转染效果稳定、特异性强、浓度依赖性好、潜在毒性弱、作用时间充分、维持时间较长、实验准备及操作简便的优点。该项技术是由Fire于1998年首先在研究秀丽新小杆线虫（C.elegans）反义RNA的过程中发现并证实是一种由dsRNA介导的同源RNA降解过程,已逐渐成为公认的实验技术和治疗手段。其原理是在生物体细胞内,利用具备同源性的dsRNA诱使序列特异的特定基因的沉默,快速的防止目标基因活性。siRNA就是RNAi途径中间的产物,或者说也是RNAi发挥作用的必不可少的因素,现如今应用在现实治疗过程中的siRNA类型基本上有两种:体外形成的RNA干涉片段以及DNA干涉载体。由于前者转染效率还存在RNAi功效的瞬时性程度不够,现在大多数应用DNA载体于细胞里表达siRNA相关技术。杨彤涛等对于Survivin基因的RNA干涉特异性片段进行合成,利用骨肉瘤细胞体外生长还有体内移植成瘤试验,证明Survivin的特异性siRNA能够大大促进骨肉瘤细胞自行凋亡的过程。能够看出在有关骨肉瘤的实验性治疗过程里,RNAi能够对于癌基因的表达加以遏制、对于突变激活的癌基因进行清除、克制基因扩增的同时,还能够克制融合基因表达、克制其他肿瘤有关基因的表达。Zou等利用干扰RNA技术并且应用依泊托苷、阿霉素等有关的化疗药物,能够很明显的克制MG63细胞的产生,提升化疗的敏感程度,实验的结果显示出关于Survivin的干扰RNA技术能够提升化疗的效果,进而降低所使用化疗药物的数量,降低因药物所产生不良反应的发生,实现对骨肉瘤细胞生长的有效抑制,显示出抑制Survivin基因联合化疗治疗骨肉瘤的优越性。综上所述,我们拟进行对Survivin及整合素α 5与骨肉瘤恶性行为特性的关系的研究,评价针对Survivin的干扰RNA技术治疗后骨肉瘤细胞内整合素α 5表达的变化情况;分析Survivin与整合素α 5的上下游调控关系,观察上述治疗手段对骨肉瘤组织体内生长的影响,明确Survivin能否通过整合素α 5产生对骨肉瘤细胞的体外、体内作用,使Survivin-SiRNA及整合素α5特异性抗体成为骨肉瘤靶向治疗的新手段。第一章:针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株的制备及体外验证研究目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株,对比分析转染后Survivin在骨肉瘤细胞中的含量,以验证转染效果。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）和空白对照组（空脂质体转染）,再采用Western blot技术检测三组MG63细胞转染后Survivin蛋白的含量,并进行比较。结果:Western blot检测得出的结果显示出MG63细胞裂解液里具备特异性的Survivin蛋白条带。Survivin-SiRNA能降低MG63细胞内Survivin蛋白的表达,Survivin-SiRNA转染骨肉瘤细胞系MG63后Survivin蛋白的含量相比较于阴性对照组和空白对照组中细胞内Survivin蛋白的含量均是下降的。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着降低了骨肉瘤MG63细胞中Survivin蛋白的含量,进一步证实了 Survivin-SiRNA可以成功抑制Survivin的表达。该转染细胞株的制备为的后续体外细胞学及体内组织学实验积累了相关经验,奠定了理论基础。第二章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,再采用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。结果:Transwell实验结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,侵袭细胞数显着减少（P<0.01）。而细胞划痕实验结果也显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。进一步证实了抑制Survivin的表达可以影响骨肉瘤细胞的发生发展,提示Survivin不仅与骨肉瘤原位生长密切相关,而且可能参与了骨肉瘤远处转移的过程。第三章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5表达水平的影响目的:探讨Survivin-SiRNA对骨肉瘤中整合素α5表达水平的影响,验证整合素α 5是否为Survivin的下游信号传导通路元件。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,再采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平,并进行比较。结果:通过流式细胞术和荧光显微镜进行观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞与阴性对照组相比,整合素α 5的表达水平受到显着抑制（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞中整合素α 5的表达水平。进一步证实了针对性抑制Survivin的表达可以下调骨肉瘤细胞中整合素α 5的表达,这说明Survivin可能是整合素α 5的一种上游调节剂,Survivin可以通过它产生对骨肉瘤细胞的体外作用。第四章:靶向治疗整合素α 5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响目的:制备针对骨肉瘤MG63细胞系的整合素α5-SiRNA转染细胞株,在验证转染效果后探讨整合素α 5-SiRNA以及靶向抗整合素α 5抗体对骨肉瘤MG63细胞侵袭能力、迁移能力的影响。方法:设计合成特异性靶向整合素α5的整合素α5-SiRNA对MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scrαmble RNA转染）,采用免疫染色法,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测两组MG63细胞转染后的整合素α 5表达水平以验证转染效果,之后利用Transwell实验及细胞划痕实验检测两组MG63细胞转染后的侵袭和迁移能力,并进行比较。再使用靶向抗整合素α 5抗体（M200）作用于骨肉瘤MG63细胞,通过Transwell实验及细胞划痕实验继续观察、比较靶向治疗后MG63细胞的侵袭和迁移能力。结果:Transwell实验结果显示经转染整合素α 5-SiRNA后以及抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞分别与阴性对照组进行比较,发现侵袭细胞数均显着减少（P<0.01）。而细胞划痕实验结果也显示抗整合素α 5抗体治疗后的骨肉瘤MG63细胞在48h内的划痕区域中细胞迁移率较阴性对照组明显下降（P<0.01）;而阴性对照组在48h内的划痕区域中细胞迁移率甚至超出转染整合素α5-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞的两倍之多（P<0.01）。结论:无论是靶向干扰RNA还是靶向抗体治疗均显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的侵袭和迁移能力。一方面证明了整合素α 5的表达与骨肉瘤细胞侵袭和转移的相关性。另一方面也提示靶向抑制整合素α 5的表达可以直接达到治疗效果,从而为更新骨肉瘤临床治疗方案提供了理论依据。第五章:Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响目的:将针对骨肉瘤MG63细胞系的Survivin-SiRNA转染细胞株移植到裸鼠体内,建立了骨肉瘤动物模型,观察其体内生长成瘤情况。方法:设计合成特异性靶向Survivin的Survivin-SiRNA对骨肉瘤MG63细胞进行转染,同时设置相同浓度的阴性对照组（scramble RNA转染）,之后将两组细胞分别接种至裸鼠腹部的左、右两侧皮下。接种三个星期后,处死小鼠并称重肿瘤。观察肿瘤体积,计算肿瘤的平均重量,并进行比较。结果:通过肿瘤称重和肉眼观察,结果显示转染Survivin-SiRNA后的骨肉瘤MG63细胞成瘤体积和重量均较阴性对照组明显缩小和下降（P<0.01）。结论:靶向Survivin的Survivin-SiRNA显着抑制了骨肉瘤MG63细胞的体内生长成瘤情况。进一步证实了抑制Survivin的表达可以减缓异种移植瘤的生长,提示Survivin在骨肉瘤增殖繁衍过程中的重要作用。
费丹[6]（2014）在《特异性抗体介导的蜂毒肽对骨肉瘤的抑制作用》文中研究说明表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）对于多种细胞具有促进增殖和营养作用。EGFR在多种肿瘤细胞内高表达，说明其与这些肿瘤的发生、发展等变化有关。另外，大量研究表明EGFR信号系统与肿瘤的发生和肿瘤耐药性关系密切，并且EGFR的异常变化也是骨肉瘤的显着特点。蜂毒（Beevenom, BV）做为免疫相关疾病治疗制剂已广泛应用，特别是在肿瘤治疗领域其作用十分显着。研究发现，肾癌、肺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌以及白血病细胞均可成为BV主要成分蜂毒肽（Melittin）的靶标。Melittin激活PLA2从而发挥细胞毒作用已被公认为BV抗肿瘤的主要作用机制。Melittin通过激活Caspase酶和基质金属蛋白酶，诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，从而实现其抗肿瘤作用。现已证明，将Melittin与激素受体、特异性抗体等多种具有导向作用的物质融合表达，可以有效治疗多种肿瘤。本研究将Melittin通过柔性肽与抗EGFRscFv连接，并由大肠杆菌进行表达，制备了融合蛋白antiEGFR/MEL。对表达条件进行了优化，并进行了复性和初步纯化。利用表达的融合蛋白，针对人骨肉瘤细胞进行了体内、外抑瘤实验研究。研究结果表明，含有EGFR单链抗体的重组蛋白antiEGFR/MEL可与OS732细胞有效结合，并定位于OS732细胞膜表面。antiEGFR/MEL能够有效抑制OS732细胞的生长，但对正常细胞L02无明显作用。另外，antiEGFR/MEL抑制OS732细胞生长的现象，呈现明显的时间效应和剂量效应趋势。本研究还利用BALB/c小鼠结合小鼠骨肉瘤细胞S180，建立了实体肉瘤细胞模型，并开展了体内抑瘤实验研究。研究结果表明，antiEGFR/MEL可以抑制S180实体肿瘤生长、延长动物模型生存期、延长动物模型肿瘤倍增时间和肿瘤生长延迟时间。以上结果说明，antiEGFR/MEL具有应用于骨肉瘤生物治疗研究的潜质。
黎江[7]（2012）在《肝癌干细胞新型培养体系的建立以及治疗靶点筛选》文中指出肿瘤干细胞的存在已经被越来越多的人所认同，但由于分离到的CSCs细胞数量太少，难以支持后续实验的开展。如何在体外有效的分离，培养，扩增肿瘤干细胞，并以此为研究对象是我们思考的方向。国外学者在长期研究中发现，加入EGF和bFGF的无血清培养液有利于正常成体干细胞的体外扩增，并维持干细胞多向分化潜能。目前已经在乳腺癌、恶性神经系统肿瘤、结肠癌等恶性肿瘤中分离培养得到了类似肿瘤干细胞的一群细胞，他们是用含有EGF和bFGF的无血清培养体系维持增殖、分化潜能。我们将以此为基础进行肝癌干细胞的培养。由于现阶段分离肝癌干细胞还缺乏广谱的公认的标志物，且绝大多数分离工作均局限于肝癌细胞系，直接从人癌组织分离并培养肝癌干细胞尚无报道，严重阻碍了对肝癌干细胞的深入研究。本实验采用直接无血清培养的方法，从肝癌细胞株以及人原代肝癌组织中分离出肝癌干细胞样细胞并连续传代并尝试建立一种可有效富集肝癌干细胞样细胞的体外无血清悬浮培养技术，以期建立一种从人肝癌组织中分离培养获得肿瘤干细胞样细胞的新方法。并对培养出的球状细胞进行体外侵袭性，细胞周期的变化，细胞耐药性，克隆细胞的体外分化能力以及成瘤能力等方面验证我们获得的细胞具有肿瘤干细胞特性；进一步进行RNA深度测序和生物信息学分析，检测肝癌干细胞与肝癌细胞之间的差异。1、人肝癌干细胞样细胞的新型培养基的筛选及肿瘤细胞系的建立为更好的培养扩增肝癌干细胞，我们对培养体系进行优化，经过实验室长期的实验探索，筛选出7种有效的培养体系。培养成分包括DMEM-F12，非必需氨基酸，血清替代物，N2，B27，B27-minus VA，BSA，EGF，bFGF以及我们自己筛选的2个细胞因子IGF-1和FGF-10。通过长期的筛选实验证实C3号培养配方是我们的最佳培养体系。这个配方包含了B27-minus VA，EGF和我们筛选的IGF-1和FGF-10。利用无血清C3培养基对肝癌细胞系、原代细胞系及异种移植技术得到的肿瘤组织等多种来源的细胞进行培养，并获得了球状细胞。从肝癌细胞系Hep3B和Huh7中培养出来的球状细胞Hep3B-C、Huh7-C克隆形态越来越明显，并且能够稳定传代培养。从高侵袭性的细胞株HCCLM3和MHCC97-H及低侵袭能力的细胞株MHCC97-L分别培养得到了HCCLM3-C、MHCC97-H-C和MHCC97-L-C。在肝癌细胞系中成功得到球状生长的细胞之后，我们取病人的肿瘤组织直接进行消化培养，同样获得了球状细胞EHBH-HCSC-1和EHBH-HCSC-2细胞。同时，采用了异种移植技术，将病人的肿瘤组织直接包埋于小鼠皮下，一段时间后取小鼠的皮下肿瘤组织消化培养，分别利用常规的DMEM-F12+10%FBS和C3无血清培养体系进行培养，得到了一株呈上皮状生长的肿瘤细胞系EHBH-3和球状细胞EHBH-HCSC-3。2、球状细胞生物学特性分析经C3无血清培养体系获得了球状细胞后，进一步对这些细胞进行了生物学特性的分析：1)利用实时荧光定量PCR检测Wnt-1，CD90，Ep-CAM，NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3在Hep3B、Huh7、MHCC97-L、HCCLM3、Hep3B-C、Huh7-C、MHCC97-L-C、HCCLM3-C中的表达情况。结果表明CD90在球状细胞中表达量都高于其相对应的贴壁肝癌细胞株。其中，Huh7-C中CD90的表达量是Huh7中表达量的10倍。球状细胞与相对应的细胞株相比NOTCH的mRNA表达均下降，而在Wnt-1和Ep-CAM的mRNA表达水平上出现了不一致的现象。2)对球状细胞进行糖原染色以及ICG的摄取实验，证实了这些细胞确实是肝癌细胞来源的细胞，而不是其他细胞污染。3)利用体外Matrigel侵袭实验直接比较Huh7细胞与Huh7-C细胞的侵袭能力。结果发现球状细胞Huh7-C与对应的Huh7细胞都具有较强的侵袭特性。定量分析结果表明，球状细胞Huh7-C的侵袭程度比Huh7高接近3倍。4)通过细胞周期的分析发现球状细胞Hep3B-C和Huh7-C主要处于G0-G1期，所占的百分比分别为74.09%和59.20%，与肝癌细胞株Hep3B和Huh7具有显着差异。5)流式细胞仪和RT-PCR检测发现在球状细胞中CD90的表达量均有不同程度的提高，两次实验结果趋势一致。在Hep3B-C细胞中，其提高倍数达10倍以上，这与之前的研究者所获得的肝癌干细胞的表型一致。同时检测了细胞的表面抗原Ep-CAM的表达情况，结果发现两种球状细胞的表达量都是下降的，这与以前的研究是相悖的。6)在Hep3B-C和Huh7-C细胞对阿霉素的摄取检测实验中发现，与相对应的Hep3B和Huh7相比较，在相同时间里面，球状细胞摄入的阿霉素的量少于普通的贴壁肝癌细胞，这是细胞产生耐药性的一个重要的条件。进一步检测细胞在不同的药物浓度下的存活率实验中证实，球状细胞Huh7-C相对于贴壁的肝癌细胞Huh7具有良好的耐药性。球状细胞对临床证实的第一个针对肝癌靶向性的药物索拉非尼的耐药性实验中也证实了这一点：应用无血清培养基培养出来的球状细胞在40umol/L的sorafinib的浓度下48小时依然有46%的细胞存活，而与此相对照的贴壁肝癌细胞Huh7基本没有细胞存活。耐药性实验证明，通过无血清条件培养获得的球状细胞与贴壁细胞相比具有良好的耐药性。7) ELISA定量检测结果说明无论是贴壁的肝癌干细胞还是球状的肝癌细胞均可以大量表达VEGF，而不同的细胞所形成的球状的细胞中其表达趋势并不是一致的，这可能与很多因素有关。8)对获得的球状细胞的进一步进行体外诱导分化。分别选取肝癌细胞的标记CK8、CK18；胆管细胞的标记CK19；血管细胞的标记Tie2。Huh7表达CK8和CK18，但不表达CK19和Tie2，而Huh7-C细胞对这4个标记表达很弱或不表达。将Huh7-C诱导后细胞均表达这4个标记因子。这个结果提示我们可能球状细胞具有多向分化的潜能，可以形成各种不同类型的细胞，这需要我们找到诱导的最佳条件，从而真正能够了解这些悬浮、球状生长的细胞。9)本课题通过给NOD/SCID鼠背部皮下注射不同细胞数量的肝癌贴壁细胞与球状生长的细胞，比较球状细胞与贴壁细胞的成瘤能力。异种移植成瘤试验的结果显示：接种100个MHCC97-L-C细胞到NOD/SCID小鼠中可以100%形成肿瘤；1000个HCCLM3-C细胞接种成瘤率高达100％；而对应的贴壁细胞成瘤率却很低。在MHCC97-H-C细胞株成瘤实验中发现100个细胞就可以在NOD/SCID鼠皮下成瘤，10000个MHCC97-H-C细胞在小鼠中成瘤率可达到100%，而相同数量的贴壁细胞MHCC97-H却不能形成肿瘤。小鼠皮下注射105个Huh7细胞都不能形成肿瘤，但是105个球状细胞Huh7-C能100%形成肿瘤。通过以上实验结果证实经C3无血清培养体系获得的球状细胞具有肿瘤干细胞的特性，可以作为肝癌干细胞研究的对象。3、肝癌干细胞样细胞的深度测序以及生物信息学分析采用Illumina HiSeq2000测序技术分别对3株肝癌干细胞株样品Huh7-C，Hep3B-C，MHCC97-H-C以及对应的3株肝癌细胞株样品Huh7，Hep3B，MHCC97-H进行RNA深度测序，采用RPKM算法对原始RNA测序数据进行预处理，消除系统误差；采用倍数法（FoldChange）筛选差异表达基因，通过文本挖掘进一步筛选到44个肝癌干细胞相关的关键基因，采用Onto-Express软件将筛选到的基因映射到Gene Ontology数据库中，进行功能富集性分析。并进一步在通路水平上进行的富集性分析，将筛选后得到的基因分别映射到GeneGO数据库和KEGG数据库中，基于KEGG数据库的分析结果仅筛选到了1条关键通路，满足统计学检测指标p-value<0.05，基于GeneGO数据的分析中则筛选到了17肝癌干细胞相关的通路（p-value<0.05），其中补体通路被2个数据库同时筛选到，可能在肝癌干细胞的分子过程中起着关键的作用。另外，本文分别对2株肝癌细胞系Hep3B，Huh7和2株肝癌干细胞系Hep3B-C，Huh7-C进行了sRNA深度测序，采用SOAP软件将sRNA定位到基因组上，分析sRNA在基因组上的表达和分布情况；将4个样品中的小RNA片段和已知的miRNA、重复序列、Genbank、Rfam、外显子和内含子、piRNA信息进行比对和注释；采用倍数法筛选在肝癌干细胞系与肝癌细胞系中表达发生变化的sRNA，利用泊松分布计算p-value值，并用Benjamini多重假设检验校正p-value值；共筛选到4个repeat片段在Hep3B和Hep3B-C、Huh7和Huh7-C中均差异表达，37个高表达、9个低表达的piRNA以及18个在Hep3B-C/Hep3B，Huh7-C/Huh7中表达同增同减的miRNA,其中高表达的miRNA有9个，低表达的有9个，具有统计学意义（p-value<0.01，q-value<0.01）。通过生物信息学分析我们得到了很多差异表达的基因，接下来的任务任重而道远。我们需要通过进一步的实验进行验证这些基因在肝癌干细胞与肝癌细胞之间的功能差异，明确肝癌干细胞其独特的标记以及特性，从而最终找到能够特异性靶向肝癌干细胞的制剂，为最终能够彻底治愈肝癌提供基础。
黄玉胜[8]（2012）在《印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中的作用及分子机制研究》文中认为骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是常见的骨的恶性肿瘤，好发于青少年，其发病率占恶性骨肿瘤总数的20%，占儿童肿瘤总数的5%。骨肉瘤恶性程度高，早期即可发生广泛的肺转移，约20%的骨肉瘤患者发生可被影像学方法检测的肺转移，而80%的骨肉瘤患者在单纯手术切除后发生转移。肺转移引起的呼吸衰竭是导致骨肉瘤死亡的常见原因。研究发现许多致病因素如化学因素、放射性物质、病毒感染等均能诱导骨肉瘤的发生。同时在骨肉瘤的发生发展过程中，伴随着一系列的基因和表观遗传学的改变，但这一系列的改变不具有一致性。因而目前的观点认为，骨肉瘤的发生是一个多阶段演进和多基因参与的过程，但确切的发病机制尚未阐明。随着肿瘤病因学研究的深入，发现肿瘤不仅是一种遗传有关的疾病，同时也是一种表遗传性疾病，几乎所有的肿瘤中都有表观遗传的异常。其中印迹基因作为一种表遗传学机制，以原癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生及演进，备受关注。近年来，随着干细胞研究的不断深入以及肿瘤干细胞理论的提出，越来越多的证据显示肿瘤是由其内部的一小部分细胞所始动和维持的，这一小部分细胞被称作肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）。和普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞不仅具有自我更新和多向分化潜能，同时还具有诱导肿瘤形成的能力。自1994年Lapidot在白血病细胞中通过特异性细胞表面标志分离出具有自我更新和维持其恶性能力的急性粒细胞性白血病干细胞以来，研究者们陆续从脑肿瘤、乳腺癌、消化道肿瘤、恶性黑色素瘤、肺癌、前列腺癌等分离得到了肿瘤干细胞。在间叶性肿瘤中，Gibbs等报道在骨肉瘤中存在一小部分具有自我更新能力，并能在无血清悬浮培养条件下形成肿瘤细胞球的细胞，这部分细胞高表达STAT3和多潜能干细胞标记Oct3/4、Nanog，从而显示出干细胞样的特性。该研究将肿瘤干细胞学说扩展到了间叶来源的肿瘤，证实了肉瘤中肿瘤干细胞的存在。随后陆续有多个实验室以不同的方法证实了骨肉瘤肿瘤干细胞的存在。骨肉瘤干细胞为治愈骨肉瘤提供了可能，但也带来了一系列难题，由于骨肉瘤干细胞的放化疗抵抗和高转移特性，使得目前的治疗手段都不能根治肿瘤。寻找可行的治疗手段是目前面临的关键问题。我们课题组在前期研究中发现印迹基因TSSC3（tumor-suppressing STF cDNA3）与骨肉瘤的发生发展及抗失巢凋亡能力有关。TSSC3基因，又名IPL基因（imprinted inplacenta and liver）,定位于染色体11p15的胚胎肿瘤抑制区，属PHLDA基因超家族，呈母系等位基因表达，与TDAG51（T cell death associated gene51）高度同源，并含有与凋亡相关的PQ蛋白基序，推测TSSC3印迹基因在细胞凋亡中发挥作用。我们前期研究发现骨肉瘤细胞系SaOS2中TSSC3基因启动子区CG位点的平均甲基化率高，用去甲基化药物处理该细胞后TSSC3表达明显增高，且细胞凋亡率也显着增加。利用载体稳定高表达TSSC3，发现高表达TSSC3在体外能抑制骨肉瘤细胞增殖，在体内能抑制肿瘤生长，并通过线粒体途径诱导骨肉瘤细胞凋亡和增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。但TSSC3在作为肿瘤起始细胞的肿瘤干细胞中的作用尚待研究。为了研究TSSC3在骨肉瘤干细胞中的作用及可能的分子机制，我们拟首先利用不同方法从MG63、SaOS2和恶性转化的人成骨细胞hFOB1.19（MThFOB1.19）中分离鉴定出肿瘤干细胞，并检测印迹基因TSSC3在干细胞中的表达，然后利用不同载体上调或下调骨肉瘤细胞中TSSC3的表达，最后检测差异表达TSSC3对骨肉瘤干细胞干性和凋亡的影响及其作用机制。有鉴于此，本研究分三部分进行：第一部分拟通过肿瘤干细胞成球培养和基于骨肉瘤干细胞表面标记（CD133、CD117、Stro-1）的流式细胞仪分选方法从MG63、SaOS2和恶性转化的人成骨细胞hFOB1.19（MThFOB1.19）中分离鉴定骨肉瘤干细胞。并根据MThFOB1.19细胞的高克隆形成特性，利用连续克隆形成和成瘤实验从该细胞中分离出肿瘤干细胞，并对其自我更新、多向分化和诱导肿瘤形成的能力进行检测，通过免疫荧光、RT-PCR等技术进一步检测干性相关因子的表达。为后续实验提供细胞模型。第二部分拟采用RT-PCR、western-blot、免疫细胞化学、免疫荧光等实验手段检测不同方法所获得的骨肉瘤干细胞中TSSC3的表达。采用RU486可诱导表达系统稳定上调MThFOB1.19骨肉瘤细胞系中TSSC3的表达，检测高表达TSSC3对骨肉瘤细胞自我更新能力及成瘤能力的影响。以明确TSSC3在肿瘤干细胞干性维持中的作用。第三部分拟采用不同载体稳定上调或下调骨肉瘤细胞中TSSC3的表达，检测凋亡相关印迹基因TSSC3对骨肉瘤干细胞凋亡的调控作用，以及在化疗药物顺铂的作用下，骨肉瘤干细胞凋亡率的变化，并以MThFOB1.19为模型，利用RT-PCR、免疫荧光、western-blot等检测凋亡通路中相关分子的表达变化，以明确TSSC3诱导骨肉瘤干细胞凋亡的可能通路，进而寻找TSSC3诱导骨肉瘤干细胞凋亡的可能机制。主要结果如下：一、成功分离和鉴定出骨肉瘤干细胞1.采用干细胞培养法分离骨肉瘤干细胞，结果显示：①在干细胞培养基中，MG63、SaOS2和MThFOB1.19细胞均能形成肿瘤干细胞球；②MThFOB1.19较MG63和SaOS2细胞具有更高的肿瘤干细胞形成率，分别为：67.09±9.28%，5.40±1.06%和8.60±1.16%；③MThFOB1.19肿瘤干细胞球高表达干性因子Nanog、Oct4和Sox2；说明骨肉瘤干细胞可来源于分化的成骨细胞；2.在MThFOB1.19细胞中：①绝大部分细胞能形成克隆和亚克隆，比例分别为100%和92.7±4.29%，表明该细胞具有很强的自我更新能力；②克隆细胞成瘤能力强，5×104细胞即可诱导肿瘤形成；③具有向脂肪方向分化的能力；④细胞高表达干性因子Nanog、Oct4和Sox2，说明该细胞系中大部分细胞具有肿瘤起始细胞的特点；3.采用干细胞表面标记分选骨肉瘤干细胞，结果显示：在SaOS2细胞中，CD133+、CD117+和Stro-1+细胞比例分别为：0.4%、4.8%和3.3%，说明在该细胞中干性标记阳性的细胞非常少，表明不同细胞系具有不同的肿瘤干细胞比例，与细胞本身特性相关。二、发现印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中低表达，高表达TSSC3降低MThFOB1.19细胞的干性和抑制骨肉瘤生长1.印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中低表达：①在MG63、SaOS2和MThFOB1.19肿瘤干细胞球中，TSSC3在转录水平和翻译水平的表达均较贴壁培养的细胞低；②在SaOS2细胞中，CD133+、CD117+和Stro-1+细胞TSSC3的表达分别较CD133-、CD117-和Stro-1-细胞的表达低，差异具有统计学意义，表明TSSC3基因的低表达可能在维持骨肉瘤肿瘤干细胞特殊功能中起重要作用；2.针对TSSC3，成功构建RU486可诱导表达载体系统。将该系统转染入MThFOB1.19细胞后，在浓度为1μg/ml的米非司酮诱导下，TSSC3的表达在mRNA水平和蛋白水平都明显升高，最终在蛋白水平升高约5倍；3.在MThFOB1.19细胞中，高表达TSSC3降低骨肉瘤干细胞干性和抑制骨肉瘤生长:①高表达TSSC3降低干细胞球形成率，由66.12±9.36%减少到46.82±8.37%；②高表达TSSC3降低细胞的克隆形成率，由95.32±4.58%减少到57.57±2.16%；③高表达TSSC3减少克隆中的细胞数量；④高表达TSSC3在体内抑制骨肉瘤的生长，在第6周的时候，高表达TSSC3克隆来源的肿瘤体积较对照细胞来源的肿瘤体积减少约78.56%；⑤高表达TSSC3降低干性因子Nanog、Oct4和Sox2的表达；Nanog降低最为显着，与对照相比降低了80%，Oct4和Sox2分别降低了20%和40%。三、高表达TSSC3通过线粒体途径增加骨肉瘤干细胞自然凋亡率1.差异表达SaOS2细胞中的TSSC3影响骨肉瘤干细胞比例：①在体外低表达TSSC3增加骨肉瘤干细胞比例，高表达TSSC3降低骨肉瘤干细胞比例；②在体内高表达TSSC3降低骨肉瘤干细胞比例，低表达TSSC3增加骨肉瘤干细胞比例；2.高表达TSSC3通过线粒体途径增加骨肉瘤干细胞的自然凋亡率：①高表达TSSC3增加SaOS2细胞中CD133+、CD117+和Stro-1+细胞的自然凋亡率；②高表达TSSC3增加MThFOB1.19干细胞球中细胞的自然凋亡率；③高表达TSSC3增加MThFOB1.19干细胞球中Caspase3、Bak、Bim、Cytc、Apaf-1、Noxa和Puma的表达，增加Bax：Bcl2的比值，减少Caspase3前体蛋白和Caspase9前体蛋白，Caspase8前体蛋白无明显改变；④高表达TSSC3降低MThFOB1.19干细胞球细胞的线粒体膜电位；3.高表达TSSC3增强化疗药物顺铂对SaOS2细胞中CD133+、CD117+和Stro-1+细胞的凋亡诱导作用。主要的结论如下：1.大部分MThFOB1.19细胞具有肿瘤干细胞特性，表明骨肉瘤干细胞可来源于分化的成骨细胞；在不同骨肉瘤细胞系中，肿瘤干细胞的比例存在差异，与细胞本身特性相关；2.印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中低表达，表明TSSC3基因的低表达可能在维持骨肉瘤肿瘤干细胞特殊功能中起重要作用；高表达TSSC3可降低肿瘤干细胞干性抑制肿瘤生长，提示TSSC3可成为靶向肿瘤干细胞治疗的靶点。3.高表达TSSC3通过线粒体途径增加骨肉瘤干细胞的自然凋亡率，并增加化疗药对骨肉瘤干细胞的杀伤作用，提示可通过激活TSSC3基因的表达而发挥对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用。深入研究TSSC3诱导骨肉瘤干细胞凋亡的机制，可为骨肉瘤的治疗策略提供新的思路；本研究首次报道了骨肉瘤的肿瘤干细胞可来源于分化的成骨细胞，并进一步从印迹基因角度探讨了TSSC3参与骨肉瘤干细胞干性和凋亡调控的可能机制，上述结果表明增加印迹基因TSSC3的表达可降低骨肉瘤肿瘤干细胞的干性和通过线粒体途径诱导骨肉瘤肿瘤干细胞凋亡，为以TSSC3为靶点、寻找更具特异性的靶向骨肉瘤干细胞的治疗策略提供了理论依据。
尹建华[9]（2010）在《清胰化积方对人胰腺癌肝转移的实验研究》文中认为胰腺癌（Pancreatic carcinoma）是消化系统常见的恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势。胰腺癌也是预后最差的恶性肿瘤之一,5年生存率不到5%-胰腺癌肝转移是导致胰腺癌总体疗效差的主要原因,80%的患者在确诊时已发生局部浸润或远处转移,肝转移发生率超过50%。对胰腺癌肝转移目前还缺乏特别有效的药物和治疗方法。晚期胰腺癌放化疗效果欠佳,清胰化积方（QYHJ）以清热化湿为组方原则,运用中西医综合治疗模式在晚期胰腺癌患者中取得了一定的疗效。胰腺癌相关转移因子在其癌周组织含量比较丰富,对此进行的研究也是胰腺癌治疗的一个重要方向。目的观察清胰化积方（QYHJ）对人胰腺癌肝转移的干预效应；对相关转移因子的表达变化进行检测从而探究QYHJ在胰腺癌肝转移治疗中的可能作用机理。方法第一部分采用人胰腺癌高肝转移细胞株SW1990HM,通过脾脏注射法,建立人胰腺癌SW1990HM肝转移裸鼠动物模型,将实验分为4组：生理盐水组（NS）.QYHJ大、中、小三个剂量组（QYHJ-H、QYHJ-M、QYHJ-S）进行干预。以体重变化、小鼠肝转移发生数及肝转移克隆数和肝转移灶体积为观察指标,观察QYHJ干预后对生存质量的影响及对肝转移的抑制作用；评价QYHJ对肝转移的干预作用是否具有剂量递增效应。第二部分清胰化积方（QYHJ）干预人胰腺癌肝转移的机制研究,主要从以下方面进行：1. RT-PCR检测：将各组小鼠肝转移灶部分肿瘤新鲜组织,在液氮中研成细末,Total RNA抽提后,进行RT-PCR半定量检测,观察各组中MMPs、VEGF、cyr61、TGF-β1、bFGF等转移相关因子的rnRNA水平上的表达变化；2.免疫组化检测：根据RT-PCR的检测结果,对mRNA水平表达有显着差异的相关因子在组织水平进行免疫组化检测,从阳性细胞表达数观察肿瘤组织中相关因子QYHJ干预后的变化及从阳性区域光密度面积判断相关因子在肿瘤细胞中的表达变化。3.探究各因子的表达变化与肝转移灶增殖生长之间的相关性,并进一步作回归分析判断与肝转移灶增殖生长有直接相关的转移因子。4. western blot检测：取各组小鼠肝转移灶部分肿瘤组织,总蛋白提取后进行western blot检测,观察与肝转移灶增殖生长的相关因子表达变化,进一步从分子水平验证免疫组化的分析结果,明确QYHJ抑制胰腺癌肝转移的作用靶点。5. ELISA对各组血液中的CEA及CA19-9进行检测,观察QYHJ干预后的变化。6.流式细胞术检测QYHJ干预后各组的细胞周期变化及凋亡变化。结果第一部分1.QYHJ各用药组在第6周观察结束时的裸鼠体重高于生理盐水组（NS）体重（P<0.05）,其中尤以QYHJ高剂量（QYHJ-H）组更显着（P<0.01）。2.QYHJ大、中、小剂量各组肝转移发生率分别为57.1%（8/14）、42.8%（6/14）、60%（9/15）、NS组为73.3%（11/15）；与NS比较,QYHJ大、中、小剂量组的肝转移发生抑制率分别为22.1%、41.6%、18.1%。3.与NS组相比,QYHJ大、中、小剂量组均显着减少肝转移克隆个数（P<0.01）；而QYHJ各组之间则无显着差异（P>0.05）。4.与NS组相比,QYHJ各组均可抑制肝转移灶的增殖生长（P<0.05）,大中小剂量组抑制率分别为45.5%、45.6%、24.6%。QYHJ各组之间比较,大中剂量组的抑制率比小剂量组强（P<0.05）；大中剂量之间无差异（P>0.05）。第二部分1.与NS组比较,QYHJ干预后,大、中、小剂量组的肝转移灶肿瘤组织中bFGF的mRNA表达分别升高21.8%、47.1%、39.2%（P<0.05）,QYHJ大、中小剂量组之间无明显差异（P>0.05）;CTGF mRNA表达在大剂量组中下调9.61%、中、小剂量组分别升高11.5%、9.63%（VS NS, P>0.05）; MMP-1的mRNA表达分别升高28.3%、12.2%、19.6%,（VS NS, P>0.05）; MMP-7的mRNA表达上调,分别为18.2%、12.9%、1.3%（VS NS, P>0.05）。MMP-9的mRNA表达变化分别下调7.4%、13.8%、11.2%（VSNS, P>0.05）。2.与NS组比较,QYHJ干预后,大、中、小剂量组的肝转移灶肿瘤组织中cyr61的mRNA表达下调（P<0.05）,分别为57.9%、69.5%、29.5%；MMP-2的mRNA表达下调（VS NS,P<0.05）,分别为42.1%、28.1%、62.3%；TGF-β1的mRNA表达下调（VS NS,P<0.05）,分别为78.6%、69.9%、33.1%；VEGF的mRNA表达下调（VS NS,P<0.05）,分别为78.9%、64.9%、43.8%。3.各组肝转移灶肿瘤组织可见细胞浆染色成棕褐色,细胞基质间也可见棕褐染色。4.NS组、QYHJ大、中、小剂量组cyr61阳性细胞表达分别为39±1021±3、23±4、32±6,QYHJ各组的cyr61阳性细胞表达下降（VS NS,P<0.05）:MMP-2阳性细胞表达分别为38±11、28±5、24±4、29±3,QYHJ各组的MMP-2阳性细胞表达下降（VS NS,P<0.05）；bFGF阳性细胞表达分别为45±8、65±5、64±9、56±6,QYHJ各组的bFGF阳性细胞表达增多（VS NS,P<0.05）；TGF-β1阳性细胞表达分别为47±10、31±4、29±3、36±6,QYHJ各组的TGF-β1阳性细胞表达下降（VS NS,P<0.05）；VEGF阳性细胞表达分别为42±7、32±4、29±5、32±5,QYHJ各组的VEGF阳性细胞表达下降（P<0.05）。5.NS组、QYHJ大、中、小剂量组cyr61阳性区域光密度分别为508.82±6.69、319.92±2.96、323.46±4.12、435.29±4.83；VEGF阳性区域光密度分别为447.6±7.54、337.3±5.44、317.8±5.28、360.6±5.42；TGF-β1阳性区域光密度分别为748.66±10.12、435.23±4.77、418.17±5.26、658.41±6.33；bFGF阳性区域光密度分别为661.24±8.13、685.74±5.32、721.56±5.38、771.41±6.24；MMP-2阳性区域光密度分别为538.42±6.47、312.84±4.47、445.75±5.73、239.43±4.32：6.相关性分析表明cyr61、MMP-2.VEGF、TGF-β1、bFGF的阳性表达与肝转移灶增殖生长的相关性均为正相关,分别为0.677、0.355、0.540、0.402、0.6577.回归分析结果提示,VEGF、bFGF、cvr61与转移灶体积增殖有依存关系,回归方程：y＾=-0.954+0.026χ1+0.023χ2+0.027χ38.western blot检测,从蛋白质分子水平进一步验证了mRNA水平和组织学水平的结果。QYHJ各组的VEGF、TGF-β1、cyr61、MMP-2表达均明显低于NS组（P<0.05）,而bFGF的表达比NS组高（P<0.05）。9.ELISA检测发现QYHJ-H、QYHJ-M、QYHJ-S各组的血液标本中的CEA浓度均值分别为12.51±2.53ng/ml、13.67±2.72ng/ml、15.83±3.16ng/ml,QYHJ组明显低于NS组的23.26±4.62ng/ml（P<0.05）；NS、QYHJ-H、QYHJ-M、QYHJ-S各组肝转移小鼠的血清CA19-9平均值分别是423.72±45.43 U/ml、318.26±42.13 U/ml、355.47±44.29 U/ml、362.37±45.08 U/ml,QYHJ组明显低于NS组（P<0.05）。10.流式细胞术（FCM）结果：NS组胰腺癌肝转移灶增殖指数为30.72%,QYHJ大、中、小剂量各组的细胞增殖指数分别为19.28%、21.14%及24.63%均小于生理盐水组（P<0.05）。细胞周期各时相比较发现,各中药组的G0/G,期细胞均显着高于NS对照组（P<0.05）,而QYHJ各组的G2/M期细胞比例低于生理盐水对照组（P<0.05）。QYHJ大、中、小各组的凋亡率比NS组要高,分别为15.29%、15.42%、11.89%,NS组凋亡率为7.47%,有显着性差异（P<0.05）。结论第一部分1.QYHJ能够减少肝转移克隆灶的形成,未见剂量递增效应。2.QYHJ抑制肝转移克隆灶的增殖生长,大、中剂量优于小剂量,大剂量与中剂量之间无明显差异。3.QYHJ可以改善实验动物的生存质量,大剂量优于中、小剂量,中剂量和小剂量之间无差异。4.QYHJ对人胰腺癌SW1990HM肝转移具有一定的抑制作用。第二部分1.QYHJ干预后可下调VEGF、MMP-2、cyr61、TGF-β1的mRNA表达水平；下调肿瘤组织中癌细胞对cyr61、VEGF、MMP-2、TGF-β1的蛋白水平表达；抑制癌组织中cyr61、VEGF、MMP-2、TGF-β1（?）日性细胞的产生2.QYHJ干预后在下调VEGF、cyr61、TGF-β1、MMP-2等相关转移因子的同时,上调转移相关因子bFGF的mRNA和蛋白表达水平,表明QYHJ对胰腺癌肝转移的抑制作用是一个复杂的综合效应。3.QYHJ干预胰腺癌肝转移灶生长起最终作用的靶点可能为VEGF、bFGF、cyr61。4.QYHJ能够下调胰腺癌细胞株SW1990HM分泌VEGF、cyr61、TGF-p、,MMP-2等相关因子表达,从而抑制胰腺癌肝转移灶的增殖。5.QYHJ干预后,能够减少血液中CA19-9和CEA的含量,表明QYHJ对胰腺癌肝转移起一定的抑制作用。6.QYHJ能促进胰腺癌肝转移灶肿瘤细胞的凋亡,一定程度上诱导细胞周期阻滞,从而达到抑制肿瘤细胞的生长和增殖。
娄楠[10]（2010）在《人成骨肉瘤细胞系中高侵袭及类肿瘤干细胞亚系的建立》文中研究说明本研究以体外培养的人成骨肉瘤细胞系—MG63细胞为对象,应用有限稀释法进行单细胞分离和单克隆细胞株的培养,成功建立MG63骨肉瘤单克隆细胞株20余个。根据细胞形成的克隆形态,选取其中的完全克隆进行ALP、OCN、OPN等一系列成骨分化标志物基因表达的检测,同时检测各组细胞生物学行为指标,包括肿瘤细胞成瘤、侵袭、迁移、铺展粘附等,发现具有高低不同转移能力和成瘤能力的单克隆细胞株之间在部分成骨细胞标志物、肿瘤转移及促血管形成因子等基因表达具有显着差异。说明检测骨肉瘤细胞成骨分化标志物的基因表达差异可以判断肿瘤的分化程度。进一步通过RT-PCR、RealTime-PCR及Western blot等方法对它们的侵袭能力进行检测,发现高低不同转移能力的细胞株的Cofilin、Limk1基因及蛋白表达存在显着差异,说明Cofilin介导的信号通路在人成骨肉瘤细胞的侵袭、转移等行为中发挥极为重要的作用。最后本实验选取集落形成能力最强的Holoclone细胞株,利用无血清悬浮成球的方式分离出类肿瘤干细胞亚系---MG63-M,并在无血清培养环境中加入低浓度长春新碱,进一步富集、纯化。经RT-PCR、免疫荧光及流式细胞术等检测发现其表达CD133、Oct4、nestin等干细胞表面标志物,同时高表达Mdr1、ABCG2等多药耐药基因。另外,体外实验和动物实验都表明MG63-M不但具有与正常干细胞相似的自我更新和多项分化能力,同时具有极强的致瘤能力和极为显着的多药耐药性。本实验进一步验证了骨肉瘤异质性学说和肿瘤干细胞学说,为早期判断骨肉瘤侵袭及转移能力,克服骨肉瘤的多药耐药提供了新的理论基础和实验依据。
二、人骨肉瘤细胞系OS-732CAM移植瘤中VEGF、bFGF的表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人骨肉瘤细胞系OS-732CAM移植瘤中VEGF、bFGF的表达及意义（论文提纲范文）
（1）CircFAT1吸附miR-375从而增加骨肉瘤细胞中YAP1蛋白表达机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 环状RNA FAT1 在骨肉瘤中的表达及功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 mi R-375与circ FAT1 的结合模式及在骨肉瘤中的表达和功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 YAP1是mi R-375 在骨肉瘤中的靶点 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 体内实验验证circ FAT1 在骨肉瘤中吸附mi R-375 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五部分 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤及环状 RNA 研究现状 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）长链非编码RNA CCAT2以及miR-200b/VEGF在骨肉瘤中调控作用的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词/符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 参考文献 |
| 第二章 沉默CCAT2能够抑制骨肉瘤细胞系的生长并促进细胞凋亡 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂和耗材 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 CCAT2沉默 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞增殖检测 |
| 2.2.8 细胞迁移能力测定 |
| 2.2.9 细胞侵袭能力测定 |
| 2.2.10 细胞凋亡检测 |
| 2.2.11 qRT-PCR测定CCAT2和miR-200b |
| 2.2.12 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CCAT2在骨肉瘤组织及细胞中高表达 |
| 2.3.2 miR-200b在骨肉瘤组织及细胞中低表达 |
| 2.3.3 CCAT2沉默抑制细胞活力 |
| 2.3.4 CCAT2沉默抑制细胞增殖 |
| 2.3.5 CCAT2沉默促进细胞凋亡 |
| 2.3.6 CCAT2沉默抑制细胞迁移和侵袭 |
| 2.4 实验讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 CCAT2沉默通过介导miR-200b/VEGF表达抑制骨肉瘤细胞生长、迁移和侵袭 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂及耗材 |
| 3.2.4 骨肉瘤细胞系的培养 |
| 3.2.5 细胞转染 |
| 3.2.6 DNA构建和荧光素酶报告基因检测 |
| 3.2.7 细胞增殖检测 |
| 3.2.8 细胞迁移能力测定 |
| 3.2.9 细胞侵袭能力测定 |
| 3.2.10 细胞凋亡检测 |
| 3.2.11 qRT-PCR测定miR-200b表达 |
| 3.2.12 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.2.13 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CCAT2的沉默提高miR-200b的表达水平 |
| 3.3.2 CCAT2沉默通过提高miR-200b的表达阻碍骨肉瘤细胞增殖,促进凋亡 |
| 3.3.3 CCAT2沉默通过提高miR-200b的表达阻碍骨肉瘤细胞迁移和侵袭 |
| 3.3.4 VEGF是miR-200b在骨肉瘤细胞系中的靶基因 |
| 3.4 实验讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 CCAT2沉默通过上调miR-200b抑制PI3K/AKT和AMPK信号通路 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂和耗材 |
| 4.2.4 MG63和U20S细胞培养、复苏、传代及冻存 |
| 4.2.5 MG63和U20S细胞转染 |
| 4.2.6 蛋白免疫印迹分析 |
| 4.2.7 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 沉默CCAT2通过上调miR-200b抑制PI3K/AKT信号通路 |
| 4.3.2 沉默CCAT2通过上调miR-200b抑制AMPK信号通路 |
| 4.4 实验讨论 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: 骨肉瘤的治疗与研究进展 |
| 1.骨肉瘤的研究现状 |
| 2.长链非编码 RNA |
| 3.微小 RNAs |
| 4.血管内皮生长因子 |
| 5.播脂酜肌醉 3-激味（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K) /蛋白质激酶 B (protein-serine-threonine kinase, AKT) 和朦音播酸激活蛋白激酶 (Adenosine monophosphate-activated protein kinase)通路 |
| 结论及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 英文文章1(己发表）：Long non-coding RNA CCAT2 acts as an oncogene in osteosarcoma through regulation of miR，200b/VEGF |
| 英文文章2(待发表）：Progress in the treatment and research of osteosarcoma |
| 1. Research status of osteosarcoma |
| 2. Long non-coding RNAs (IncRNAs) |
| 3. MicroRNAs (miRNAs) |
| 4. vascular endothelial growth factor |
| VEGF |
| 5. (phosphatidylinositol-3-kinases, PI3K) / (protein-serine-threonine kinase, AKT)and (Adenosine monophosphate-activated protein kinase) |
| References |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）EP1受体调控前列腺素E2诱导的骨肉瘤生长机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 EP1 在人骨肉瘤细胞中的表达水平以及EP1 激动剂、抑制剂、PGE2 对人骨肉瘤细胞增殖的作用 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EP1 受体激动剂、抑制剂、PGE2对MG63 细胞凋亡的影响以及阻断EP1受体、沉默EP1 受体对17-PT-PGE2 诱导的MG63 细胞增殖及凋亡的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 EP1受体抑制剂对MG63荷瘤裸鼠的抑瘤作用以及凋亡相关蛋白的影响 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 6.讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤的治疗进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）阿魏酸影响骨肉瘤细胞系的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 阿魏酸促进骨肉瘤细胞的凋亡 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 阿魏酸抑制骨肉瘤细胞的血管化 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤的治疗研究现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录: 攻读博士学位期间发表论文 |
（5）Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 针对骨肉瘤MG63细胞系的SURVIVIN-SIRNA转染细胞株的制备及体外验证研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料及步骤 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及步骤 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞中整合素A5表达水平的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及步骤 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 靶向治疗整合素A5对骨肉瘤MG63细胞侵袭力、迁移力的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料及步骤 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 SURVIVIN-SIRNA对骨肉瘤MG63细胞体内实验的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料及步骤 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录 |
| 附件 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 成果 |
| 致谢 |
（6）特异性抗体介导的蜂毒肽对骨肉瘤的抑制作用（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 骨肉瘤的现行治疗策略与最新疗法 |
| 1.1 现行治疗策略 |
| 1.2 新兴疗法及新的治疗靶点 |
| 1.3 未来展望 |
| 第2章 通过临床前试验项目对骨肉瘤靶向治疗的回顾 |
| 2.1 在骨肉瘤试验组中具有抗肿瘤活性的药物 |
| 2.2 靶向治疗骨肉瘤的渐进式探索 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 重组蛋白表达载体的构建 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 重组融合蛋白表达及鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 重组抗体对人骨肉瘤细胞 OS732 的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 重组抗体对骨肉瘤模型的治疗作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）肝癌干细胞新型培养体系的建立以及治疗靶点筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 人肝癌干细胞样细胞的新型培养基的筛选及肿瘤细胞系的建立 |
| 一、实验器材 |
| 二、实验方法及步骤 |
| 三、结果与分析 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 肝癌干细胞样细胞的深度测序以及生物信息学分析 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究方法 |
| 三、数据结果与分析 |
| 七、讨论 |
| 参考文献 |
| 综述一肿瘤干细胞及肝癌干细胞研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 An overview of mechanisms responsible for tumor dormancy |
| References |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（8）印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中的作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词一览表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 骨肉瘤细胞株中肿瘤干细胞的分离与鉴定 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 印迹基因 TSSC3 降低骨肉瘤干细胞干性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 印迹基因 TSSC3 诱导骨肉瘤干细胞凋亡及其分子机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述一 骨肉瘤干细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 靶向诱导肿瘤干细胞凋亡研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表和投稿的论文 |
| 英文论着 TSSC3 overexpression inhibits osteosarcoma tumorigenesis through reducing stemness and inducing apoptosis of tumor initiating cells |
（9）清胰化积方对人胰腺癌肝转移的实验研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分:清胰化积方干预人胰腺癌SW1990肝转移的动物实验 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 第二部分:清胰化积方干预人胰腺癌SW1990肝转移的机理研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 感谢 |
（10）人成骨肉瘤细胞系中高侵袭及类肿瘤干细胞亚系的建立（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 肿瘤转移 |
| 1.1.1 肿瘤细胞的运动形式 |
| 1.1.2 癌细胞运动的分子调控机制 |
| 1.1.3 Cofilin 蛋白与肿瘤转移 |
| 1.1.4 骨肉瘤转移 |
| 1.1.5 肿瘤转移体外研究存在的问题与展望 |
| 1.1.6 骨肉瘤与成骨分化标志物 |
| 1.1.7 VEGF 与肿瘤转移 |
| 1.2 肿瘤异质性理论 |
| 1.2.1 肿瘤细胞克隆形态与肿瘤异质性学说 |
| 1.3 肿瘤干细胞理论 |
| 1.3.1 肿瘤干细胞细胞表型 |
| 1.3.2 肿瘤干细胞与肿瘤侵袭转移 |
| 1.3.3 骨肉瘤肿瘤干细胞研究进展 |
| 第2章 人成骨肉瘤细胞系MG63“HOLOCLONE”样单克隆的分离及其成骨分化程度的鉴定 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 生物学特性鉴定 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 高低不同转移特性骨肉瘤单克隆细胞亚系的分离与鉴定 |
| 前言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 应用低浓度长春新碱分离并鉴定MG63 单克隆细胞株中的类骨肉瘤干细胞 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验动物 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
四、人骨肉瘤细胞系OS-732CAM移植瘤中VEGF、bFGF的表达及意义（论文参考文献）
- [1]CircFAT1吸附miR-375从而增加骨肉瘤细胞中YAP1蛋白表达机制研究[D]. 刘刚. 浙江大学, 2020(01)
- [2]长链非编码RNA CCAT2以及miR-200b/VEGF在骨肉瘤中调控作用的机制研究[D]. 刘峻滔. 山东大学, 2019(02)
- [3]EP1受体调控前列腺素E2诱导的骨肉瘤生长机制研究[D]. 牛敬才. 苏州大学, 2019(06)
- [4]阿魏酸影响骨肉瘤细胞系的实验研究[D]. 张旭东. 华中科技大学, 2017(10)
- [5]Survivin通过调节整合素α5抑制骨肉瘤侵袭生长的体外及体内实验研究[D]. 流小舟. 南方医科大学, 2016(04)
- [6]特异性抗体介导的蜂毒肽对骨肉瘤的抑制作用[D]. 费丹. 吉林大学, 2014(09)
- [7]肝癌干细胞新型培养体系的建立以及治疗靶点筛选[D]. 黎江. 第二军医大学, 2012(09)
- [8]印迹基因TSSC3在骨肉瘤干细胞中的作用及分子机制研究[D]. 黄玉胜. 第三军医大学, 2012(11)
- [9]清胰化积方对人胰腺癌肝转移的实验研究[D]. 尹建华. 复旦大学, 2010(01)
- [10]人成骨肉瘤细胞系中高侵袭及类肿瘤干细胞亚系的建立[D]. 娄楠. 吉林大学, 2010(08)